Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

איסוף דם חוזרים ונשנים לבדיקות דם בדג הזברה למבוגרים

doi: 10.3791/53272 Published: August 30, 2015

Abstract

איסוף דם חוזרים ונשנים הוא אחת הטכניקות הנפוצות ביותר שבוצעו בחיות מעבדה. עם זאת, פרוטוקול לא קטלני לאיסוף דם מדג הזברה לא הוקם. השיטות הקודמות לאיסוף דם מדג הזברה הן קטלניות, כגון חתך לרוחב, עריפת ראש והזנב אבלציה. כך פיתחנו שיטה חדשה "חזר" איסוף דם, ובהווה כאן פרוטוקול מפורט המתאר הליך זה. שיטה זו היא פולשנית ותוצאות בשיעור תמותה נמוכה מאוד (2.3%) לדג זברה, ובכך לאפשר דגימת דם חוזרת ונשנית של אותו אדם. הנפח המרבי של דגימת דם תלוי במשקל גוף של הדג. נפח דגימת דם חוזר ונשנה במרווחים צריך להיות ≤0.4% ממשקל גוף בכל שבוע או ≤1% כל 2 שבועות, שהוערכו על ידי מדידות של המוגלובין בדם. בנוסף, המוגלובין,, triacylglycerol צום סוכר בדם הפלזמה (TG) וג הכוללרמות holesterol בדג זברה מבוגרת זכר ונקבה נמדדו. אנחנו גם מיושמים בשיטה זו כדי לחקור את חוסר הוויסות של חילוף חומרים של הגלוקוז בהשמנה יתר הנגרם דיאטה. שיטת איסוף דם זה תאפשר יישומים רבים, כולל גלוקוז וחילוף חומרים של שומנים ומחקרים המטולוגיות, אשר יגדילו את השימוש בדג הזברה כאורגניזם מודל מחלה אנושי.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

דג הזברה צוברת פופולריות גוברת כמודל ערך של מחלות בבני אדם משום שהאיברים והגנטיקה שלהם דומים לאלה של בני אדם 1,2. בתחום הביולוגיה התפתחותית, מחקרים רבים הראו כי דג הזברה ומופע אנושי מסומנות דמיון בhematopoiesis 3, עצירת הדימום 4,5, וmyelopoiesis 6. דג הזברה מבוגרת משמש גם ללימוד חיסוני 7, 8 ניווניות ומחלות הקשורות להשמנה 9 כי מניות אורגניזם מודל זה מסלולים משותפים עם אלה שיבשו במחלות בבני אדם. להשמנת יתר ומחלות הקשורות להשמנת יתר (סוכרת, הכבד וsteatosis steatohepatitis נטול אלכוהול וטרשת עורק), רמת סוכר בדם ורמות שומני דג הזברה נחקרו ביסודיות במספר דגמי השמנה מהונדס ומושרה דיאטה 10-13.

דגימת דם חוזרת ונשנית של בעלי חיים פרט להפחית את השימוש בבעלי חי ודצמrease הבדלי interindividual. עם זאת, אוסף מדגם חוזר ונשנה הוא קשה מבחינה טכנית בבעלי חיים קטנים כמו דג הזברה בגללם קטן יחסית נפח הדם וחוסר כלי נגישים בקלות. כמה שיטות לחד פעמי איסוף דם מדג הזברה פותחו, למרות שיש לי שיטות אלה חסרונות שלהם, כולל קטלני, נזק לרקמות קשורות ומוגבל נפח דם. לדוגמא, 1-5 דם μl ניתן לקצור מחתך רוחב של כ -0.3 סנטימטר באורך באזור של אב העורקים גב 5. עריפת ראש במספריים על ידי חיתוך דרך חגורת החזה יכול לאסוף 5-10 μl דם 10. שיטת דגימת דם נוחה נוספת היא אבלציה זנב 14. לנקב לב הוא שיטה חלופית פוטנציאלית אחד לאיסוף דם חוזר ונשנה של אותו דג, אבל הכמות קטנה מאוד שהושגה (כ 50 NL) עם הליך זה מגביל את מספר הניתוחים שיכולים להיות performed 11. בהתאם לכך, יש צורך בפרוטוקול חדש שיאפשר דגימה החוזרת ונשנית לא קטלנית דם, אשר תהיה מראש קריטי הכרחיות לאורגניזם זה להיות אורגניזם מודל סטנדרטי למחלות בבני אדם. טכניקה זו תאפשר לבדיקת תגובה תרופתית, גילוי של סמנים מולקולריים לאבחון, קביעת פרוגנוזה, והניטור של מחלות שונות, כגון מחלות מטבוליות, מחלות ניווניות וסוגים שונים של גידולים ממאירים.

