Alle procedurer er godkendt af LSUHSC Institutional Animal Care og brug Udvalg og blev udført i overensstemmelse med NIH "Principper for laboratoriedyr pleje." 1. gnaver Akklimatisering og fødevarer Begrænsning Brug voksne Wistar-rotter, der er 3 måneder gammel ved begyndelsen af forsøget. House rotter enkeltvis i bure udstyret med en laminar strømning enhed og luftfilteret i en temperatur- og fugtreguleret, AAALAC-akkrediteret plejefaciliteten på en omvendt 12-timers lys / mørke-cyklus (lys slukket fra 0600 timer). Giv vand og standard gnaverfoder frit indtil kroppens vægt er ca. 380-400 g. Efterfølgende fødevare- begrænse rotter og holdes ved 85 til 90% af deres frie-fodring kropsvægt i løbet af de eksperimentelle sessioner at lette anskaffelse og vedligeholdelse af respons på methamfetamin. Håndter gnavere i hjemmet bur værelse dagligt fra ankomst i hele den eksperimentellesessioner i for at registrere kropsvægt og justere fordelingen daglige mad. Når target vægte opnås, forberede sig på at kirurgisk implantere hver rotte med en kronisk indlagt jugular kateter og intrakranielle stimulerende elektroder. 2. halsvenen kateterisation Kateter Forberedelse Der fremstilles en længde silastic-rør 13 cm med en indvendig diameter på 0,012 x 0,025 ", skaber en silikone bold 4 cm fra den ene ende af røret ved hjælp af ekstra silikoneslange og elektrokauterisation, og lad det lufttørre. Dyp den anden ende af slangen i en limonen-baseret opløsningsmiddel afledt af citrus i et par minutter og tillade at ekspandere. Forbind den ekspanderede slange til en rustfri stål ledekanyle bøjet i en ret vinkel. Forankre bøjede bunden af rustfrit stål guide kanyle til en 1 "firkant af biokompatible mesh hjælp dental acrylcement. Skyl kateteret inde og ud med ethanol og destilleret water. Injicer luft gennem slangen for at fjerne resterende væskedråber. Lad det tørre O / N. Steril teknik Udfør alle operationer i en dedikeret dyr kirurgisk suite hjælp aseptiske kirurgiske teknikker. Sterilisere instrumenter og implantater under anvendelse af en autoklave og forberede et sterilt område ved at placere vandfast papir på eller bord dækket med en steril håndklæde (s). Bær sterile handsker og holde alle instrumenter, implantater og kirurgisk gaze på det sterile område under proceduren. Tør hvert instrument med en spritserviet, efterfulgt af 20 sek i en perle sterilisator mellem procedurer, når flere operationer udføres ned. Anæstesi Forbehandle rotter med atropin (sulfat) (0,04 mg / kg, sq) efterfulgt af pentobarbital (20 – 50 mg / kg, ip) for at opnå anæstesi. Injicere dyr med steril penicillin G procaine suspension (75.000 enheder, im) og en smertestillende middel (carprofen, 5 – 10 mg / kg, sc eller kedoprofen, 2 – 5 mg / kg, sc) umiddelbart før kirurgi for at formindske perioperative infektioner og smerter, henholdsvis. Check for tilstrækkelig anæstesi ved at levere en moderat tå knivspids til dyret, og hvis intet svar opstår, derefter fortsætte. Anvend øjensalve til begge øjne. Kirurgisk site Forberedelse Barbere et 2 x 2 cm dorsal plaster på rottens ryg lige posteriort for en linje, der forbinder skulderbladene. Barbere en 1 x 1 cm ventral plaster i den rigtige halsområde mellem kæbeknoglen og brystbenet. Tør barberede områder med alkoholservietter efterfulgt af betadine løsning. Placer rotte på en steril håndklæde og lad betadin tørre, før du fortsætter. Kateter Implantation Lave et snit parallelt med en linje, der forbinder skulderbladene i midscapular region på bagsiden ved hjælp af en 10-kniv. Brug en hæmostat at adskille huden fra det underliggende bindevæv at skabe et plan formesh kateter base. Skyl området med sterilt saltvand og dækkes med steril gaze før dreje rotte på ryggen. Et diagonalt snit mellem højre kæbeknoglen