Abstract
반복 채혈은 실험 동물에서 수행하는 가장 일반적인 방법 중 하나입니다. 그러나, 제브라 피쉬에서 채혈을위한 비 살상 프로토콜은 확립되어 있지 않다. 제브라 피쉬에서 혈액 수집에 대한 이전의 방법은 횡 절개, 잘린 꼬리 절제로, 치명적입니다. 따라서 우리는 여기에서이 절차를 요약 한 상세한 프로토콜을 소설 "반복"혈액 수집 방법을 개발하고, 존재했다. 이 방법은 침습적이고 따라서 동일인으로부터 반복 채혈이 가능 제브라위한 매우 낮은 사망률 (2.3 %)을 초래한다. 혈액 샘플링의 최대 볼륨은 물고기의 체중에 따라 달라집니다. 간격으로 반복 혈액 샘플링의 볼륨은 혈액의 헤모글로빈의 측정에 의해 평가 하였다 체중 매주 또는 ≤1 % 2 주마다의 ≤0.4 %이어야한다. 또한, 혈색소, 공복 혈당, 혈장 중성 지방 (TG), 총 C남성 및 여성 성인 holesterol 지브라 피쉬의 수준을 측정 하였다. 우리는 또한 다이어트 유발 된 비만에서 포도당 대사의 조절 곤란을 조사하기 위해이 방법을 적용했다. 이러한 혈액 수집 방법은 글루코스 및 지질 대사 및 인간의 질환 모델 생물로서 지브라 피쉬의 사용을 증가시킬 것이다 혈액 학적 연구를 포함하는 많은 애플리케이션을 허용 할 것이다.
Introduction
이들 장기 및 인간 유전학 1,2- 마찬가지이기 때문에 지브라 피쉬는 인간 질병의 유용한 모델로 증가 인기를 얻고있다. 발생 생물학의 분야에서 많은 연구는 제브라 피쉬와 인간의 쇼가 조혈 3, 지혈 4,5, 및 myelopoiesis 6 유사성을 표시 것을 증명하고있다. 성인 제브라 피쉬는이 모델 생물을 공유하기 때문에 인간의 질병에 혼란 그와 공통 경로를 면역 학적 7, 신경 퇴행성 8과 비만 관련 질병 (9)을 연구하는 데 사용됩니다. 비만 및 비만 관련 질환 (당뇨병, 간 지방증 및 비 알코올성 지방 간염 및 동맥 경화증), 제브라 피쉬 들어 혈당 및 지질 수준을 충분히 여러 형질 전환 및식이 유도 비만 모델 10-13에서 연구되었다.
개별 동물의 반복 채혈 동물 사용 및 12월을 줄일 수interindividual 차이를 rease. 그러나, 반복 된 시료 채취 때문에 상대적으로 작은 혈액량 쉽게 접근 용기의 부족 등 제브라 작은 동물에서 기술적으로 곤란하다. 이들 방법은 치사 포함 자신 단점을 가지고 있지만 제브라에서 일회성 채혈을위한 여러 방법이, 관련된 조직 손상 및 제한된 혈액량을 개발되어왔다. 예를 들어, 1-5 ㎕의 혈액 등쪽 대동맥 (5)의 영역의 길이는 약 0.3 cm의 횡 절개에서 수확 될 수있다. 팔 이음 뼈를 절단하여 가위로 잘린 5-10 μL 혈액 (10)를 수집 할 수 있습니다. 또 다른 편리한 혈액 샘플링 방법은 꼬리 어블 14이다. 심장 천자 동일한 물고기 반복 채혈을위한 하나의 잠재적 인 대안 방법이지만, 매우 소량이 절차 (약 50 NL)를 수득 할 수있다 perfor 분석의 수를 제한11 클럽 메드. 따라서, 새로운 프로토콜이 유기체는 인간의 질병을위한 표준 모델 생물하기 위해서는 중요한 미리 필요하다 반복적 치명적 혈액 샘플링을 가능하게하는데 필요하다. 이 기술은 약물 반응, 분자 진단용 바이오 마커, 예후 판정 발견과 같은 대사성 질환, 퇴행성 질환 및 악성 종양 등의 다양한 여러 종류의 질환의 모니터링을 테스트 할 수있다.
