Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Wiederholte Blutentnahme für Bluttests in Adult Zebrafisch

doi: 10.3791/53272 Published: August 30, 2015

Abstract

Wiederholte Blutentnahme ist eine der am häufigsten verwendeten Techniken bei Labortieren durchgeführt. Allerdings hat eine nicht-tödliche Protokoll für die Blutentnahme aus Zebrafisch nicht nachgewiesen. Die bisherigen Verfahren zur Blutentnahme aus Zebrafisch sind tödlich, wie laterale Inzision, Enthauptung und Schwanz Ablation. So haben wir eine neuartige "wiederholte" Blutabnahmeverfahren ein detailliertes Protokoll umreißt dieses Verfahren entwickelt, und heute hier. Dieses Verfahren ist minimal-invasiv und führt zu einer sehr geringen Sterblichkeit (2,3%) für Zebrafisch, wodurch wiederholte Entnahme von Blut aus dem gleichen Individuum. Das maximale Volumen der Blutabnahme ist abhängig vom Körpergewicht der Fische. Das Volumen für wiederholte Entnahme von Blut in Abständen sollte ≤0.4% des Körpergewichts pro Woche oder ≤1% alle 2 Wochen, was durch Messungen der Hämoglobin bewertet wurden sein. Zusätzlich Hämoglobin, Nüchternblutzucker, Plasma Triacylglycerol (TG) und c insgesamtholesterol Ebenen bei männlichen und weiblichen erwachsenen Zebrafisch wurden gemessen. Wir wendeten diese Methode auch, um die Fehlregulation des Glukosestoffwechsels in ernährungsbedingte Fettleibigkeit zu untersuchen. Dieses Blutsammelverfahren wird viele Anwendungen, einschließlich Glucose- und Fettstoffwechsels und hämatologischen Studien, die die Verwendung eines Zebrafischs als menschliche Krankheitsmodell Organismus erhöhen können.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Zebrafische sind gewinnt zunehmend an Popularität als ein wertvolles Modell der menschlichen Krankheiten, weil ihre Organe und Genetik ähnlich denen des Menschen 1,2 sind. Auf dem Gebiet der Entwicklungsbiologie, haben viele Studien gezeigt, dass die Zebrafisch und Menschen zeigen deutliche Ähnlichkeit in der Hämatopoese 3, Blutstillung 4,5 und Myelopoese 6. Erwachsenen Zebrafisch sind ebenfalls für die Untersuchung immunologischer 7, neurodegenerative 8 und Fettleibigkeit bedingte Krankheiten 9, weil dieses Modellorganismus Aktien gemeinsamen Wege mit denen in menschlichen Erkrankungen gestört verwendet. Für Übergewicht und Fettleibigkeit bedingte Krankheiten (Diabetes, Fettleber und nichtalkoholische Steatohepatitis und Atherosklerose), Zebrafisch-Blutzucker und Lipide Ebenen wurden gründlich in mehreren transgenen und ernährungsbedingte Fettleibigkeit Modelle 10-13 untersucht.

Wiederholte Entnahme von Blut aus einzelnen Tiere Tiernutzung und Dezember zu reduzierenRease interindividuelle Unterschiede. Jedoch ist wiederholte Probennahme wegen ihrer relativ kleinen Blutvolumen und der Mangel an leicht zugänglichen Gefäßen technisch schwierig bei kleinen Tieren wie Zebrafisch. Verschiedene Methoden für die einmalige Blutentnahme von Zebrafisch entwickelt, obwohl diese Methoden haben ihre eigenen Nachteile, einschließlich Letalität assoziiert Gewebeschäden und begrenzte Blutvolumen. B. 1-5 & mgr; l Blut von einem seitlichen Einschnitt von etwa 0,3 cm in der Länge in dem Bereich des dorsalen Aorta 5 geerntet werden. Enthauptung mit einer Schere durch Schneiden durch den Schultergürtel kann 5-10 & mgr; l Blut 10 zu sammeln. Eine weitere praktische Blutentnahme Methode ist tail Ablation 14. Herzpunktion ist eine mögliche alternative Verfahren für wiederholte Blutentnahme aus dem gleichen Fisch, aber die sehr geringe Menge erhalten (etwa 50 nl) mit diesem Verfahren begrenzt die Anzahl der Analysen, die Leis sein kannMed. 11 Dementsprechend wird ein neues Protokoll benötigt, um wiederholter nicht-tödliche Blutabnahme, die zu kritischer Voraus erforderlich wäre dafür Organismus auf eine Standard-Modellorganismus für menschliche Krankheiten zu ermöglichen. Diese Technik würde zum Testen pharmakologische Reaktion, Entdeckung von Molekular Biomarker für die Diagnose, die Bestimmung der Prognose und die Überwachung von verschiedenen Krankheiten, wie Stoffwechselerkrankungen, degenerativen Erkrankungen und verschiedenen Arten von bösartigen Erkrankungen ermöglicht.

Deshalb entwickelte eine minimal-invasive Verfahren zur Gewinnung von Blut von Zebrafischen in Reihe 15. Hier werden wir den Vorgang visuell nachweisen und ein detailliertes Protokoll für diese Technik. Unter Verwendung dieses Verfahrens wurden der normale Wert auf der Grundlage verschiedener Parameter, einschließlich Hämoglobin, Nüchternblutzucker und Lipide im Blut von gesunden erwachsenen Zebrafisch ausgewertet. Zusätzlich haben wir auch bewertet, ob diese Methode eignet sich für Studien, die serielle Proben durch m verlangenBERWACHUNG die zeitlichen Veränderungen der Blutzuckerwerte während der Überfütterung Experimenten.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Alle tierischen Verfahren wurden von der Ethikkommission der Universität Mie genehmigt und wurden gemäß den japanischen Tierschutzverordnung "Gesetz über die Wohlfahrt und Verwaltung von Animals '(Ministerium für Umwelt, Japan) durchgeführt und mit den internationalen Richtlinien eingehalten werden.

1. Herstellung der Nadel

HINWEIS: Alle Experimente wurden unter Vollnarkose durchgeführt, und alle Anstrengungen unternommen wurden, um das Leiden zu minimieren. Um Sterbehilfe, Fische wurden in einem Eis-Wasser-Bad (at ≤4 ° C 5 Teile Eis / 1 Teil Wasser) für ≥20 min eingetaucht.

  1. Bereiten Sie die Glas Mikrokapillare Nadeln durch Ziehen einer Glaskapillare 1,0-mm-Außendurchmesser mit einer Nadel puller (Abbildung 1A).
  2. Schneiden Sie die Spitzen der Nadeln schräg mit einer feinen Schere (1B). 200 & mgr; m (Abbildung 1c) - der ideale Spitzendurchmesser sollte etwa 100 sein. Wenn die Spitze diameter zu schmal ist, wird Blut nicht in die Nadel.
  3. Aufzulösen Heparin in Kochsalzlösung auf eine Konzentration von 5 mg / ml.
  4. Legen Sie eine vorgeschnittene Nadel im Objektivrevolver Ende einer Wasserstrahlpumpe Rohranordnung und halten Sie das Mundstück in den Mund, oder schließen Sie die Nadel in einer Glühbirne Spender. Tauchen Sie die Nadelspitze in der Heparin-Lösung und Heparinisierung die Nadel durch Saugen und Blasen durch die Lösung (Abbildung 1D und 1E).
    Hinweis: Das Ansaugrohr Montage für Zebrafisch Spermien Kryokonservierung 16 verwendet. Lange Gummischlauch kann kein Blut fliegen in den Mund zu stoppen. Setzen eines Filters in der Mitte der Röhre können die Gefahren zu vermeiden.
  5. Bewahren Sie die heparinisierte Nadeln in einer 10 cm Petrischale und an der Luft trocknen für mindestens 1 Std. Eine große Anzahl von Nadeln im Voraus vorbereitet werden.