og brystbenet anvendelse af en 10-kniv. Brug en hæmostat at adskille huden fra det underliggende bindevæv at lokalisere halsvenen. Bemærk: Den halsvene vises hvid / sølv og skinnende og er større hos hanrotter end hos kvinder. Placer en spatel under vene, binde en 4-0 silke sutur forsigtigt omkring toppen (proksimale del) af den eksponerede vene og skub vene tilbage i nakken. Adskil bindevævet til at skabe en overfladisk lomme under inferolateral halsskindet men over musklen. Skub en steriliseret trocar fra halsen snit til midscapular indsnit ved tunneling tilbage bag armen og opad. Kør kateteret fra bagsiden til halsen ved at indsætte en stiv ledetråd op gennem trokaren fra halsen ende og ind i den distale kateter. Trækguidewire tilbage gennem til halsen incision og vedlagte distale kateter vil følge. Isoler højre halsvene over en spatel ved at trække op på den tidligere placeret proksimalt sutur. Brug en bold saks til at lave en lille delvis bortskæring på oversiden af venen. Indsæt en buet pincet ind i venen snit til at åbne den op. Holde tangen fra hinanden, men i stedet, passerer kateterspidsen mellem tangen tip og ind i venen omkring 2 – 3 cm, hvor det vil afsluttes uden for højre atrium. Fastgør kateteret ved at binde en 4-0 silkesutur omkring distale vene. Bind de proximale og distale suturer sammen i en "kasse" knude for at tilføje ekstra stabilitet. Skyl kateter med hepariniseret sterilt saltvand og trække tilbage blod til at bekræfte vellykket implantation. Trim suturerne 1 – 2 mm over knuderne og guf den resterende proksimale kateter under nakken huden. lukke med en passende sutur / metode du vælger. Hvis ikke-absorsandsynligt, suturer eller hæfteklammer bruges, skal de fjernes i 10-14 dage under generel anæstesi. Dæk indsnittet med antibiotisk salve anvendelse af en steril vatpind. Forankre den distale kateter / vejledning kanyle / mesh forsamling til det subkutane tilbage væv ved hjælp af absorberbare suturer på to af de modstående hjørner af mesh base. Luk bagsiden snit omkring vejledning kanyle hjælp afbrudt, ikke-inverteret absorberbare suturer. Dæk indsnittet med antibiotisk salve anvendelse af en steril vatpind. Postoperativ pleje Skyl kateter med hepariniseret 0,9% sterilt saltvand under anvendelse af en 3 ml sprøjte og placere en obturator i ledekanylen at forhindre tilstopning. Skyl hver rotte s kateter på daglig basis for at opretholde åbenheden. Umiddelbart efter proceduren placere rotte i sit hjem bur over en varmepude i den kirurgiske suite og observere, indtil bevidstheden og spontan bevægelse tilbage. Retur den genvundne rotte til kolonien rum og tillade fem til syv dage til at gå, før intrakraniel operation. Afvejes, håndtere og vurdere deres generelle tilstand dagligt, herunder kontrol for infektion og evaluere dyrs adfærd, udseende og aktivitetsniveau. Konsultere Animal Resources dyrlæge, hvis der opstår problemer, og følg eventuelle anbefalede behandlingsregimer. Injicere dyr med et analgetisk middel (carprofen, 5 – 10 mg / kg, sc eller ketoprofen, 2 – 5 mg / kg, sc) til behandling af smerter perioperative efter behov. 3. Intrakraniel Placering af elektroder Kirurgisk Forberedelse Udfør alle operationer under sterile betingelser som beskrevet i afsnit 2.2. Anæstesi Placer dyr i en anæstesi induktion kammeret og tilvejebringe isoflurance gasstrøm ind i kammeret ved 1.000 – 2.000 ml / min med forstøveren på 5%. Når dyret er liggende, fjernes fra kammer etnd sted i næse kegle på polstret stereotaktisk operativsystem platform. Skift gasstrømmen fra kammeret til næsekeglen og køre gas med fordamper til 2 – 3%. Juster vaporizer efter behov for at opretholde stabile respirations og ingen respons på stimulering under kirurgi. Injicere rotter med sterilt penicillin G