따라서 우리는 제브라 피쉬 직렬 15에서 혈액을 얻기위한 최소 침습적 방법을 개발했다. 여기에서 우리는 시각적으로 절차를 설명하고이 기술에 대한 자세한 프로토콜을 제공합니다. 이 방법을 사용하여, 다양한 파라미터를 포함 헤모글로빈, 공복 혈당 및 건강한 성인 지브라 피쉬의 혈중 지질에 기초하여 정상 값을 평가 하였다. 또한, 우리는 또한이 방법은 M에 의해 일련의 샘플을 필요로 연구에 적합한 지 여부를 평가과식 실험시의 혈당 변화를 시간적 onitoring.
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Protocol
모든 동물의 절차는 미에 대학의 윤리위원회의 승인을하고, 국제 가이드 라인에 일본의 동물 복지 규제 '복지와 동물의 관리에 관한 법률'(일본의 환경부)에 따라 수행하고 준수 하였다.
니들 1. 준비
주 : 모든 실험은 마취 하에서 수행하고, 모든 노력이 고통을 최소화 하였다. 안락사, 생선 ≥20 분간 (≤4 ℃에서 5 부 얼음 / 물 1 부)에 빙수 욕에 침지 하였다.
- 바늘 풀러 (도 1a)과 1.0 mm의 외경 유리 모세관 당기는 유리 마이크로 모세관 바늘을 준비한다.
- 비스듬하게 잘 가위 (그림 1B)를 사용하여 바늘의 끝을 잘라. 200 μm의 (그림 1C) - 이상적인 팁 직경은 약 100이어야합니다. 팁 diamete 경우R은 너무 좁고, 혈액 바늘을 입력하지 않습니다.
- 5 ㎎ / ㎖의 농도로 염수에 헤파린을 녹인다.
- 흡인기 튜브 어셈블리의 코 받침 이요 끝에서 미리 절단 바늘을 놓고 입에 마우스 피스를 보유, 또는 전구 지급기에 바늘을 연결합니다. 헤파린 용액에 바늘 끝을 담그고, 흡입에 의해 솔루션 (그림 1D와 1E)을 통해 불고 바늘을 heparinize.
주 : 흡인기 튜브 조립체는 제브라 피쉬 정자 동결 보존 (16)에 사용되어왔다. 긴 고무 튜브 입으로 비행하는 모든 혈액을 중지 할 수 있습니다. 관의 중간에 필터 설정 위험을 피할 수있다. - 적어도 1 시간 동안 10 cm 페트리 접시와 공기 건조에 헤파린 주사 바늘을 저장합니다. 바늘의 다수의 미리 제조 될 수있다.
2. 마취
- (2- 페녹시 에탄올 100 ㎕ 물고기 200 ml의 물을 혼합하여 2 작은 플라스틱 케이스 마취 용액을 제조-PE). 마취제의 최종 농도는 500 ppm으로합니다.
주의! 2-PE는 빠른 효과가있다. - 순환 시스템에서 물고기 (AB 변형)의 원하는 번호를 제거합니다.
- 2 분 (그림 1 층) - 1 마취제로 물고기를 전송하기 위해 인터넷을 사용합니다. 1 분 이내에 신속하게 아가미의 움직임을 점차, 수영, 수평 헐떡 거림을 가슴 지느러미를 확산하고,이 물고기를 관찰한다.
- 시간이 지남에 따라, 물고기가 케이스의 바닥에 누워 관찰하고 마지막으로 수영을 중지합니다. 물고기가 말하다을 중지하고 아가미의 움직임이 느린 경우 마취의 수술 비행기에 도달합니다. 이 시점에서, 물고기는 혈액 수집을위한 준비가되어 있습니다.
- 스키머가 부드럽게 2-PE에서 마취 물고기를 들어 올려 사용하면 마취제 (그림 1G)에 적신 종이 타월에 놓습니다. 눈의 건조를 방지하고 부드럽게하는 또 다른 부드러운 마른 티슈 페이퍼를 사용할 수있는 2-PE 용액으로 적신 부드러운 티슈와 물고기의 머리를 커버신체 표면을 건조.
3. 혈액 수집
- 흡인기 튜브 어셈블리 (또는 전구 디스펜서)의 코 부분의 끝에서 헤파린 바늘을 놓고 입에 흡인기 튜브 어셈블리의 마우스 피스 끝을 잡고.
- 코 부분의 끝과 함께 바늘을 잡고 조심스럽게 바늘 끝과 간섭 스케일을 제거합니다. 혈액 수집 사이트에 45 ° 각도 - 30 바늘을 삽입합니다. 위장관 (그림 1H)의 구멍을 피하십시오. 상술 한 바와 같이 전구 디스펜서를 사용하는 경우, 엄지 손가락과 가운데 손가락으로 전구를 눌러 먼저 손가락으로 전구의 끝 부분에 구멍을 차단 한 후 바늘을 삽입합니다.
참고 : 혈액 수집이 사이트는 지느러미 대동맥의 영역에서 항문에 몸 축과 후방을 따라입니다. 지느러미 대동맥 (DA) 및 후방 추기경 정맥 (PCV)은 척추에 복부 단지 (그림 2)입니다. - 빨아 시작바늘이 척추를 만지고 느낄 때 흡입 튜브 어셈블리의 끝을 마우스 피스. 피가 상승하지 않는 경우, 혈액의 흐름을 촉진하기 위해 손으로 미묘 바늘 끝을 이동합니다. 혈액이 바늘로 상승되면, 즉시 흔들어 중지하고 부드럽게 (그림 1I)을 빨아합니다. 전구 디스펜서를 사용하는 경우, 혈액을 흡인하는 전구의 압력을 해제.
- 혈액 천천히 때문에 동맥 혈압 가능성 흡입없이 맥동 방식으로 바늘로 상승 할 것이다 관찰한다. 따라서 바늘이 제대로 동맥을 관통하면 흡인 할 필요가 없다.
- 혈액의 적절한 볼륨이 수집 한 후 흡입을 중지합니다. 물고기에서 바늘을 제거하고 출혈을 멈추게하기 위해 부드러운 티슈를 사용하여 천자 사이트를 누릅니다. 손가락 압력의 20 초 (그림 1J) - 약 10 후 지혈을 준수하십시오.
- 출혈이 정지 된 후, 즉시 CLE로 다시 전송 물고기따뜻한 물 (~ 28 ° C) 탱크. 이 수영을 시작할 때까지 부드럽게 아가미쪽으로 물을 소용돌이로 복구 할 수있는 물고기를 도와주세요.
참고 : 2 L 탱크에 5 postsampling 물고기까지 유지하고 물고기를 산소를하기 위해 순환 시스템에 탱크를 연결합니다. 물고기 물에 항생제를 첨가 할 필요가 없습니다. 일반 주택과 공급에 물고기를 유지한다. - 파라 필름의 조각 (그림 1K)의 깨끗한 영역에 바늘에서 피를 추방.
- 상업적 휴대용 혈당 측정기 (도 1L)를 사용하여 혈당을 측정한다.
주 : 혈당 측정기는 글루코스 탈수소 효소 플라 빈 아데닌 디 뉴클레오티드 전극을 사용하고, 0.6 μL의 샘플 량을 필요로한다.- 미터에 완전히 테스트 스트립을 삽입하고 직접 혈액 방울을 터치합니다. 자동으로 테스트 스트립에 혈액 무승부를 관찰하고 표시 영역에 혈당 결과 5 초를 얻을 수 있습니다. 결과를 기록하고 테스트 스트립을 폐기합니다. 사용각 측정을위한 새로운 테스트 스트립.
- (선택 단계) 피펫으로 혈액의 정확한 양을 가지고 더 분석 (헤모글로빈, 중성 지방 (TG), 총 콜레스테롤 등) microcentrifuge 관에 피를 전송합니다. 필요한 경우, 식염수 한 물고기에서 전체 혈액을 희석. RT에서 680 XG에서 3 분 동안 혈액 샘플을 원심 분리하여 플라즈마를 수확. 새로운 튜브에 플라즈마를 전송합니다. 지금부터, 생화학 적 분석에 사용될 준비가되어있다.
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Representative Results
(도 1J를 <1mm 천자) 및 2.3 %의 매우 낮은 치사율을 산출 이러한 혈액 수집 방법은 제브라 최소한 부상시킨다. 우리는 하나의 물고기에서 수집 및 체중 (그림 3)의 관계를 평가 될 수있는 혈액의 최대 볼륨을 조사했다. 우리는 수집 된 최대 혈액량이 선형 적으로 체중 (R = 0.813) 상관 관계를 보였다 것으로 나타났습니다. 개별 물고기 (체중 = 1.071 g)으로부터 혈액 채취 큰 부피는 25 μL이고, 작은 체적은 0.115 g을 계량 물고기 1.3 μL이었다. 이렇게 수집 된 혈액의 양이 최대 지브라 피쉬의 체중에 의존한다는 것을 제시한다.
헤모글로빈, 혈당, TG 및 총 콜레스테롤의 생화학 적 분석은 채혈 (표 1) 후에 수행 하였다. 남성과 여성의 건강한 성인 제브라 피쉬 (4-6개월 세)는 혈액 collecti 전에 18 시간 동안 금식했다에. 생화학 적 분석은 헤모글로빈의 정상 값 (남성 9.91 ± 0.49 ㎍ / DL과 여성의 10.02 ± 0.48 g / DL) 및 TG (남성 417 ± 45 밀리그램 / DL과 여성의 404 ± 35 밀리그램 / DL)는 유의 한 차이가 없었다 것으로 나타났다 두 그룹 사이. 그러나, 공복시 혈당 및 남성 그룹의 총 콜레스테롤 수준은 (44 ± 3 밀리그램 / DL 각각 365 ± 18 밀리그램 / DL은) 여성 기 (69 ±에 3mg / DL보다 상당히 낮은 (p <0.05)이었고 511 ± 52 밀리그램 / DL, 각각).
최소의 외상 동일인으로부터 혈액 샘플링을 반복 가능하게, 본 방법을 사용하여 제브라하면서 반복 채혈의 효과는 평가하지 않았다. 우리는 혈액 헤모글로빈 수준 (그림 4)의 측정을 사용하여 이러한 효과를 조사 하였다. 우리가 이전에 게시 (15)에 표시 한 바와 같이, 성인 남성 물고기는 약 0.5g을 각각 네 그룹에 할당 된 무게. 반복 혈액 샘플링(2 μL마다) (일곱 혈액 샘플의 총) 회 7 일간 동일인 물고기가 2.38로 10.82 ± 0.78 g / DL에서 헤모글로빈 농도의 유의 한 감소 (p <0.01)였다 ± 0.8 g / DL. 2 ㎕의 혈액 2 일마다 주당 5 μL의 단일 컬렉션의 제거는 또한 헤모글로빈 수준의 상당한 감소 (p <0.05)을 수득 하였다. 또한 일주일 2 μL 혈액 샘플의 단일 컬렉션 후, 헤모글로빈 수치가 약간 정상 아래 (/ DL 8.11 ± 1.15 g에서 7.15 ± 1.17 g / DL)이었다. 헤모글로빈 수치가 2 주 동안 회복 기간 2 또는 5 ㎕의 혈액 샘플을 수집 한 후 아무 효과가 없었다. 따라서, 우리는 혈액 손실을 피할 수 빈혈 혈액 2 μL (체중의 0.4 %), 당 또는 개별 주 물고기 이주 당 2-5 μL (체중 0.4에서 1 사이 %)의 컬렉션을 반복한다는 결론을 내렸다.
우리는 더 gluc의 연구에이 방법을 적용OSE 대사. 정상식이 군 (급지 회) 및 과식 기 (오 일상 수유) 각 개인의 혈당 수치 변화는 5 주 동안 관찰 하였다. 정상식 먹인 제브라 피쉬 (생선 A, B, C)은 오버 피드 제브라 피쉬 (생선 D, E, F)이 빠르면 주 1과 고혈당을 경험하면서, 안정된 혈당 모든 시간을 나타내, 이러한 고혈당 상태를 유지 5 주간의 연구 기간 (그림 5)에 걸쳐.
그림 1 :. 성인 Zebrafish의 혈액 수집 절차 (A) 유리 바늘은 바늘 풀러를 사용하여 제조. 경사 미세 가위를 이용하여 바늘의 선단부를 절단 (B). (C) 약 135 ㎛의 직경을 갖는 팁 미리 절단 바늘. 스케일 바 = 1mm. (D) 혈액 수집 장치 : 흡인기 튜브조립 (왼쪽)과 전구 디스펜서 (오른쪽). 화살표는 마이크로 캐 필러 바늘을 유지하기 위해 코 부분을 나타냅니다. 화살촉은 흡인기 튜브 어셈블리의 마우스 피스를 보여줍니다. 바늘은 시료 채취 전에 코 부분의 단부에 위치된다. (E) 바늘을 Heparinizing. (F)는 물고기를 마취. (G) 마취제에 적신 종이 타월에 물고기를 놓습니다. (H) 혈액 수집 사이트에 30 ~ 45 ° 각도로 바늘을 삽입합니다. (I) 혈액은 바늘로 상승. (J) 출혈이 멈춘과 <650 μm의 구멍은 원과 고배율에 나타낸다. 파라 필름의 조각에 바늘에서 피를 추방 (K). (L) 혈당 측정기를 사용하여 혈당을 측정.
그림 3 :. 혈액 샘플링과 체중의 최대 음량의 관계 (2~6개월 세, 42 남성과 41 여성) (83) 제브라 피쉬의 총 최대 채혈을 시행 하였다.
그림 4 :. 반복 혈액 샘플링과 1 주 동안 헤모글로빈 수준의 변화 (2)혈액의 μL 샘플을 한 번 매주 이일, 주 1 회 또는 5 μL에서 한 번, 매일 같은 개별 물고기에서 수집 (N = 5). 헤모글로빈 혈액 수집하기 전에 각 그룹의 수준 (0 일, 흰색 막대) 반복 채혈 후 (7 일, 회색 막대)가 표시됩니다. 값은 평균의 표준 오차 (SEM) ± 수단이다. * P <0.05, ** P <심판에서 적응 일 0. 15 대 0.01.
그림 5. 5 주 동안 여섯 개인 남성 물고기의 금식 혈당 농도의 변화는 물고기 A, B 및 C는 정상식이 군이었다. 물고기 D, E 및 F는 오버 피드 기였다.
표 1 : 남성을위한 혈색소, 혈당, TG 및 총 콜레스테롤 수준 및여성 Zebrafish의 4 - 생후 6 개월.
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Discussion
우리는 직렬 성인 제브라 피쉬에서 혈액을 얻기 위해 여기에 대한 자세한 프로토콜을 제시한다. 이 방법을 수행하는 것이 간단하며 우리는 일상적 실험에 사용. 이러한 혈액 수집 방법에 지브라 피쉬의 등쪽 대동맥 내로 유리 모세관 바늘 삽입에 근거한다. 이 절차를 수행하는 동안, 그것은 지느러미 대동맥를 검색하기위한 기준이 있기 때문에 척추를 브레이션 않도록주의하는 것이 중요합니다. 척추 부상을 줄이면 생존율을 개선한다. 이 기술은 간단하고 마스터에 쉽게하지만, 높은 성공과 생존율을 보장 할 수 있습니다 모범 사례가있다. 숙련 된 연구원 (물고기가 물 밖으로있는 시간 인 3.6 프로토콜 2.3) 혈액 수집 절차를 수행하기 위해 1-2 분 소요됩니다. 대규모 실험에서 시간을 절약하기 위해, 두 팀 접근 방식은 혈액 수집을 수행하는 것이 좋습니다. 초를 처리 할 수있는 예를 들어, 한 연구자는, 혈액 샘플링을 수행 할 수있다생선은 마취를 수행하고 수집 된 혈액 (등, 혈당을 측정, 기록 또는 마이크로 원심 튜브에 혈액을 이동)을 분석.
이 방법을 사용하여, 우리는 개별 물고기에서 수집 될 수있는 최대 혈액 샘플 볼륨 지브라 피쉬의 전체 순환 혈액량이 체중 초과 2 %임을 시사 무관 성 (15)의 체중의 약 2 %임을 보여 주었다. 이전의 연구는 경골 어류 (경골 어류 종.을 SALMO는 gairdneri는 gairdneri) 증명, 따라서 우리의 2-3.8 %로 제브라 피쉬의 전체 순환 혈액량을 예측, 체중 17, 18의 1.8-3.8 % 사이에 이르기까지 총 혈액량을 가지고 제브라 피쉬의 체중. 하나의 채혈을 위해, 우리는 강하게 채혈 혈액의 ≥5 μl를 얻기 위해 3 개월 또는> 0.3 g의 체중의 제브라 피쉬에서 수행해야하는 것이 좋습니다. 그것은 아니다약 제브라 피쉬의 절반은 혈액의 체중의 2 %가 제거되었다하더라도 살아 eworthy은은 제브라 피쉬는 혈액 손실에 잘 대처할 수 있음을 밝혔다.
이 방법의 가장 중요한 장점은 동일인 거듭된 혈액 샘플링을 가능하게한다는 것이다. 우리는 헤모글로빈 수치의 변화 (그림 4)을 측정하여 최적의 볼륨과 혈액 샘플링 주파수를 결정했다. 우리는 반복 혈액 샘플링의 볼륨과 간격이 혈액 손실 빈혈과 출혈성 죽음을 피하기 위해 일주일에 체중의 ≤0.4 %와 이주 당 체중의 ≤1 %로하는 것이 좋습니다. 이 결론은 설치류 모델 동물 (19, 20)의 반복 채혈에 대한 진료 지침과 일치한다.
실험이 제브라 피쉬의 희생을 허용하는 경우, 바늘이 troubl 등 지느러미 대동맥의 지역에서 아가미에 몸 축을 따라 위치, 후방에 삽입 할 수 있습니다eshooting 또는 다른 방법. 이 사이트는 심장 부근 및 대동맥 채혈 과정을 쉽게 할 수있는, 비교적 크다.
제브라 성공적 당뇨병 21,22, 23,24, 비만, 지방간 질환 (25) 및 (26)을 포함하여 아테롬성 동맥 경화증, 대사 증후군의 상호 관련된 상태를 모델링에서 사용되어왔다. 우리는 또한 다이어트 유발 된 비만에서 포도당 대사 (그림 5)을 관찰하기 위해이 기술을 적용했다. 고지방식이를 공급하는 경우 포유 동물과 마찬가지로, 제브라 피쉬는 비정상적인 당지질 대사를 개발했다. 개개의 공복 혈당의 변화는 인간 15,27에서와 유사한 과식에 응답하여 개체 차이를 보였다. 이 결과는 개별 물고기의 혈액 생화학 파라미터의 시간적 변화를 조사 대사 장애 스와의 개별 차이를 확인 할 수있는 좋은 기회를 제공 할 것을 나타냅니다비만 및 2 형 당뇨병과 같은 CH, 따라서 상기 인간 질환의 동물 모델로서 그 값을 확인.
전반적으로, 우리는 성인 제브라 피쉬에서 반복 채혈을위한 새로운 방법을 개발했다. 이 방법은 독성 동태, 약물 동력학, 그리고 혈액의 연구로 반복되는 혈액 샘플을 필요로 제브라 피쉬의 연구에 필수적이다. 또한,이 반복 혈액 샘플링 방법은 또한 예를 들어, 생물 의학 연구에 다른 작은 수족관 물고기에 적용 할 수있는, 송사리 (오리 지 아스 쿠르 latipes) 또는 Xiphophorus (Xiphophorus helleri).
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glass capillaries with filament | Narishige | GD-1 | 1.0 mm outer diameter. |
| Needle puller | Narishige | PC-10 | To produce the needles |
| Heparin | Wako Pure Chemical Industries | 081-00136 | For heparinization |
| Aspirator tube assembly | Drummond | 2-040-000 | For blood collection |
| Bulb dispenser | Drummond | 1-000-9000 | For blood collection |
| 2-phenoxyethanol | Wako Pure Chemical Industries | 163-12075 | For anesthetizing the fish |
| DRI-CHEM3500V | Fujifilm | - | For hemoglobin measurement |
| DRI-CHEM Slides | Fujifilm | Hb-WII | For hemoglobin measurement |
| Glutest Neo Super | Sanwa Kagaku Kenkyusho | - | For bood glucose measurement |
| Wako L-type TG kit | Wako Pure Chemical Industries | 464-44201 | For TG measurement |
| Wako L-type CHO kit | Wako Pure Chemical Industries | 460-44301 | For total cholesterol measurement |
| Parafilm M | Alcan Packaging | PM996 | To expel the blood on |
References
- Lieschke, G., Currie, P. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nat Rev Genet. 8 (5), 353-367 (2007).
- Penberthy, W. T., Shafizadeh, E., Lin, S. The zebrafish as a model for human disease. Front Biosci. 7, d1439-d1453 (2002).
- Stachura, D. L., Traver, D. Cellular dissection of zebrafish hematopoiesis. Methods Cell Biol. 101, 75-110 (2011).
- Jagadeeswaran, P., Sheehan, J. P. Analysis of blood coagulation in the zebrafish. Blood Cells Mol Dis. 25 (3-4), 239-249 (1999).
- Jagadeeswaran, P., Sheehan, J. P., Craig, F. E., Troyer, D. Identification and characterization of zebrafish thrombocytes. Br J Haematol. 107 (4), 731-738 (1999).
- Lieschke, G. J., Oates, A. C., Crowhurst, M. O., Ward, A. C., Layton, J. E. Morphologic and functional characterization of granulocytes and macrophages in embryonic and adult. Blood. 98 (10), 3087-3096 (2001).
- Iwanami, N. Zebrafish as a model for understanding the evolution of the vertebrate immune system and human primary immunodeficiency. Exp Hematol. 42 (8), 697-706 (2014).
- Babin, P. J., Goizet, C., Raldua, D. Zebrafish models of human motor neuron diseases: advantages and limitations. Prog Neurobiol. 118, 36-58 (2014).
- Seth, A., Stemple, D. L., Barroso, I. The emerging use of zebrafish to model metabolic disease. Dis Mod Mech. 6 (5), 1080-1088 (2013).
- Eames, S. C., Philipson, L. H., Prince, V. E., Kinkel, M. D. Blood sugar measurement in zebrafish reveals dynamics of glucose homeostasis. Zebrafish. 7 (2), 205-213 (2010).
- Moss, J. B., et al. Regeneration of the pancreas in adult zebrafish. Diabetes. 58 (8), 1844-1851 (2009).
- Oka, T., et al. Diet-induced obesity in zebrafish shares common pathophysiological pathways with mammalian obesity. BMC Physiol. 10 (21), (2010).
- Chu, C. Y., et al. Overexpression of Akt1 enhances adipogenesis and leads to lipoma formation in zebrafish. PLoS One. 7 (5), e36474 (2012).
- Velasco-Santamaría, Y. M., Korsgaard, B., Madsen, S. S., Bjerregaard, P. Bezafibrate, a lipid-lowering pharmaceutical, as a potential endocrine disruptor in male zebrafish (Danio rerio). Aquat Toxicol. 105 (1-2), 107-118 (2011).
- Zang, L., Shimada, Y., Nishimura, Y., Tanaka, T., Nishimura, N. A novel, reliable method for repeated blood collection from aquarium fish. Zebrafish. 10 (3), 425-432 (2013).
- Carmichael, C., Westerfield, M., Varga, Z. M. Cryopreservation and in vitro fertilization at the zebrafish international resource center. Methods Mol Biol. 546, 45-65 (2009).
- Thorson, T. B. The partitioning of body water in Osteichthyes: phylogenetic and ecological implications in aquatic vertebrates. Biol Bull-US. 120, 238-254 (1961).
- Conte, F. P., Wagner, H. H., Harris, T. O. Measurement of blood volume in the fish (Salmo gairdneri gairdneri). Am J Physiol. 205, 533-540 (1963).
- Diehl, K. H., et al. A good practice guide to the administration of substances and removal of blood, including routes and volumes. J Appl Toxicol. 21 (1), 15-23 (2001).
- Nahas, K., Provost, J. -P., Baneux, P. H., Rabemampianina, Y. Effects of acute blood removal via the sublingual vein on haematological and clinical parameters in Sprague-Dawley rats. Lab Anim. 34 (4), 362-371 (2000).
- Curado, S., et al. Conditional targeted cell ablation in zebrafish: a new tool for regeneration studies. DevDyn. 236 (4), 1025-1035 (2007).
- Andersson, O., et al. Adenosine signaling promotes regeneration of pancreatic beta cells in vivo. Cell Metab. 15 (6), 885-894 (2012).
- Hiramitsu, M., et al. Eriocitrin ameliorates diet-induced hepatic steatosis with activation of mitochondrial biogenesis. Sci Rep-UK. 4, 3708 (2014).
- Zang, L., Shimada, Y., Kawajiri, J., Tanaka, T., Nishimura, N. Effects of Yuzu (Citrus junos Siebold ex Tanaka) peel on the diet-induced obesity in a zebrafish model. J Funct Foods. 10, 499-510 (2014).
- Schlegel, A. Studying non-alcoholic fatty liver disease with zebrafish: a confluence of optics, genetics, and physiology. Cell Mol Life Sci. 69 (23), 3953-3961 (2012).
- Stoletov, K., et al. Vascular lipid accumulation, lipoprotein oxidation, and macrophage lipid uptake in hypercholesterolemic zebrafish. Circ Res. 104 (8), 952-960 (2009).
- Thomas, C. D., et al. Nutrient balance and energy expenditure during ad libitum feeding of high-fat and high-carbohydrate diets in humans. Am J Clin Nutr. 55 (5), 934-942 (1992).