2. Anästhesie

  1. Bereiten Sie die Anästhesielösung in einem kleinen Kunststoffgehäuse durch Mischen von 200 ml Fischwasser mit 100 ul 2-Phenoxyethanol (2-PE). Endkonzentration der Anästhetika ist 500 ppm.
    VORSICHT! 2-PE hat eine schnelle Wirkung.
  2. Entfernen gewünschte Anzahl von Fischen (AB-Stamm) aus dem Kreislauf-System.
  3. Verwenden Sie ein Netz, um die Fische in die Anästhetika für 1 übertragen - 2 min (1F). Beobachten Sie die Fische nach und nach zu schwimmen, zu verbreiten, die Brustflossen horizontal, Keuchen und haben schnelle Operculum Bewegungen innerhalb 1 min.
  4. Wie die Zeit vergeht, beobachten die Fische lagen auf dem Boden des Gehäuses und schließlich zu stoppen Schwimmen. Die chirurgische Ebene der Anästhesie wird erreicht, wenn der Fisch stoppt nach Luft zu schnappen und die Operculum Bewegungen sind langsam. An dieser Stelle ist Fisch bereit für die Blutentnahme.
  5. Mit einem Schaumlöffel heben Sie den narkotisierten Fisch aus dem 2-PE und legen Sie sie vorsichtig auf ein Papiertuch mit den Anästhetika (1G) eingeweicht. Bedecken Sie den Kopf des Fisches mit weichem Tissue-Papier auch mit 2-PE-Lösung getränkt, um Augentrockenheit zu verhindern, und verwenden Sie ein anderes trockenes weiches Seidenpapier vorsichtigtrocknen die Körperoberfläche.

3. Blutentnahme

  1. Legen Sie eine heparinisierte Nadel im Objektivrevolver Ende des Ansaugrohr-Baugruppe (oder der Glühbirne Spender) und halten Sie die Mundstückende des Ansaugrohr Montage in den Mund.
  2. Fassen Sie den Objektivrevolver Ende und die Nadel zusammen, und entfernen Sie vorsichtig die störenden Waagen mit der Nadelspitze. Führen Sie die Nadel in einem 30 - 45 ° Winkel in den Blutsammel Website. Durchstechen des Gastrointestinaltraktes (Figur 1H) vermeiden. Im Falle der Verwendung von Lampenspender, drücken Sie die Lampe mit Daumen und Mittelfinger, und blockieren die Öffnung an der Spitze der Lampe mit dem ersten Finger, und setzen Sie die Nadel wie oben beschrieben.
    Hinweis: Der Ort für die Blutentnahme ist entlang der Körperachse und hinter dem Anus in dem Bereich des dorsalen Aorta. Der dorsalen Aorta (DA) und die hintere Cardinalvene (PCV) nur ventral zur Wirbelsäule (Abbildung 2).
  3. Fangen Sie an, die saugenMundstückende des Ansaugrohres Anordnung, wenn die Nadel zu berühren die Wirbelsäule zu spüren. Wenn Blut steigt nicht, bewegen Sie die Nadelspitze auf subtile Weise von Hand, um die Durchblutung zu fördern. Beachten Sie, dass, wenn Blut in die Nadel steigen, sofort aufhören zu zittern und saugen sanft (1I). Im Falle der Verwendung von Lampenspender, den Druck der Glühbirne, um das Blut zu saugen.
  4. Beachten Sie das Blut langsam pulsatil in die Nadel steigen ohne Absaugung, die wegen der arterielle Blutdruck wahrscheinlich ist. Somit ist es nicht notwendig ist, zu saugen, wenn die Nadel die Arterie richtig eindringt.
  5. Stoppen Absaugung nach dem geeigneten Volumen Blut gesammelt. Entfernen Sie die Nadel aus dem Fisch und drücken Sie die Einstichstelle mit weichem Tissue-Papier, um Blutungen zu stoppen. Beachten Sie die Blutung zu stoppen nach ca. 10 - 20 sec von Fingerdruck (Abbildung 1J).
  6. Nachdem die Blutung gestoppt ist, den Fisch sofort wieder zurück zu übertragen, um eine cleein Warmwasser (~ 28 ° C) Tank. Helfen Sie dem Fisch vorsichtig wirbelnden Wasser zu den Kiemen, bis es anfängt zu schwimmen zu erholen.
    Hinweis: Bewahren Sie bis zu 5 postsampling Fisch in einem 2 l-Tank und verbinden Sie den Tank in den Kreislauf-System, um die Fische mit Sauerstoff zu versorgen. Zugabe von Antibiotika zum Fischwasser nicht erforderlich ist. Pflegen Sie den Fisch mit normaler Haltung und Fütterung.
  7. Vertreibt das Blut von der Nadel auf eine saubere Fläche von einem Stück Parafilm (Abbildung 1 K).
  8. Messen Blutzucker mit jeder kommerziellen Hand glucometer (Abbildung 1 l).
    Anmerkung: Die glucometer verwendet eine Glucose-Dehydrogenase-Flavinadenindinucleotid Elektrode und erfordert ein Probenvolumen von 0,6 & mgr; l.
    1. Legen Sie einen Teststreifen vollständig in das Messgerät und direkt berühren Sie den Blutstropfen. Automatisch Beachten Sie die Blutentnahme in den Teststreifen und erhalten die Blutzucker 5 Sekunden auf der Anzeigefläche. Nehmen Sie das Ergebnis und entsorgen Sie den Teststreifen. Benutze einenneuen Teststreifen für jede Messung.
  9. (optionaler Schritt) Nehmen genaue Mengen von Blut durch eine Pipettiervorrichtung und übertragen das Blut in ein Mikrozentrifugenröhrchen für weitere Analysen (Hämoglobin, Triacylglycerin (TG), Gesamtcholesterin, etc.). Wenn nötig, verdünnen das Vollblut von einem Fisch mit Kochsalzlösung. Zentrifugieren der Blutproben für 3 min bei 680 · g bei RT und Ernte der Plasma. Übertragen des Plasmas in ein neues Röhrchen. An dieser Stelle ist es bereit, in biochemischen Analysen verwendet werden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Das Blutsammelverfahren bewirkt minimale Verletzung Zebrafisch (ein <1 mm Punktion; Figur 1J) und ergibt eine sehr niedrige Mortalitätsrate von 2,3%. Wir untersuchten das maximale Volumen an Blut, die von einem einzelnen Fisch gesammelt und ausgewertet werden, die die Beziehung um sein Körpergewicht (Abbildung 3) werden könnte. Wir haben festgestellt, dass der maximale Blutvolumen gesammelt wurden linear mit dem Körpergewicht (R = 0,813) korreliert. Das größte Volumen von Blut von einem einzelnen Fisch (Körpergewicht = 1.071 g) gesammelt wurde, betrug 25 ul, und das kleinste Volumen betrug 1,3 & mgr; l von einem Fisch von 0,115 g. Dies legt nahe, dass die maximale Blutmenge gesammelt ist abhängig vom Körpergewicht des Zebrafisches.