לפיכך, אנו פיתחנו שיטה זעיר פולשנית לקבלת דם מדג הזברה סדרתי 15. כאן אנו מדגימים את הליך בחינה ויזואלית ולספק פרוטוקול מפורט לטכניקה זו. באמצעות שיטה זו, הערך הנורמלי המסתמך על פרמטרים שונים, בין המוגלובין, צום רמת סוכר בדם, ושומנים בדם של דג הזברה מבוגר בריאה הוערכו. בנוסף, אנחנו גם הערכנו האם שיטה זו מתאימה ללימודים שדורשים דגימות סידורי על ידי מ 'onitoring השינויים זמניים ברמות סוכר בדם במהלך ניסויי האכלת יתר.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

נהלי כל החיה אושרו על ידי ועדת האתיקה של אוניברסיטת מ.י., ובוצעו על פי תקנת רווחת בעלי החיים יפנית "חוק על רווחה וניהול של בעלי חיים '(משרד לאיכות הסביבה של יפן) ועמדו בהנחיות בינלאומיות.

1. הכנת המחט

הערה: כל הניסויים בוצעו בהרדמה, וכל המאמצים שנעשו כדי למזער את הסבל. להמתת חסד, דגים היו שקועים באמבט קרח-מים (5 חלקים מים חלק קרח / 1 ב- C ° ≤4) ל≥20 דקות.

  1. הכן את מחטי microcapillary זכוכית על ידי משיכת נימי זכוכית 1.0 מ"מ חיצוני בקוטר עם חולץ מחט (איור 1 א).
  2. חותך את קצות המחטים בעקיפין באמצעות מספריים קנס (איור 1). קוטר הקצה האידיאלי צריך להיות כ 100 - 200 מיקרומטר (איור 1 ג). אם diamete הקצהr הוא צר מדי, דם לא ייכנס למחט.
  3. ממיסים הפרין במלח בריכוז של 5 מ"ג / מיליליטר.
  4. הנח מחט חתוכה בסוף מזנקים של הרכבה צינור aspirator ולהחזיק את השופר בפה, או לחבר את המחט למתקן הנורה. לטבול את קצה המחט לתוך פתרון הפרין, וheparinize המחט על ידי שאיבה ונושב הפתרון (איור 1D ו1E).
    הערה: ההרכבה צינור aspirator שמשה במשך הקפאת זרע דג הזברה 16. צינור גומי ארוך יכול לעצור את כל דם עף לתוך פה. הגדרת מסנן באמצע הדרך של הצינור יכולה למנוע את הסכנות.
  5. אחסן את מחטי heparinized בצלחת פטרי 10 סנטימטרים ואוויר יבש במשך שעה לפחות 1. מספר גדול של מחטים יכול להיות מוכן מראש.

2. הרדמה

  1. הכן את פתרון ההרדמה במקרה פלסטיק קטן על ידי ערבוב 200 מיליליטר של מים דגים עם של 2-פנוקסיתנול 100 μl (2-pe). ריכוז סופי של ההרדמה הוא 500 עמודים לדקה.
    זהירות! יש 2-PE השפעה מהירה.
  2. הסר מספר רצוי של דגים (זן א.ב.) ממערכת הדם.
  3. השתמש ברשת כדי להעביר את הדגים להרדמה 1 - 2 דקות (איור 1F). שימו לב לדגים לשחות בהדרגה, להפיץ את סנפירי החזה אופקי, התנשפות, ויש לי תנועות operculum מהירות בתוך דקות 1.
  4. ככל שהזמן עובר, להתבונן הדגים נחו על הקרקעית של המקרה ולבסוף להפסיק לשחות. המטוס של הרדמה כירורגית יגיע כאשר הדגים מפסיק לנשום בכבדות ותנועות operculum הן איטיות. בשלב זה, דגים מוכנים לאיסוף דם.
  5. באמצעות רחפן להרים את הדגים בהרדמה מ2-PE ובעדינות מניח אותו על מגבת נייר ספוגה בהרדמה (איור 1G). לכסות את הראש של הדג בנייר טישו רך גם ספוג בפתרון 2-PE כדי למנוע יובש בעיניים ולהשתמש אחר נייר טישו רך ויבש, לעדינותלייבש את פני השטח הגוף.

אוסף 3. דם

  1. הנח מחט heparinized בסוף מזנקים של ההרכבה צינור aspirator (או מנפק הנורה) והחזק את סוף שופרו של ההרכבה צינור aspirator בפה.
  2. אחוז בסוף מזנקים והמחט יחד, ולהסיר בזהירות את הכף מפריעה לקצה המחט. הכנס את המחט ב30 - זווית ° 45 לאתר איסוף דם. הימנע לנקב של מערכת העיכול (איור 1H). במקרה של שימוש במתקן הנורה, לחץ על הנורה עם אגודל ואצבע אמצעית, ולחסום את החור בקצה של הנורה עם האצבע ראשונה, ולאחר מכן להכניס את המחט כפי שתואר לעיל.
    הערה: האתר לאיסוף דם הוא לאורך ציר הגוף והאחורי לטבעת באזור של אב העורקים הגב. אב העורקים הגב (DA) ווריד הקרדינל האחורי (PCV) הם רק הגחון לעמוד השדרה (איור 2).
  3. תתחיל למצוץשופר סוף ההרכבה צינור השאיפה כאשר המחט הרגישה נגיעה בעמוד השדרה. אם הדם לא עולה, להזיז את קצה המחט בעדינות ביד כדי לעודד את זרימת דם. שים לב שברגע שהדם עולה למחט, מייד הפסיק לרעוד ולמצוץ בעדינות (איור 1 ט). במקרה של שימוש במתקן הנורה, לשחרר את הלחץ של הנורה כדי לשאוב הדם.
  4. שים לב לדם יעלה לאט לתוך המחט באופן pulsatile ללא יניקה, אשר צפוי בגלל לחץ דם עורקים. לפיכך, אין זה הכרחי למצוץ אם המחט חודרת בצורה נכונה את העורק.
  5. להפסיק יניקה לאחר הנפח המתאים של דם נאסף. הסר את המחט מהדגים ולחץ על האתר לנקב באמצעות נייר טישו רך כדי לעצור כל דימום. שים לב לעצירת הדימום לאחר כ 10 - 20 שניות של לחץ אצבע (איור 1J).
  6. לאחר הדימום נעצר, להעביר את הדגים מייד חזרה לCLEמים חמים (~ 28 מעלות צלזיוס) טנק. עזרה הדגים להתאושש על ידי בעדינות מתערבל מים לכיוון הזימים עד שהוא מתחיל לשחות.
    הערה: שמור עד 5 דגי postsampling בטנק 2 L ולחבר את הטנק למערכת זרימת חמצן לדגים. תוספת של אנטיביוטיקה למים דגים אינה הכרחית. לשמור על הדגים עם דיור והאכלה רגילים.
  7. לגרש את הדם מהמחט על אזור נקי של חתיכה (איור 1 יא) של parafilm.
  8. למדוד סוכר בדם באמצעות כל Glucometer כף יד מסחרי (איור 1 ליטר).
    הערה: Glucometer משתמש אלקטרודה dinucleotide גלוקוז פלבין-דהידרוגנז אדנין ודורש נפח דגימה של 0.6 μl.
    1. הכנס מקלון בדיקה לחלוטין למטר וישירות לגעת בטיפת הדם. שים לב לתיקו הדם לתוך רצועת הבדיקה באופן אוטומטי ולקבל שניות הגלוקוז בדם תוצאת 5 על שטח התצוגה. רשום את התוצאה ולהשליך את רצועת הבדיקה. להשתמש במקלון בדיקה חדשה לכל מדידה.
  9. (שלב אופציונאלי) קח כמויות מדויקות של דם על ידי pipetting ולהעביר את הדם לצינור microcentrifuge לניתוחים נוספים (המוגלובין, triacylglycerol (TG), כולסטרול כללי, וכו '). במידת צורך, לדלל את כל הדם מדג אחד עם מי מלח. צנטריפוגה דגימות הדם במשך 3 דקות ב 680 XG ב RT ולקצור את הפלזמה. העבר את הפלזמה לתוך צינור חדש. בשלב זה, הוא מוכן לשימוש בניתוחים ביוכימיים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

שיטת איסוף דם זה גורם לפגיעה מינימאלית לדג זברה (<לנקב 1 מ"מ; איור 1J) ומניבה שיעור תמותה נמוך מאוד של 2.3%. בחנו את הנפח המרבי של דם שיכול להיות שנאסף מדג אחד והעריך את הקשר למשקל הגוף שלה (איור 3). מצאנו שמרבית הדם שנאסף הנפח היה מתואם באופן ליניארי עם משקל גוף (R = .813). הנפח הגדול של דם שנאסף מדג בודד (משקל גוף = 1.071 ז) היה 25 μl, והנפח הקטן ביותר היה 1.3 μl מדגים במשקל של 0.115 g. הדבר מצביע על כך הנפח המרבי של דם שנאסף תלוי במשקל הגוף של דג הזברה.

האנליזה ביוכימית של המוגלובין, רמת סוכר בדם, TG וכולסטרול כללי בוצעה לאחר איסוף דם (טבלת 1). דג הזברה (4-6 חודשים) זכר ונקבה בוגר הבריאים היו צמה במשך 18 שעות לפני collecti הדםעל. האנליזה ביוכימית גילתה כי הערך הנורמלי של המוגלובין (9.91 ± 0.49 g / dl זכר ו10.02 ± 0.48 g / dl נקבה) וTG (417 מ"ג ± 45 / dl 404 גברים ו± 35 mg / dl נקבה) לא היה שונה באופן משמעותי בין שתי הקבוצות. עם זאת, רמת הסוכר בדם בצום ורמות כולסטרול כללית של קבוצת הגברים (44 ± 3 מ"ג / ד"ל ו 365 ± 18 מ"ג / ד"ל, בהתאמה) היו נמוך באופן משמעותי (p <0.05) מאשר נשים הקבוצה (69 ± 3mg / dl ו 511 ± 52 מ"ג / ד"ל, בהתאמה).

בעוד הטראומה המינימלית לדג הזברה בשיטה הנוכחית מאפשרת דגימת דם החוזרת ונשנית מאותו האדם, את ההשפעות של ציור דם חוזר ונשנה לא הוערכו. חקרנו את ההשפעות הללו באמצעות מדידות של רמת ההמוגלובין בדם (איור 4). כפי שהראינו בפרסום קודם 15, דגי זכרים בוגרים במשקל של כ 0.5 גרם כל אחד חולקו לארבע קבוצות. דגימת דם חוזרת ונשנית(2 μl בכל פעם) של אותו דג בודד פעם ביום למשך 7 ימים (עבור הסכום כולל של שבע דגימות דם) הביא לירידה משמעותית (p <0.01) ברמות המוגלובין מ10.82 ± 0.78 g / dl ל2.38 ± 0.8 g / dl. הסרת 2 μl דם כל 2 ימים או אוסף יחיד של 5 μl בשבוע גם הניבה ירידה משמעותית (p <0.05) ברמות המוגלובין. בנוסף, שבוע לאחר אוסף יחיד של דגימת דם 2 μl, רמות המוגלובין היו מעט מתחת לנורמה (מ8.11 ± 1.15 g / dl ל7.15 ± 1.17 g / dl). היו לי רמות המוגלובין ללא תופעות לאחר אוסף יחיד של דגימת דם 2 או 5 μl לתקופת החלמה 2-שבוע. לפיכך, הגענו למסקנה כי חזרו אוסף של 2 μl דם (0.4% ממשקל גוף) בשבוע או 2-5 μl (.4-1% ממשקל גוף) לכל 2 שבועות מדגים בודדים יכול למנוע אנמיה איבוד דם.

בנוסף, אנו מוחלים בשיטה זו לחקר glucחילוף חומרים OSE. השינויים ברמות סוכר בדם של כל פרט בקבוצה הנורמלית הדיאטה (האכלת פעם ביום) וקבוצת האכלת יתר (חמש האכלות ביום) היו במעקב במשך תקופה של 5 שבועות. דג הזברה-fed דיאטה רגילה (דגים, B, C) הצגתי את רמות סוכר בדם יציבה כל הזמן, בזמן שדג הזברה המפוטמת (הדגים D, E, F) חוותה רמות גבוהה של גלוקוז בדם כבר בשבוע 1, ושמר על מצב היפרגליקמיה זה לאורך כל תקופת 5 השבועות המחקר (איור 5).

איור 1
איור 1:. מחטי זכוכית נוהל איסוף דם מדג הזברה למבוגר () הכינו באמצעות חולץ מחט. (ב) חיתוך קצה המחט באלכסון באמצעות מספריים עדינים. מחט חתוכה בקוטר טיפ של כ 135 מיקרומטר (C). בר סולם = 1 מ"מ. (ד) מכשירי איסוף דם: צינור aspiratorהרכבה (משמאל) ומתקן הנורה (מימין). חצים מצביעים מזנקים להחזיק את מחט microcapillary. ראש החץ מראה את שופרו של ההרכבה צינור aspirator. המחט ממוקמת בסוף מזנקים לפני איסוף דגימה. (ה) Heparinizing המחט. (F) בהרדמה דגים. (G) מניחים את הדגים על מגבת נייר ספוגה בהרדמה. (H) הכנס את המחט בזווית של ° 30-45 לאתר איסוף דם. דם (אני) עולה למחט. דימום (J) הפסיק ו< 650 מיקרומטר לנקב הוא הקיף ומוצג בהגדלה גבוהה. (K) לגרש את הדם מהמחט על גבי פיסת parafilm. מדידה של רמת סוכר בדם באמצעות מד גלוקוז (L).

איור 2
(B) הם אב העורקים הגב ווריד קרדינל אחורי; אלה נמצאים הגחון לשדרה. S, עמוד השדרה; התובע, אב העורקים גב; PCV, וריד קרדינל אחורי.

איור 3
איור 3:. מערכת היחסים של נפח המרבי של דגימת דם ומשקל הגוף כוללת של 83 דג הזברה (ישנה 2-6 חודשים, 42 גברים ו -41 נשים) עברו איסוף דם מקסימאלי.

איור 4
איור 4:. שינויים ברמות המוגלובין על פני תקופה 1-שבוע עם דגימת דם חוזרת ונשנית 2מדגם μl דם נאסף מאותו הדג הבודד ביום, פעם ב 2 ימים, פעם בשבוע או פעם בשבוע 5 μl (n = 5). רמות המוגלובין של כל קבוצה לפני איסוף דם (יום 0, בר לבן) ואחרי דגימת דם חוזרת ונשנית (יום 7, בר אפור) מוצגות. ערכים הם אמצעי ± סטיית ההתקן של הממוצע (SEM). * P <0.05, ** p <0.01 לעומת היום 0. מעובד מתוך נ"צ. 15.

איור 5
איור 5:. שינויים בריכוזי הגלוקוז בדם בצום של שש פרט זכר דגים על פני תקופה של 5 שבוע הדגים, B ו- C היו קבוצת הדיאטה הרגילה. דגי D, E ו- F היתה הקבוצה המפוטמת.

טבלת 1
טבלת 1: רמות המוגלובין, גלוקוז בדם, TG וכולסטרול כללי לזכר ונקבה דג הזברה 4 - 6 חודשים של גיל.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

אנו מציגים כאן פרוטוקול מפורט לקבלת סדרתי דם מדג הזברה מבוגרת. שיטה זו היא פשוטה לביצוע ואנחנו משתמשים בו במעבדה על בסיס יומי. שיטת איסוף דם זה מבוססת על החדרת מחט נימי זכוכית לתוך אב העורקים הגב של דג הזברה. במהלך הליך זה, זה קריטי להיות זהיר כדי לא לקטוע את עמוד השדרה כי זה הקריטריון לחיפוש לאב עורקי הגב. צמצום הפגיעה בעמוד השדרה ישפר את שיעור ההישרדות. למרות שטכניקה זו היא פשוטה וקלה להורים, יש שיטות הטובות ביותר שיכול להבטיח הצלחה גבוהה ושיעורי הישרדות. חוקר מיומן ייקח 1-2 דקות לבצע את הליך איסוף דם (פרוטוקול 2.3-3.6, שהוא הזמן שהדגים הוא מחוץ למים). כדי לחסוך זמן בניסויים בקנה מידה גדולה, גישה כפול צוות מומלץ לבצע איסוף דם. לדוגמא, חוקר אחד יכול לבצע דגימת הדם, ואילו שנייה יכולה להתמודדדגים, לבצע ההרדמה ולנתח את הדם שנאסף (מדידת רמת סוכר בדם, הקלטה, או העברת הדם לצינור microcentrifuge, וכו ').

באמצעות שיטה זו, שהראינו כי הדם המרבי המדגם שיכול להיות שנאסף מדגים בודדים נפח הוא כ 2% ממשקל גוף ללא קשר למין 15, המצביע על כך במחזור הכולל נפח הדם של דג הזברה הוא יותר מ -2% ממשקל גוף. מחקרים קודמים הראו כי דגי חוליות (SPP דגי גרם. וSalmo gairdneri gairdneri) יש בסך הכל דם נע בין 1.8-3.8% ממשקל גוף 17,18 נפח, ובכך אנו צופים כולל מחזור נפח הדם של דג הזברה להיות 2-3.8% מ משקל גוף בדג זברה. לאיסוף דם בודד, אנו ממליצים בחום שדגימת דם צריכה להתבצע מגיל 3 חודשים או> דג הזברה משקל גוף 0.3 G להשיג ≥5 μl דם. זה לאeworthy שכמחצית מדג הזברה שרדה למרות 2% ממשקל הגוף של דמם הוסרו, אשר גילה כי דג הזברה יכולה להתמודד היטב עם איבוד דם.

היתרון המשמעותי ביותר של שיטה זו הוא שהיא מאפשרת דגימת דם החוזרת ונשנית של אותו אדם. אנחנו נקבע את ההיקף ותדירות דגימת דם האופטימלי על ידי מדידת השינויים ברמות המוגלובין (איור 4). אנו ממליצים כי ההיקף ומרווח לדגימת דם חוזר ונשנה להיות ≤0.4% ממשקל גוף בשבוע ו≤1% ממשקל גוף לכל 2 שבועות כדי להימנע מאנמיה אובדן דם ומוות מדמם. מסקנה זו עולה בקנה אחד עם ההנחיות בפועל לדגימת דם חוזרת ונשנית של בעלי חיים מודל מכרסם 19,20.

אם הניסוי מאפשר את ההקרבה של דג הזברה, המחט יכולה להיות מוכנסת לתוך עמדה לאורך ציר הגוף, אחורית לזימים באזור של אב העורקים הגב כצרה."eshooting או שיטה חלופית. אתר זה ליד הלב והאב העורקים הוא גדול יחסית, אשר יכול להפוך את הליך איסוף דם קל יותר.

דג הזברה שימשה בהצלחה בדוגמנות התנאים הקשורים של תסמונות המטבולית, כוללים סוכרת 21,22, ההשמנה 23,24, מחלת כבד שומנית 25 וטרשת עורקת 26. בנוסף, אנו מוחלים בטכניקה זו כדי לצפות בחילוף חומרים של הגלוקוז בהשמנה יתר הנגרם דיאטה (איור 5). בדומה ליונקים, דג הזברה גם פיתח את חילוף החומרים גליקוליפיד חריג כאשר קבל תזונה עתירה שומן. השינויים בצום גלוקוז של כל פרט הדם הראו הבדלים אישיים בתגובה להאכלת יתר דומה לזה שבבני אדם 15,27. תוצאה זו מצביעה על כך שחקירה של השינויים זמניים בפרמטרים ביוכימיים דם של דגים בודדים תספק הזדמנות טובה כדי לקבוע את ההבדלים האישיים בהפרעות מטבוליות such כמו השמנת יתר וסוכרת מהסוג 2, ובכך אישר נוסף הערך שלה כמודל חיה למחלות של בני אדם.

בסך הכל, פיתחנו שיטה חדשנית לאיסוף דם חוזר ונשנה של דג הזברה מבוגרת. שיטה זו היא חיונית למחקר דג הזברה דורש דגימות דם חוזרות ונשנות, כגון מחקרים של toxicokinetics, פרמקוקינטיקה, והמטולוגיה. יתר על כן, שיטת דגימת דם חוזרת ונשנית זה יכול להיות מיושמת גם לדגים באקווריום הקטן אחרים במחקר ביו-רפואי, למשל, Medaka (latipes Oryzias) או Xiphophorus (Xiphophorus helleri).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Glass capillaries with filament Narishige GD-1 1.0 mm outer diameter.
Needle puller Narishige PC-10 To produce the needles
Heparin Wako Pure Chemical Industries 081-00136 For heparinization
Aspirator tube assembly Drummond 2-040-000 For blood collection
Bulb dispenser Drummond 1-000-9000 For blood collection
2-phenoxyethanol Wako Pure Chemical Industries 163-12075 For anesthetizing the fish
DRI-CHEM3500V Fujifilm - For hemoglobin measurement
DRI-CHEM Slides Fujifilm Hb-WII For hemoglobin measurement
Glutest Neo Super Sanwa Kagaku Kenkyusho - For bood glucose measurement
Wako L-type TG kit Wako Pure Chemical Industries 464-44201 For TG measurement
Wako L-type CHO kit Wako Pure Chemical Industries 460-44301 For total cholesterol measurement
Parafilm M Alcan Packaging PM996 To expel the blood on

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lieschke, G., Currie, P. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nat Rev Genet. 8, (5), 353-367 (2007).
  2. Penberthy, W. T., Shafizadeh, E., Lin, S. The zebrafish as a model for human disease. Front Biosci. 7, d1439-d1453 (2002).
  3. Stachura, D. L., Traver, D. Cellular dissection of zebrafish hematopoiesis. Methods Cell Biol. 101, 75-110 (2011).
  4. Jagadeeswaran, P., Sheehan, J. P. Analysis of blood coagulation in the zebrafish. Blood Cells Mol Dis. 25, (3-4), 239-249 (1999).
  5. Jagadeeswaran, P., Sheehan, J. P., Craig, F. E., Troyer, D. Identification and characterization of zebrafish thrombocytes. Br J Haematol. 107, (4), 731-738 (1999).
  6. Lieschke, G. J., Oates, A. C., Crowhurst, M. O., Ward, A. C., Layton, J. E. Morphologic and functional characterization of granulocytes and macrophages in embryonic and adult. Blood. 98, (10), 3087-3096 (2001).
  7. Iwanami, N. Zebrafish as a model for understanding the evolution of the vertebrate immune system and human primary immunodeficiency. Exp Hematol. 42, (8), 697-706 (2014).
  8. Babin, P. J., Goizet, C., Raldua, D. Zebrafish models of human motor neuron diseases: advantages and limitations. Prog Neurobiol. 118, 36-58 (2014).
  9. Seth, A., Stemple, D. L., Barroso, I. The emerging use of zebrafish to model metabolic disease. Dis Mod Mech. 6, (5), 1080-1088 (2013).
  10. Eames, S. C., Philipson, L. H., Prince, V. E., Kinkel, M. D. Blood sugar measurement in zebrafish reveals dynamics of glucose homeostasis. Zebrafish. 7, (2), 205-213 (2010).
  11. Moss, J. B., et al. Regeneration of the pancreas in adult zebrafish. Diabetes. 58, (8), 1844-1851 (2009).
  12. Oka, T., et al. Diet-induced obesity in zebrafish shares common pathophysiological pathways with mammalian obesity. BMC Physiol. 10, (21), (2010).
  13. Chu, C. Y., et al. Overexpression of Akt1 enhances adipogenesis and leads to lipoma formation in zebrafish. PLoS One. 7, (5), e36474 (2012).
  14. Velasco-Santamaría, Y. M., Korsgaard, B., Madsen, S. S., Bjerregaard, P. Bezafibrate, a lipid-lowering pharmaceutical, as a potential endocrine disruptor in male zebrafish (Danio rerio). Aquat Toxicol. 105, (1-2), 107-118 (2011).
  15. Zang, L., Shimada, Y., Nishimura, Y., Tanaka, T., Nishimura, N. A novel, reliable method for repeated blood collection from aquarium fish. Zebrafish. 10, (3), 425-432 (2013).
  16. Carmichael, C., Westerfield, M., Varga, Z. M. Cryopreservation and in vitro fertilization at the zebrafish international resource center. Methods Mol Biol. 546, 45-65 (2009).
  17. Thorson, T. B. The partitioning of body water in Osteichthyes: phylogenetic and ecological implications in aquatic vertebrates. Biol Bull-US. 120, 238-254 (1961).
  18. Conte, F. P., Wagner, H. H., Harris, T. O. Measurement of blood volume in the fish (Salmo gairdneri gairdneri). Am J Physiol. 205, 533-540 (1963).
  19. Diehl, K. H., et al. A good practice guide to the administration of substances and removal of blood, including routes and volumes. J Appl Toxicol. 21, (1), 15-23 (2001).
  20. Nahas, K., Provost, J. -P., Baneux, P. H., Rabemampianina, Y. Effects of acute blood removal via the sublingual vein on haematological and clinical parameters in Sprague-Dawley rats. Lab Anim. 34, (4), 362-371 (2000).
  21. Curado, S., et al. Conditional targeted cell ablation in zebrafish: a new tool for regeneration studies. DevDyn. 236, (4), 1025-1035 (2007).
  22. Andersson, O., et al. Adenosine signaling promotes regeneration of pancreatic beta cells in vivo. Cell Metab. 15, (6), 885-894 (2012).
  23. Hiramitsu, M., et al. Eriocitrin ameliorates diet-induced hepatic steatosis with activation of mitochondrial biogenesis. Sci Rep-UK. 4, 3708 (2014).
  24. Zang, L., Shimada, Y., Kawajiri, J., Tanaka, T., Nishimura, N. Effects of Yuzu (Citrus junos Siebold ex Tanaka) peel on the diet-induced obesity in a zebrafish model. J Funct Foods. 10, 499-510 (2014).
  25. Schlegel, A. Studying non-alcoholic fatty liver disease with zebrafish: a confluence of optics, genetics, and physiology. Cell Mol Life Sci. 69, (23), 3953-3961 (2012).
  26. Stoletov, K., et al. Vascular lipid accumulation, lipoprotein oxidation, and macrophage lipid uptake in hypercholesterolemic zebrafish. Circ Res. 104, (8), 952-960 (2009).
  27. Thomas, C. D., et al. Nutrient balance and energy expenditure during ad libitum feeding of high-fat and high-carbohydrate diets in humans. Am J Clin Nutr. 55, (5), 934-942 (1992).
איסוף דם חוזרים ונשנים לבדיקות דם בדג הזברה למבוגרים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zang, L., Shimada, Y., Nishimura, Y., Tanaka, T., Nishimura, N. Repeated Blood Collection for Blood Tests in Adult Zebrafish. J. Vis. Exp. (102), e53272, doi:10.3791/53272 (2015).More

Zang, L., Shimada, Y., Nishimura, Y., Tanaka, T., Nishimura, N. Repeated Blood Collection for Blood Tests in Adult Zebrafish. J. Vis. Exp. (102), e53272, doi:10.3791/53272 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter