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Biology

重复采血车在成年斑马鱼验血

doi: 10.3791/53272 Published: August 30, 2015

Abstract

重复采血是实验室动物进行的最普遍的技术之一。但是,还没有建立一个非致命性协议的采血从斑马鱼。以前的方法采血从斑马鱼是致命的,如外侧切口,斩首和尾巴切除。因此,我们已经开发了一种新的“重复”的血液采集方法,以及在座的详细协议,概述了此过程。这种方法是微创并导致非常低死亡率(2.3%),用于斑马鱼,从而使来自同一个体的重复采血。血液取样的最大体积是依赖于体重的鱼。间隔重复采集血样的体积应每周体重或≤1%,每2周,这是由血液中的血红蛋白的测定评价≤0.4%。此外,血红蛋白,空腹血糖,血浆甘油三酯(TG)和总碳在男性和女性的成年斑马鱼holesterol水平进行了测量。我们也应用这个方法来研究糖代谢饮食诱导的肥胖的失调。这种血液采集方法将允许许多应用,包括葡萄糖和脂质代谢和血液学研究,这将增加使用斑马鱼作为人类疾病模型有机体。

Introduction

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斑马鱼正日益普及人类疾病的一种有价值的模式,因为他们的器官和遗传学类似于人类1,2。在发育生物学的领域中,许多研究已经证明,斑马鱼和人显示标记相似造血3,止血4,5,和髓6。成年斑马鱼也用于研究免疫学7,神经变性8和肥胖相关疾病9,因为此模式生物股与破坏在人类疾病共同通路。肥胖和肥胖相关疾病(糖尿病,脂肪肝和酒精性脂肪性肝炎和动脉粥样硬化),斑马鱼血糖和血脂水平已经在几个转基因和饮食诱导的肥胖模型10月13日被彻底调查。

从单个动物反复采血会减少动物的使用和DECrease个体差异。然而,重复的样品采集是因为它们具有相对小的血容量和缺乏方便船舶在小动物,如斑马鱼在技术上困难。已经开发了几种方法用于从斑马鱼一次性采血,虽然这些方法有其自身的缺陷,包括致命性,相关的组织损伤和有限的血容量。例如,1-5微升血液可以从约0.3厘米的横向切口,在背主动脉5的区域收获长度。斩首用剪刀通过肩带切割可收集5-10微升血液10。另一种方便的采血方法是尾切除14。心脏穿刺是用于从相同的鱼重复采血一个潜在的替代方法,但非常小的量,得到(约50 NL)与此过程限制的分析,可以是perfor的数量配有11。因此,新的协议需要启用反复的非致命的血液采样,这将是一个重要的进步所必需的这种微生物是一个标准的模式生物的人类疾病。这种技术将允许用于测试药理反应,发现分子生物标记物的诊断,确定预后,以及各种疾病,如代谢疾病,退行性疾病和多种类型的恶性肿瘤的监测。

因此,我们开发了获得血液从斑马鱼连续15微创方法。在这里,我们演示程序可视化,并提供该技术的详细协议。使用这种方法,基于各种参数,包括血红蛋白,空腹血糖,并在健康成年斑马鱼的血脂正常值进行了评价。此外,我们还评估了此方法是否适用于需要通过米系列样本的研究期间过度喂食实验onitoring中血糖水平的瞬时变化。

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Protocol

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所有动物的程序是由三重大学伦理委员会批准,并与国际准则根据日本动物福利法规“法对福利和动物管理”(日本国环境)进行,并遵守。

1.准备了针

注:在麻醉状态下进行所有的实验,并尽一切努力,尽量减少痛苦。安乐死,鱼浸入冰 - 水浴(5份冰/ 1份水在≤4℃)≥20分钟。

  1. 通过抽1.0毫米外直径的玻璃毛细管用针拔出器图1A)制备玻璃微毛细管针。
  2. 切斜用细剪刀( 图1B)针的提示。提供了理想尖端直径应该大约100 - 200微米图1C)。如果尖地径r是太窄,血液不会进入针。
  3. 溶解肝素生理盐水至5毫克/毫升的浓度。
  4. 放置一个预切针在吸气管组件的鼻甲端和保持吸嘴在口中,或将针连接到灯泡分配器。浸入针尖到肝素溶液,并通过抽吸并通过溶液1D和1E)吹heparinize针头。
    注意:吸气管组件已经用于斑马鱼精子冷冻保存16。长的橡胶管可以阻止任何血液飞入嘴。设置一个过滤器在所述管的中途可避免危险。
  5. 存储在一个10厘米的培养皿中,然后风干的肝素化的针至少1小时。甲大量的针可以提前准备。

2.麻醉

  1. 通过将200个ml的鱼水与100微升2-苯氧乙醇制备的塑料小情况下,麻醉剂溶液(2-PE)。麻醉剂的终浓度为500ppm。
    注意! 2-PE具有快速的效果。
  2. 除去鱼(AB株)从循环系统期望数量。
  3. 用网鱼转移到麻醉剂1 - 2分钟( 图1F)。观察鱼慢慢游,水平传播的胸鳍,一声惊呼,具有快速的鳃盖运动在1分钟内。
  4. 随着时间的推移,观察鱼躺在外壳的底部,并最终停止游泳。当鱼停下来喘气和鳃盖动作缓慢麻醉的手术平面达到。在这一点上,鱼准备采血。
  5. 使用撇渣器从2-PE抬起麻醉鱼并轻轻将其放置在纸巾浸渍于该麻醉药1G)。盖鱼的头部软组织文中还浸泡2-PE的解决方案,以防止眼睛干涩和使用另一种柔软的干纸巾轻轻擦干体表。

3.采血

  1. 发生在吸气管组件(或灯泡分配器)的管口端的肝素针和保持吸气管组件在嘴里的喉舌结束。
  2. 把握鼻甲端和针一起,并小心地用针尖移除干扰鳞。将针头在30 - 45°角插入采血部位。避免胃肠道( 图1H)穿刺。在使用灯泡分配器的,按用拇指和中指的灯泡,并阻断孔在与第一手指的灯泡的端部,再插入针如上​​所述。
    注意:站点采血是沿着主体轴线和后向中的背主动脉的区域中的肛门。背主动脉(DA)和所述后部主静脉(PCV)只是腹侧脊柱( 图2)。
  3. 开始吸衔嘴吸引管组件的端部时的针毡接触脊柱。如果血液不涨,用手移动针尖巧妙地鼓励血流。需要注意的是,一旦血液上升到针,立即停止摇动吸轻轻地( 图1I)。在使用灯泡分配器的,释放灯泡的压力以吸入血液。
  4. 观察血液会慢慢上升到针以脉动方式不经抽吸,这是动脉血压,因为可能的。因此,就没有必要吸如果针正确地穿透动脉。
  5. 停止抽吸采集的血液相应的卷后。从鱼取出针,用柔软的纸巾停止任何出血按下穿刺部位。 20秒的指压1J) -在大约10观察出血停止。
  6. 后出血停止后,立即将鱼放回转移到CLE在温水(〜28℃)坦克。帮助鱼儿轻轻纷飞水对鱼鳃,直到它开始游泳恢复。
    注意:保持高达5 postsampling鱼在2升罐和罐连接到循环系统充氧的鱼。除抗生素鱼水是没有必要的。保持正常的住房和喂鱼。
  7. 排出血液从针放在一张封口膜( 图1K)的洁净区。
  8. 使用任何商业手持式血糖仪( 图1L)测量血糖。
    注意:血糖仪使用葡萄糖脱氢酶黄素腺嘌呤二核苷酸电极,并且需要的0.6微升的样品体积。
    1. 插入试纸完全进入计和直接接触血滴。自动观察血液抽取到测试条,将获得的血糖结果5秒上的显示区域。记录结果并丢弃测试条。用一个新的测试条为每个测量。
  9. (可选步骤)采取准确量的血液由吸液和血液转移到微离心管,用于进一步的分析(血红蛋白,甘油三酯(TG),总胆固醇 )。如果需要的话,稀释的全血从一个钓鱼用盐水。离心血液样品3分钟,在680×g离心在RT和收获血浆。转移等离子体进新管中。在这一点上,它准备在生化分析中使用。

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Representative Results

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该采血方法导致最少伤害的斑马鱼(A <1毫米穿刺; 图1J),并产生一个非常低的死亡率为2.3%。我们研究了血液,可以从一个单一的鱼进行收集和评估的关系,它的体重图3)的最大容积。我们发现,收集到的最大的血容量呈线性体重(R = 0.813)相关。的血液从个体鱼(体重=1.071克)收集到的最大体积为25微升,并最小体积是从鱼体重0.115克1.3微升。这表明,血液收集的最大体积取决于体重斑马鱼。

采血表1)后进行血红蛋白,血糖,甘油三酯和总胆固醇的生化分析。男性和女性健康的成年斑马鱼(4-6个月)禁食血液collecti前18小时上。生化分析显示血红蛋白的正常值(雄性9.91±0.49克/分升和阴10.02±0.48克/分升)和TG(男性417±45毫克/分升和阴404±35毫克/分升)没有显著不同两组之间。然而,空腹血糖和阳组的总胆固醇水平(44±3毫克/分升和365±18毫克/分升,分别)为显著降低 (P <0.05)比女性组(69±3毫克/分升和511±52毫克/分升,分别地)。

而最小的创伤使用本发明方法使得能够重复血液采样来自同一个体的斑马鱼,反复抽血的影响还没有被评估。我们调查了这些影响使用血液中血红蛋白的水平( 图4)测量。正如我们已经表明在以前的出版物15,成年雄性鱼重约0.5g上述被分为四组。反复采血同一个体的鱼每天7天一次(总共七个血液样品)(每次2微升)导致血红蛋白水平显著降低(P <0.01)从10.82±0.78克/分升,以2.38±0.8克/ DL。除去2微升血液,每2天或单个集合的每周5微升也取得了在血红蛋白水平一显著降低(P <0.05)。另外,一个单一的集合2微升血样的一周后,血红蛋白水平略低于正常(从8.11±1.15克/分升,以7.15±1.17克/分升)。的血红蛋白水平有一个单一的集合2或5微升血液样本进行2周的恢复期后没有影响。因此,我们的结论是,重复2微升的血液(体重0.4%),每周或2-5微升(体重0.4-1%),每2个星期鱼个体集合能避免失血性贫血。

我们进一步应用这个方法GLUC的研究OSE新陈代谢。在每个单独的血糖水平的正常饮食组(每日一次喂养)和超喂组(每日五次喂养)中的变化进行监测,在5周的时间。正常饮食喂养的斑马鱼(鱼A,B,C),显示出稳定的血糖水平,所有的时间,而吃得太多斑马鱼(鱼D,E,F)早在第1周经历过高的血糖水平,并维持这种高血糖状态在整个5周的研究期间图5)。

图1
图1:程序采血车从成年斑马鱼(A)玻璃针用针拉马准备。 (B)的切割倾斜用细剪刀的针的尖端。 (C)上形成预切针具有大约135微米的尖端直径。比例尺= 1毫米。 (D)血型采集设备:吸气管总成(左)和灯泡分配器(右)。箭头指示的物镜转换器,以保持微细针。箭头示出了吸气管组件的吸嘴。针被定位在样品收集之前,喷嘴的端部。 ( 五)Heparinizing针。 (F)的麻醉鱼。 (G)将鱼在纸巾浸渍于该麻醉剂。 (H)将针头在30-45°角进采血部位。 ( 一)不断上升的血液进针。 (J)的出血停止和一个<650微米的穿刺中环绕并在高倍率所示。 (K)治宜血液从针放在一张封口膜。 (L),使用血糖仪血糖的测量。

图2
(A)的示意图的白线表示穿刺部位采血,它是沿着主体轴线和后向肛门在背侧的区域主动脉。 (B)中的主要容器是背主动脉和后主静脉;这些位于腹侧脊柱。 S,脊柱; DA,背主动脉; PCV,后主静脉。

图3
图3:血液取样和体重最大体积的关系共有83斑马鱼(2-6个月大,42男,41女)进行了最大采血。

图4
图4:变化中的血红蛋白水平在1周的时间内反复采血 A 2血液微升样品从同一个体的鱼每天在2天,每周一次或5微升收集一次,每周一次(N = 5)。示各组的血红蛋白水平采血之前(第0天,白条)和反复血液取样后(第7天,灰色条)。值是平均值±平均值(SEM)的标准误差。 * P <0.05,** P <0.01,相对于从文献改编0天。15。

图5
图5:在5个星期内变化六个人雄鱼的空腹血糖浓度鱼A,B和C均在正常饮食组。鱼D,E和F组的吃得太多组。

表1
表1:血红蛋白,血糖,甘油三酯和总胆固醇水平的男性和女斑马鱼的4 - 6月龄的。

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Discussion

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我们在座的详细协议,用于连续获得血液从成年斑马鱼。这种方法是简单的进行,我们使用它在实验室,每天。此采血方法是基于插入玻璃毛细管针进入斑马鱼的背主动脉。在此过程中,关键是要小心不烧蚀脊柱,因为它是标准用于搜索背主动脉。降低颈椎损伤会提高患者的生存率。虽然这种技术是简单,易于掌握,有可以保证高的成功率和存活率的最佳做法。一个熟练的研究员将需要1-2分钟进行采血过程(协议2.3到3.6,这是鱼离开水的时间)。为了节省时间,在大规模的实验,双人包夹的办法,建议进行采血。例如,一个研究人员可以进行血液采样,而第二可处理的鱼,执行麻醉并分析所收集的血液(测量血糖,记录,或移动到血液的离心管等等)。

使用这种方法,我们证明了,可以从鱼个体收集的最大血液样品体积是体重约2%,无论性别15的,表明斑马鱼的总循环血液量是体重大于2%。以往的研究表明,硬骨鱼( 硬骨鱼纲属和虹鳟gairdneri)拥有总血量的体重17,18 1.8-3.8%不等,因此我们预测斑马鱼的总循环血量成为2-3.8%体重在斑马鱼。对于单个采血,我们强烈建议采血应该从3个月或>0.3克体重斑马鱼以获得≥5微升血液。它不是eworthy即使体重他们的血液2%已被删除,大约一半斑马鱼的成活这表明,斑马鱼可能会失血妥善应付。

这种方法的最显著优点是,它使来自同一个体的重复采血。我们通过测量血红蛋白水平的变化图4)中确定的最佳量和采血的频率。我们建议的数量和时间间隔反复采血是每周体重≤0.4%以及每2周体重≤1%,以避免失血性贫血和出血性死亡。这一结论与反复血液啮齿类动物模型19,20取样的实践指南是一致的。

如果实验允许斑马鱼的牺牲,针可以插入到沿着主体轴线的位置时,后向鳃中的背主动脉的区域作为一个troubleshooting或另一种方法。这个网站是靠近心脏与主动脉是比较大的,它可以使血液采集过程更容易。

斑马鱼已经成功地用于在造型代谢综合征,包括糖尿病21,22,23,24肥胖,脂肪肝疾病25和动脉粥样硬化26的相互关联的条件。我们进一步应用这个技术观察在饮食诱导肥胖的葡萄糖代谢图5)。类似的哺乳动物,斑马鱼也异常发达糖脂代谢,当喂食高脂肪的饮食。在空腹每个单独的血糖变化显示,在响应于过量进料类似于在人类15,27的个体差异。这一结果表明,在个别鱼血液生化指标的瞬时变化的调查将提供一个很好的机会,以确定代谢紊乱苏个体差异CH作为肥胖和2型糖尿病,从而进一步证实其作为动物模型对于人类疾病的值。

总体而言,我们开发出一种新方法,从成年斑马鱼反复采血。这种方法对于斑马鱼研究所需要的重复血液样品,如毒代动力学,药物动力学,和血液学研究必不可少的。此外,这种反复的血液采样方法也可应用到其他小观赏鱼在生物医学研究,例如,青鳉( 青鳉 )或剑尾剑尾鱼 )。

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Glass capillaries with filament Narishige GD-1 1.0 mm outer diameter.
Needle puller Narishige PC-10 To produce the needles
Heparin Wako Pure Chemical Industries 081-00136 For heparinization
Aspirator tube assembly Drummond 2-040-000 For blood collection
Bulb dispenser Drummond 1-000-9000 For blood collection
2-phenoxyethanol Wako Pure Chemical Industries 163-12075 For anesthetizing the fish
DRI-CHEM3500V Fujifilm - For hemoglobin measurement
DRI-CHEM Slides Fujifilm Hb-WII For hemoglobin measurement
Glutest Neo Super Sanwa Kagaku Kenkyusho - For bood glucose measurement
Wako L-type TG kit Wako Pure Chemical Industries 464-44201 For TG measurement
Wako L-type CHO kit Wako Pure Chemical Industries 460-44301 For total cholesterol measurement
Parafilm M Alcan Packaging PM996 To expel the blood on

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References

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Zang, L., Shimada, Y., Nishimura, Y., Tanaka, T., Nishimura, N. Repeated Blood Collection for Blood Tests in Adult Zebrafish. J. Vis. Exp. (102), e53272, doi:10.3791/53272 (2015).More

Zang, L., Shimada, Y., Nishimura, Y., Tanaka, T., Nishimura, N. Repeated Blood Collection for Blood Tests in Adult Zebrafish. J. Vis. Exp. (102), e53272, doi:10.3791/53272 (2015).

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