procain suspension (75.000 enheder, im) og et analgetisk middel (buprenorphin 0,05 til 0,5 mg / kg sc) umiddelbart før kirurgi for at formindske perioperative infektioner og smerter, henholdsvis. Check for tilstrækkelig anæstesi ved at levere en moderat tå knivspids til dyret, og hvis intet svar opstår, derefter fortsætte. Anvend øjensalve til begge øjne. Kirurgisk site Forberedelse Barbere toppen af rottens hoved og placere rotten i øre barer at holde sit hoved immobile under proceduren. Tør barberede område med alkoholservietter efterfulgt af betadinopløsning. Lad betadin tørre, før du fortsætter. Elektrodeimplantation Tag fat i hovedbunden mellem og lidt anterior til ørerne med pincet og bruge saks til at klippe på tværs af basen. Denne manuveur vil fjerne en 1,5 x 1 cm hudområde over midten af kraniet. Brug et 10-bladet til at lave en periferisk snit gennem pericranium ned til kraniet og en buet pincet til at skrabe og fjern pericranium. Skyl området med sterilt saltvand, ising overskydende blod og saltvand med gaze, og lade kraniet tørre helt så de knoklet vartegn, herunder bregma, kan tydeligt ses. For bilateral operation, montere to bipolære platin-iridium elektroder, en i hver elektrode holder på hver side af stereotaktisk drift platform. Flyt første elektrode i position ~ 1 mm over bregma og nedskrive stereotaktiske koordinater for anterior-posterior (AP) og mediale-laterale (ML) positioner, som vil blive vist på det digitale display. Faktisk ikke røre elektrodespidsen til skull fordi elektroden ikke længere vil fungere. Gentag denne procedure for den anden elektrode. Beregn den endelige AP og ML koordinater baseret på målet struktur af interesse. Flyt elektroden til denne position med spidsen lige over kraniet for at opnå den oprindelige dorsoventral (DV) koordinerer på det digitale display. Beregn den endelige DV dybde baseret på målet struktur af interesse. Bemærk: nucleus accumbens Shell blev rettet i dette eksempel givet sin kendte involvering i lægemiddel-consummatory adfærd 8 ved hjælp af følgende stereotaktisk koordinater i forhold til bregma: AP post koordinere = [Digital vises koordinere på bregma] + 1.6 ML post koordinat = [Digitalt vises koordinat på bregma] ± 2,4 til højre / venstre DV dybde = [Digital vises koordinere på kraniet overflade hos AP / ML post] – 8,5 Markere forventede post positionen af hver elektrode på overfladen af kraniet med en permanent marker. Undgå at støde eller røre elektrodens spids i løbet af denne manøvre. Brug en rund bold diamant belagt grat at bore et 1,4 mm hul ved hvert mærke. Pas på ikke at styrte gennem kraniet ind i det intrakranielle hvælving med høj hastighed boremaskine. Brug en buet pincet til at punktere dura når kraniet er boret væk. Brug en rund bold diamant belagt grat at bore 0,7 mm huller i yderligere fire steder bag elektrode poster for placering af kraniet skruer. Brug en manuel skruetrækker til at placere fire 0,8 (diameter) x 3,2 (længde) mm skruer i rustfrit stål ind i kraniet, to på hver side af midterlinjen. Tæt sikre disse skruer op til omkring halvdelen af deres længde ind i kraniet, fordi de er den store infrastruktur, der vil holde kranie hætte på plads i de kommende uger og måneder. Sæt forsigtigt den første elektrode gennem sin burrhole ind i hjernen på den beregnede DV dybde ved manuelt at dreje knappen, der styrer Z-koordinatelektrodeholderen. Dreje knappen med en hastighed stort set svarer til 1/2 omdrejning i sekundet for at undgå unødig skade på spidsen af elektroden. Sørg elektrodespidsen ikke rører den benede kant burrhole, når ind i hjernen. Fastgør første elektrode ved hjælp af superlim overtrukket over burrhole og de posteriore skruer, efterfulgt af dentalcement. Når denne konstruktion er tørret helt, fjernes elektroden ud af holderen. Gentag indføring og cementering fremgangsmåde til anden elektrode. Anvend dentalcement helt op til huden kant, men ikke overlapper med huden, fordi det løsner craniale cement cap lang sigt. Postoperativ pleje Placer to støvhætter over elektrode piedestaler for at forhindre tilstopning. Umiddelbart efter proceduren placere rotte i sit hjem bur over en varmepude i den kirurgiske suite og observere, indtil bevidstheden og spontan bevægelse tilbage. Retur den genvundne rotte til the koloni værelse og lade fem dage til at gå, før du starter eksperimentet. Afvejes, håndtag, og vurdere rotterne generelle tilstand dagligt, herunder kontrol for infektion og evaluere dyrs adfærd, udseende og aktivitetsniveau. Konsultere Animal Resources dyrlæge, hvis der opstår problemer, og følg eventuelle anbefalede behandlingsregimer. Injicere dyr med et analgetisk middel (buprenorphin 0,05 til 1 mg / kg sc) til behandling af smerter perioperative efter behov. Intrakraniel blødning kan være mere fremherskende med anvendelsen af ikke-steroide smertestillende medicin (carprofen, 5 – 10 mg / kg, sc eller ketoprofen, 2 – 5 mg / kg, sc) så brug buprenorphin perioperativt for intrakraniel kirurgi. 4. Operant Apparatur Brug plast og rustfrit stål operant conditioning kamre indeholdt i lyd-formildende kabinetter til at køre de adfærdsmæssige eksperimenter. Udstyre hver kabinet med en udstødning fan til at levere ventilation og hvid noiSE at maskere udefra kommende lyde. Brug en personlig computer og en adfærdsmæssig software interface system til at programmere de procedurer og indsamle de eksperimentelle data. Generelt Set-Up Udstyre hver forsøgsgruppe kammer med to håndtag respons monteret på en væg af kammeret med en stimulus lys placeret over hvert håndtag. Udpeg en af håndtagene den "aktive" løftestang, så det resulterer i en programmeret konsekvens, når der trykkes. Programmere en stimulus lys placeret direkte over den aktive respons løftestang til at belyse i løbet af hver operant session, hvilket indikerer tilgængeligheden af lægemidlet. Har en reaktion på den aktive løftestang resultat i en infusion levering af metamfetamin (0,05 mg / kg / infusion i 100 pi 0,9% NaCl) i løbet af 2,8 sek ledsaget af huset lys på den modsatte væg stået på i 5 sek og stimulus lys går OFF for en 30-sek timeout. Tæl svar på den aktive arm, men de bør ikke have planlagt konsekvenser under 30 sek timeout periode. Byggetid, bør optage svarene på den inaktive håndtag, men de har ingen planlagte konsekvenser. 5. intravenøs (IV) Metamfetamin selvadministration Procedure Generelle Forberedelser Load rotter ind i operantkamre så hurtigt og roligt som muligt for at minimere adfærdsmæssige artefakter. Vedhæft en rustfri stålfjeder snor til vejledningen kanyle på gnaver ryg og en lækage-bevis væske drejelig ophængt over operant kammer. Sikre integriteten af forbindelsen slangen fra drejeleddet til 20 ml sprøjte lægemiddel i en motordrevet pumpe placeret uden for lyddæmpende kabinet. For at gøre dette, skubbe plast tilslutning slange mindst ¼ af en tomme på metallet drejelig spids og narkotika sprøjte nålespidsen, indtil det ikke vil glide med moderat trækker. Counter-afbalancere svirvel og snor forsamling til at tillade relativt uhæmmet movement af dyret. Gennemføre operant sessioner på omtrent samme tidspunkt hver dag mandag til fredag. Erhvervelse For at lette hurtig overtagelse af IV metamfetamin selvadministration, køre rotter på daglige 6-timers sessioner for fire til fem dage i træk. Føre disse sessioner på et fast forhold FR-1 + 30 sek tidsplan for reinforcementduring hvor rotter får en infusion af IV metamfetamin for hvert tryk på den aktive arm efterfulgt af en 30 sek timeout (fx ingen cue eller belønne konsekvenser forekomme med at trykke på enten håndtaget). Bemærk: Denne indledende langvarig og "let" access vil resultere i de fleste gnavere erhverver betydelig doping adfærd i mindre end eller lig med en uge (figur 3). Opretholdelse I den anden uge af uddannelse, til at køre rotter på daglige 2-timers sessioner mandag til fredag fastholde og forfine IV methamphetamine selvadministration. Conduct sessioner på et fast forhold mellem FR-1 + 30 sek timeout tidsplan for forstærkning. Dokument stabilt, intens reagere, når det samlede antal metamfetamin præsentationer på tværs af hver session varierer mindre end 10% for tre på hinanden følgende sessioner (figur 4) og den kumulative antal infusioner over den første 30-min er større end det samlede antal af infusioner under andet 30-min (figur 5). Bemærk: Dette kriterium sikrer, at rotterne udvikle et lægemiddel-loading mønster i begyndelsen af sessionen, der angiver vanedannende adfærd 19 og ikke blot afslappet brug. Post-Session Ved afslutningen af hver session, afbryde snor fra gnaver ryg. Skyl kateteret med 0,1 ml 0,9% saltopløsning indeholdende 800 IU streptokinase at forebygge blodpropper. Indsæt et obturator i hver guide kanyle for at forhindre tilstopning før han vendte tilbage rATS til hjemmet bure. Test åbenheden af katetre umiddelbart efter afslutningen af hver eksperimentel session på onsdage hele forløbet af forsøget. Forbered en 3 cc sprøjte med en 22 G nål, som indeholder hepariniseret bakteriostatisk saltvand for at teste kateter åbenheden. Sæt den ene ende af en 4 til 6 tommer langt stykke plastrør til nålen og den anden ende til metallet stillingen af katetret-kanyleenheden på dyrets ryg. Indgyde 0,1 til 0,2 ml saltvand at sikre en klar flow og derefter trække sprøjtestemplet tilbage. Hvis katetret patent, det skal både flush let og trække sig tilbage blod, vil være synlige i slangen. Slip stemplet og tilføre yderligere 0,2 ml at skylle alle blodet tilbage gennem kateteret. Hvis blodet ikke kan trækkes tilbage, og fjern derefter 3 cc sprøjten og slangen fra metal indlæg. Forbered en 1 ml sprøjte med en 22 G nål, som indeholder methohexital natrium, et hurtigt virkendebedøvelsesmiddel, til yderligere test kateter åbenheden. Sæt den ene ende af en 4 til 6 tommer langt stykke plastrør til nålen og den anden ende til metallet stillingen af katetret-kanyleenheden på dyrets ryg. Indgyde 1,5 mg og hurtigt fjerne 1 cc sprøjte og slangen fra metallet post på dyrets ryg. Tilslut 3 cc sprøjte fyldt med hepariniseret bakteriostatisk saltvand og indgyde 0,1 – 0,2 ml. Hvis dyret mister muskeltonus inden for 3 sek, derefter kateteret er patentet og funktionelle. Se supplerende File "almindelige faldgruber" for en faldgruber afsnit, der omhandler bivirkninger ved metamfetamin, manglende erhvervelse metamfetamin selvadministration, og rotte udvinding vanskeligheder. 6. Apparat hjernestimulation Brug 10 til 12 plexi-glas kasser (12 x 18 x 18 in) (BxHxD) at køre DBS eksperimenter. Dæk hver kasse på ydersiden med stiv uigennemsigtigpapir, der dækker bagsiden og siderne af boksen for at forhindre rotterne i at se eller interagere med hinanden. Lad klare frontpanel afdækket, så eksaminator kan se dyrene i løbet af stimulation sessioner. Dække toppen af kasser med en semipermeabel panel, der forhindrer rotterne i at undslippe, samtidig med at luftstrømmen. Brug dette panel til at støtte de kommutatorer, der er placeret over hver boks for at lette den elektriske forbindelse mellem gnaver hoved hætte og stimulering systemet. Brug en stimulering, der kan levere en konstant strøm til flere samtidige dyr for DBS eksperimenter. Brug et system, der består af en bruger programmerbar digital signalprocessor / kommunikation interface, en stimulator, en stimulator batteri, en kanal splitter boks, og den medfølgende software (se Materialer Sheet). Brug custom-længde kabler til at forbinde stimulator s kanal porte til den overlegne elektroniske piedestal af hver commutateller. Bemærk: Længden behov vil afhænge af den enkelte laboratorium. Disse kabler er uden for dyret området og behøver ikke at blive dækket i rustfri fjeder. Slut ringere elektroniske piedestal af kommutatoren til den implanterede elektrode piedestal på gnaver hoved cap hjælp 16 kabler dækket med rustfri fjeder. Sørg for, at kablerne er lange nok til, at den frie bevægelighed for alle områder af kabinettet uden væsentlig spænding på hovedet hætten. Bemærk: Et kabel, der slutter nogenlunde hvor lederen af rotten ville være, når stående på alle fire fødder er normalt tilstrækkelig. Brain Stimulation Programmering Brug en personlig computer og programmeringssoftware til at programmere stimuleringsparametre (f.eks bølgeform, frekvens, puls bredde, inter-stimulus forsinkelse, aktuelle amplitude) og indsamle de eksperimentelle data. Ved hjælp af et visuelt programmeringssprog, angive, hvilke funktioner hver enhed vil udføre for at opfylde de erfamentale endpoints og hvilke data vil blive opbevaret og / eller projekterede til visning i realtid. Kommandoerne, der kører dette projekt er demonstreret i figur 1. Angive den ønskede frekvens, impulsbredde og amplitude i det synlige kontrolpanel (figur 2) forud for starten af forsøget. Typiske parametre for højfrekvent stimulering i rotter svarer til dem, der anvendes i klinisk human deep brain stimulation: frekvens på 130 til 180 Hz, pulsbredde på 60 til 90 ms, og den aktuelle amplitude på 100 til 250 uA 4,8-10. Bemærk: En lavere strøm anvendes i gnavere på grund af dets reducerede størrelse i forhold til primat. 7. Deep Brain Stimulation Procedure For at indlæse rotter i kasserne, fastgøre rustfri stålfjeder kabel fra kommutatoren til hver elektrode piedestal på hovedet hætten. Test impedans hver elektrode ved at køre 5 uA af strøm ved en frekvenspå 1.000 Hz til 2 sek. Hvis impedansen er lig med eller mindre end 125 kOhm derefter fortsætte med forsøget, fordi elektroden er i stand til at levere terapeutisk stimulering. Hvis impedansen er større end 125 kOhm overveje at fjerne dyret fra eksperimentet, fordi elektrodens høj modstand kan trunkere strøm til potentielt sub-terapeutiske niveauer. Kør rotterne gennem en eller to mock sessioner for tilvænning, hvor de vil blive knyttet til elektroden kablet (r), men ikke modtager nogen aktiv behandling. Mock test vil fjerne eventuelle ikke-specifikke adfærdsmæssige effekter. Umiddelbart efter hver mock session, transportere rotterne til operant kasser for den daglige 2-timers session IV metamfetamin selvadministration. Counter-balance rotter i to grupper, en aktiv-stimulation og humbug-stimulation kohorte, så baseline narkotika indtag ikke er signifikant forskellig mellem grupperne. Udfør daglig DBS-sessions på gnaver kohorten i 5 dage, hvor de modtager enten aktiv elektrisk hjernestimulation eller ingen stimulation til 3 timer afhængigt af deres gruppeopgave. Umiddelbart efter hver DBS-session, transport rotter til de operant kasser for den daglige 2-timers session IV metamfetamin selvadministration. Overhold dyrene omhyggeligt under mindst en del af hver DBS-session for at sikre, at stimulation er ikke forårsager klare ændringer i dyrs adfærd. Hvis der opstår unormale adfærd under / efter stimulering, sørge for at dokumentere disse observationer. Bemærk: Forfatterne har ikke bemærket betydelige adfærdsændringer eller ændringer i mad / vand indtag under forsøget beskrevet i denne artikel. Ret længden af DBS behandling, de elektriske parametre, og tiden mellem DBS session og operant session efter behov afhængigt af hypotesen.