Biochemische Analyse von Hämoglobin, Blutzucker, TG und Gesamtcholesterin wurde nach der Blutentnahme (Tabelle 1) durchgeführt. Männliche und weibliche gesunden erwachsenen Zebrafisch (4-6 Monate alt) wurden 18 Stunden vor der Blut collecti gefastetam. Die biochemische Analyse ergab, dass der Normalwert des Hämoglobins (männlich 9,91 ± 0,49 g / dl und weiblichen 10,02 ± 0,48 g / dl) und TG (männlich 417 ± 45 mg / dl und weibliche 404 ± 35 mg / dl) unterschieden sich nicht signifikant zwischen den beiden Gruppen. Allerdings ist die Nüchternblutzucker und Gesamtcholesterinspiegel der männlichen Gruppe (44 ± 3 mg / dl und 365 ± 18 mg / dl, respectively) waren signifikant niedriger (p <0,05) als die weiblichen Gruppe (69 ± 3 mg / dl und 511 ± 52 mg / dl, beziehungsweise).

Während die minimalen Trauma für Zebrafisch mit dem vorliegenden Verfahren ermöglicht wiederholte Entnahme von Blut aus demselben Individuum, wurden die Auswirkungen der wiederholten Blutentnahme nicht evaluiert. Wir untersuchten diese Effekte unter Verwendung von Messungen der Bluthämoglobinspiegel (Abbildung 4). Wie wir bereits in einer früheren Veröffentlichung 15 gezeigt, erwachsene männliche Fische mit einem Gewicht von etwa 0,5 g wurden jeweils zu vier Gruppen zugeordnet. Wiederholte Entnahme von Blut(2 & mgr; l jedes Mal) aus dem gleichen einzelnen Fische einmal täglich für 7 Tage (für insgesamt sieben Blutproben) führte zu einer signifikanten Abnahme (p <0,01) der Hämoglobinwerte von 10,82 ± 0,78 g / dl auf 2,38 ± 0,8 g / dl. Entfernung von 2 ul Blut alle 2 Tage oder eine einzige Sammlung von 5 & mgr; l pro Woche ergab ebenfalls eine signifikante Abnahme (p <0,05) der Hämoglobinwerte. Darüber hinaus, eine Woche nach einer einzigen Sammlung eines 2 ul Blutprobe wurden Hämoglobinwerte leicht unter normalen (von 8,11 ± 1,15 g / dl auf 7,15 ± 1,17 g / dl). Die Hämoglobinspiegel hatte keine Auswirkungen nach einer einmaligen Sammlung von einem 2 oder 5 ul Blutprobe für einen 2-wöchigen Erholungsphase. So schlossen wir, dass von 2 ul Blut (0,4% Körpergewicht) pro Woche oder 2-5 & mgr; l (0,4 bis 1% des Körpergewichts) pro 2 Wochen von einzelnen Fische wiederholte Sammlung kann Blutverlust Anämie zu vermeiden.

Wir weiter auf die Untersuchung von gluc Diese Methode wurdeose Stoffwechsel. Die Veränderungen der Blutzuckerwerte jedes einzelnen in der normalen Diät-Gruppe (einmal tägliche Fütterung) und Überfütterung-Gruppe (fünf täglichen Fütterungen) wurden über einen 5-Wochen-Frist überwacht. Normalen Ernährung gefüttert Zebrafisch (Fisch A, B, C) zeigten stabile Blutzuckerspiegel die ganze Zeit, während der überfüttert Zebrafisch (Fisch D, E, F) erlebte hohe Blutzuckerwerte so früh wie Woche 1 und behielt diese Hyperglykämie Zustand in der gesamten 5-wöchigen Studie Zeitraum (Abbildung 5).

Abbildung 1
Abb. 1: Verfahren für die Blutentnahme Von Adult Zebrafisch (A) Glas-Nadeln mit einer Nadel puller vorbereitet. (B) Schneiden Sie die Spitze der Nadel schräg mit einer feinen Schere. (C) ein vorgeschnittener Adel mit einem Spitzendurchmesser von etwa 135 & mgr; m. Maßstabsbalken = 1 mm. (D) Blutentnahmegeräte: ein AnsaugrohrAnordnung (links) und einer Glühlampe Spender (rechts). Die Pfeile zeigen die Nasenstück, um die Mikrokapillare Nadel zu halten. Die Pfeilspitze zeigt das Mundstück des Ansaugrohr Montage. Die Nadel wird in das Ende des Mundstücks vor der Probennahme positioniert. (E) Heparinizing die Nadel. (F) eines betäubten Fische. (G) Den Fisch auf einem Papiertuch mit den Narkosemittel getränkt. (H) Führen Sie die Nadel in einem 30-45 ° -Winkel in den Blutsammelplatz. (I) Blut steigt in die Nadel. (J) Blutung aufgehört hat und eine <650 um Punktion wird eingekreist und in starker Vergrößerung dargestellt. (K) Vertreibung das Blut von der Nadel auf ein Stück Parafilm. (L) Messung des Blutzuckerspiegels mit einem Zuckermessgerät.

Figur 2
(A) Die weiße Linie zeigt die Punktionsstelle für die Blutentnahme, die sich entlang der Körperachse und hinter dem Anus in der Region der dorsalen ist Aorta. (B) Die Primärgefäße sind die dorsalen Aorta und hinteren Kardinalvene; Diese befinden sich ventral der Wirbelsäule. S, der Wirbelsäule; DA, dorsalen Aorta; PCV, hinteren Kardinal Vene.

Figur 3
Abb. 3: Die Beziehung der maximalen Lautstärke der Blutentnahme und Körpergewicht Insgesamt 83 Zebrafisch (2-6 Monate alt, 42 männliche und 41 weibliche) wurden maximale Blutsammlung.

Figur 4
Abb. 4: Veränderungen der Hämoglobinwerte Über ein 1-Wochen-Frist mit wiederholte Entnahme von Blut A 2ul Blutprobe wurde aus dem gleichen einzelnen Fische täglich an 2 Tagen, einmal wöchentlich oder einmal wöchentlich 5 ul gesammelt, einmal (n = 5). Die Hämoglobinwerte jeder Gruppe vor der Blutentnahme (Tag 0, weiße Balken) und nach wiederholten Blutabnahme (Tag 7, graue Balken) gezeigt. Werte sind Mittelwerte ± Standardfehler des Mittelwerts (SEM). * P <0,05, ** p <0,01 vs. Tag 0 aus Lit.. 15.

Figur 5
Abbildung 5:. Veränderungen der Nüchtern-Blutglukosekonzentrationen aus sechs Einzel Male Fish über einen 5-Wochen-Frist Fisch A, B und C waren die Normaldiätgruppe. Fisch D, E und F waren die überfüttert Gruppe.

Tabelle 1
Tabelle 1: Hämoglobin, Blutzucker, TG und Gesamt-Cholesterinspiegel bei männlichen undWeiblich Zebrafisch 4-6 Monate alt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Wir stellen Ihnen hier eine detaillierte Protokoll zur seriellen Blutentnahme von erwachsenen Zebrafisch. Dieses Verfahren ist einfach durchzuführen und wir sie verwenden im Labor auf einer täglichen Basis. Das Blutsammelverfahren zum Einsetzen einer Glaskapillare Nadel in den Zebrafisch der dorsalen Aorta basiert. Während dieses Verfahrens ist es wichtig, vorsichtig zu sein, um nicht zu ablatieren die Wirbelsäule, weil sie das Kriterium für die Suche nach der dorsalen Aorta ist. Die Verringerung der Wirbelsäulenverletzung wird die Überlebensrate zu verbessern. Obwohl diese Technik ist einfach und leicht zu meistern, gibt es Best Practices, die hohe Erfolgs und Überlebensraten zu gewährleisten können. Eine geschickte Forscher wird 1-2 Minuten dauern, bis die Durchführung der Blutsammelverfahren (Protokoll von 2,3 bis 3,6, was die Zeit, die der Fisch aus dem Wasser ist). Um Zeit in Großexperimente zu speichern, wird eine Doppel-Team-Ansatz empfohlen, die Blutentnahme durchführen. Zum Beispiel könnte ein Forscher die Blutentnahme durchzuführen, während eine zweite konnte die KennungFisch, führen die Anästhesie und die gesammelte Blut (Blutzucker-Messung, Aufzeichnung oder Bewegen des Blut-Mikrozentrifugenröhrchen, etc.) zu analysieren.

Mit dieser Methode konnte gezeigt werden, dass die maximale Blutprobenvolumen, die von den einzelnen Fisch gesammelt werden kann, ist etwa 2% des Körpergewichts unabhängig von Geschlecht 15, was darauf hindeutet, dass die gesamte zirkulierende Blutvolumen des Zebrafisches ist größer als 2% des Körpergewichts. Frühere Studien zeigten, dass die Knochenfische (Osteichthyes spp. Und Salmo gairdneri gairdneri) besitzen eine Gesamtblutvolumen im Bereich zwischen 1,8 bis 3,8% des Körpergewichts 17,18, so erwarten wir die Gesamt zirkulierenden Blutvolumens des Zebrafisches zu 2-3,8% der sein Körpergewicht im Zebrafisch. Für einen einzigen Blutentnahme, wird dringend empfohlen, die Blutentnahme sollte ab 3 Monaten oder> 0,3 g Körpergewicht Zebrafischen durchgeführt, um ≥5 ul Blut zu erhalten. Es ist nichteworthy, die etwa die Hälfte der Zebrafisch überlebt, obwohl 2% des Körpergewichts von ihrem Blut wurde entfernt, die ergab, dass Zebrafisch kann gut mit Blutverlust zu bewältigen.

Der wichtigste Vorteil dieses Verfahrens ist, dass es ermöglicht, wiederholte Entnahme von Blut aus dem gleichen Individuum. Wir bestimmten die optimale Volumen und die Frequenz der Blutentnahme durch Messung der Veränderungen der Hämoglobinwerte (Abbildung 4). Wir empfehlen, dass das Volumen und Intervall für die wiederholte Blutentnahme ≤0.4% des Körpergewichts pro Woche und ≤1% Körpergewicht pro 2 Wochen zu Blutungsanämie und hämorrhagische Todesfälle zu vermeiden. Diese Schlussfolgerung steht im Einklang mit den Leitlinien für die wiederholte Entnahme von Blut von Nagetiermodell Tiere 19,20.

Wenn der Versuch ermöglicht die Opferung Zebrafisch kann die Nadel in eine Position entlang der Körperachse hinter dem Kiemen im Bereich der Rückenaorta troubl eingefügteshooting oder eine alternative Methode. Diese Seite befindet sich in der Nähe des Herzens und der Aorta ist relativ groß, die machen die Blutsammelverfahren erleichtern können.

Zebrafische sind erfolgreich in die Modellierung der miteinander verknüpften Bedingungen der metabolischen Syndrom, einschließlich Diabetes 21,22, 23,24 Adipositas, Fettleber 25 und Atherosklerose 26 verwendet. Wir weiter aufgebracht diese Technik, um den Glukosestoffwechsel in ernährungsbedingte Fettleibigkeit (Figur 5) einzuhalten. Ähnlich wie bei Säugetieren, Zebrafisch entwickelt abnorme Glykolipid Stoffwechsel, wenn eine fettreiche Diät gefüttert. Die Änderungen der Nüchternblutzucker jedes einzelnen zeigte individuelle Unterschiede in der Reaktion auf die Überfütterung ähnlich wie bei Menschen, 15,27. Dieses Ergebnis zeigt, dass eine Untersuchung der zeitlichen Veränderungen des Blut biochemische Parameter der Fische eine gute Möglichkeit, die individuelle Unterschiede in der Stoffwechselstörungen su bestimmen liefernch wie Adipositas und Diabetes mellitus Typ 2, so dass eine weitere Bestätigung seines Wertes als Tiermodell für die menschliche Krankheit.

Insgesamt ein neuartiges Verfahren für die wiederholte Blutentnahme von erwachsenen Zebrafisch haben wir. Diese Methode ist für die Zebrafisch-Forschung erfordert wiederholte Blutproben, wie Studien der Toxikokinetik, Pharmakokinetik und Hämatologie. Ferner diese wiederholte Blutentnahme Verfahren kann auch auf andere Klein Zierfische in der biomedizinischen Forschung eingesetzt werden, beispielsweise Medaka (Oryzias latipes) oder Xiphophorus (Xiphophorus helleri).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Glass capillaries with filament Narishige GD-1 1.0 mm outer diameter.
Needle puller Narishige PC-10 To produce the needles
Heparin Wako Pure Chemical Industries 081-00136 For heparinization
Aspirator tube assembly Drummond 2-040-000 For blood collection
Bulb dispenser Drummond 1-000-9000 For blood collection
2-phenoxyethanol Wako Pure Chemical Industries 163-12075 For anesthetizing the fish
DRI-CHEM3500V Fujifilm - For hemoglobin measurement
DRI-CHEM Slides Fujifilm Hb-WII For hemoglobin measurement
Glutest Neo Super Sanwa Kagaku Kenkyusho - For bood glucose measurement
Wako L-type TG kit Wako Pure Chemical Industries 464-44201 For TG measurement
Wako L-type CHO kit Wako Pure Chemical Industries 460-44301 For total cholesterol measurement
Parafilm M Alcan Packaging PM996 To expel the blood on

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lieschke, G., Currie, P. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nat Rev Genet. 8, (5), 353-367 (2007).
  2. Penberthy, W. T., Shafizadeh, E., Lin, S. The zebrafish as a model for human disease. Front Biosci. 7, d1439-d1453 (2002).
  3. Stachura, D. L., Traver, D. Cellular dissection of zebrafish hematopoiesis. Methods Cell Biol. 101, 75-110 (2011).
  4. Jagadeeswaran, P., Sheehan, J. P. Analysis of blood coagulation in the zebrafish. Blood Cells Mol Dis. 25, (3-4), 239-249 (1999).
  5. Jagadeeswaran, P., Sheehan, J. P., Craig, F. E., Troyer, D. Identification and characterization of zebrafish thrombocytes. Br J Haematol. 107, (4), 731-738 (1999).
  6. Lieschke, G. J., Oates, A. C., Crowhurst, M. O., Ward, A. C., Layton, J. E. Morphologic and functional characterization of granulocytes and macrophages in embryonic and adult. Blood. 98, (10), 3087-3096 (2001).
  7. Iwanami, N. Zebrafish as a model for understanding the evolution of the vertebrate immune system and human primary immunodeficiency. Exp Hematol. 42, (8), 697-706 (2014).
  8. Babin, P. J., Goizet, C., Raldua, D. Zebrafish models of human motor neuron diseases: advantages and limitations. Prog Neurobiol. 118, 36-58 (2014).
  9. Seth, A., Stemple, D. L., Barroso, I. The emerging use of zebrafish to model metabolic disease. Dis Mod Mech. 6, (5), 1080-1088 (2013).
  10. Eames, S. C., Philipson, L. H., Prince, V. E., Kinkel, M. D. Blood sugar measurement in zebrafish reveals dynamics of glucose homeostasis. Zebrafish. 7, (2), 205-213 (2010).
  11. Moss, J. B., et al. Regeneration of the pancreas in adult zebrafish. Diabetes. 58, (8), 1844-1851 (2009).
  12. Oka, T., et al. Diet-induced obesity in zebrafish shares common pathophysiological pathways with mammalian obesity. BMC Physiol. 10, (21), (2010).
  13. Chu, C. Y., et al. Overexpression of Akt1 enhances adipogenesis and leads to lipoma formation in zebrafish. PLoS One. 7, (5), e36474 (2012).
  14. Velasco-Santamaría, Y. M., Korsgaard, B., Madsen, S. S., Bjerregaard, P. Bezafibrate, a lipid-lowering pharmaceutical, as a potential endocrine disruptor in male zebrafish (Danio rerio). Aquat Toxicol. 105, (1-2), 107-118 (2011).
  15. Zang, L., Shimada, Y., Nishimura, Y., Tanaka, T., Nishimura, N. A novel, reliable method for repeated blood collection from aquarium fish. Zebrafish. 10, (3), 425-432 (2013).
  16. Carmichael, C., Westerfield, M., Varga, Z. M. Cryopreservation and in vitro fertilization at the zebrafish international resource center. Methods Mol Biol. 546, 45-65 (2009).
  17. Thorson, T. B. The partitioning of body water in Osteichthyes: phylogenetic and ecological implications in aquatic vertebrates. Biol Bull-US. 120, 238-254 (1961).
  18. Conte, F. P., Wagner, H. H., Harris, T. O. Measurement of blood volume in the fish (Salmo gairdneri gairdneri). Am J Physiol. 205, 533-540 (1963).
  19. Diehl, K. H., et al. A good practice guide to the administration of substances and removal of blood, including routes and volumes. J Appl Toxicol. 21, (1), 15-23 (2001).
  20. Nahas, K., Provost, J. -P., Baneux, P. H., Rabemampianina, Y. Effects of acute blood removal via the sublingual vein on haematological and clinical parameters in Sprague-Dawley rats. Lab Anim. 34, (4), 362-371 (2000).
  21. Curado, S., et al. Conditional targeted cell ablation in zebrafish: a new tool for regeneration studies. DevDyn. 236, (4), 1025-1035 (2007).
  22. Andersson, O., et al. Adenosine signaling promotes regeneration of pancreatic beta cells in vivo. Cell Metab. 15, (6), 885-894 (2012).
  23. Hiramitsu, M., et al. Eriocitrin ameliorates diet-induced hepatic steatosis with activation of mitochondrial biogenesis. Sci Rep-UK. 4, 3708 (2014).
  24. Zang, L., Shimada, Y., Kawajiri, J., Tanaka, T., Nishimura, N. Effects of Yuzu (Citrus junos Siebold ex Tanaka) peel on the diet-induced obesity in a zebrafish model. J Funct Foods. 10, 499-510 (2014).
  25. Schlegel, A. Studying non-alcoholic fatty liver disease with zebrafish: a confluence of optics, genetics, and physiology. Cell Mol Life Sci. 69, (23), 3953-3961 (2012).
  26. Stoletov, K., et al. Vascular lipid accumulation, lipoprotein oxidation, and macrophage lipid uptake in hypercholesterolemic zebrafish. Circ Res. 104, (8), 952-960 (2009).
  27. Thomas, C. D., et al. Nutrient balance and energy expenditure during ad libitum feeding of high-fat and high-carbohydrate diets in humans. Am J Clin Nutr. 55, (5), 934-942 (1992).
Wiederholte Blutentnahme für Bluttests in Adult Zebrafisch
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zang, L., Shimada, Y., Nishimura, Y., Tanaka, T., Nishimura, N. Repeated Blood Collection for Blood Tests in Adult Zebrafish. J. Vis. Exp. (102), e53272, doi:10.3791/53272 (2015).More

Zang, L., Shimada, Y., Nishimura, Y., Tanaka, T., Nishimura, N. Repeated Blood Collection for Blood Tests in Adult Zebrafish. J. Vis. Exp. (102), e53272, doi:10.3791/53272 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter