GL261 glioma cells provide a useful immunocompetent animal model of glioblastoma. The goals of this protocol are to demonstrate proper techniques for monitoring intracranial tumor growth using in vivo bioluminescence imaging, and to verify the utility of luciferase-modified GL261 cells for studying tumor immunology and immunotherapeutic approaches for treating glioblastoma.
In contrast to commonly reported human glioma xenograft animal models, GL261 murine glioma xenografts recapitulate nearly all relevant clinical and histopathologic features of the human disease. When GL261 cells are implanted intracranially in syngeneic C57BL/6 mice, the model has the added advantage of maintaining an intact immune microenvironment. Stable expression of luciferase in GL261 cells allows non-invasive cost effective bioluminescence monitoring of intracranial tumor growth. We have recently demonstrated that luciferase expression in GL261 cells does not affect the tumor growth properties, tumor cell immunomodulatory cytokine expression, infiltration of immune cells into the tumor, or overall survival of animals bearing the intracranial tumor. Therefore, it appears that the GL261 luciferase glioma model can be useful in the study of novel chemotherapeutic and immunotherapeutic modalities. Here we report the technique for generating stable luciferase expression in GL261 cells and how to study the in vitro and in vivo growth of the tumor cells by bioluminescence imaging.
Malignant glioma is the most common and most lethal human brain tumor. Even when treated with maximal surgical resection, radiotherapy, and chemotherapy, median survival remains 15-20 months at major brain tumor referral centers1, 2, 3. The most aggressive form of malignant glioma, glioblastoma, is characterized by mitotic figures, neovascularization, invasion into adjacent brain, and pseudopalisading necrosis. Orthotopic brain tumor xenografts using human brain tumor cells have served an essential function in neuro-oncology research and facilitated pre-clinical translation for testing of new agents, prior to entry into human clinical trials. Whereas most of human xenograft models recapitulate many features of the human disease, a fundamental limitation with all human-based xenograft model systems is the use of immunodeficient animals4.
The absence of an intact host response clearly modifies tumor growth both in terms of tumor morphology, and efficiency of engraftment. While certain assumptions are acceptable in the interpretation of results from xenografted models, achieving relevant conclusions in the area of therapeutic assessment is a challenge. Certain fundamental biologic features are likely to be similar in immunodeficient and immunocompetent animals, but others such as tumor associated inflammation, tissue invasion, response to injury are probably very different. In contrast, GL261 is a chemically induced murine glioma cell line that accurately recapitulates glioma when implanted into the brains of immunocompetent syngeneic C57BL/6 mice5. Similar to the human disease, intracranial tumor growth rapidly and reproducibly leads to neurologic symptoms and animal demise6-10.
Subcutaneous tumor growth can be directly measured. Intracranial tumor growth can only be measured with animal sacrifice or with costly imaging studies. Stable expression of the enzyme luciferase allows non-invasive and cost-effective intracranial bioluminescence imaging11. Bioluminescence of luciferase transfected GL261 cells correlates well with intracranial tumor growth. We have recently directly compared GL261 to luciferase modified GL261 cells and demonstrated no difference in in vitro growth and invasion, immunologic cytokine profile, in vivo survival of intracranial tumor bearing C57BL/6 mice, or immune cell infiltrate. This technique is applicable to glioblastoma preclinical studies which involve non-invasive monitoring of tumor growth.
GL261 murina gliomceller, när de implanteras intrakraniellt i syngena immunokompetenta C57BL / 6-möss, erbjuder flera fördelar jämfört med gliom xenograft djurmodeller för mänskliga. Många av xenotransplanterat tumörer växa som inkapslade lesioner som inte exakt rekapitulera det invasiva mänskliga sjukdomen. Däremot GL261 tumör visar inte bara invasion i angränsande hjärnan, men även kärlnybildning, mitotiska siffror och djup nekros 7. Viktigast när man studerar tumörimmunologi eller immunoterapeutiska strategier 15, 16, C57BL / 6 mus behåller ett intakt immunsystem 8. Tidigare studier har visat robust uttryck av det immunsuppressiva cytokinet TGF-β och intrakraniella tumörer innehåller immunosuppressiva T-regulatoriska celler liknande humana glioblastom 9, 10.
Den enkla teknik som beskrivs här möjliggör stabil expression av luciferas från GL261 celler. Vi har nyligen rapporterat simiLAR in vitro och in vivo-tillväxten av GL261.luc celler jämfört med GL261 celler, förutom liknande tumör histologiska egenskaper och immuncell infiltrera 17. GL261.luc celler stabilt uttrycka luciferas som katalyserar oxidationen av substratet luciferin omvandlar kemisk energi till fotoner och därför detekterbart ljus. Luciferin kan administreras säkert till djur och korsar blod-hjärnbarriären efter intraperitoneal eller intravenös injektion. I små forskningsdjur, såsom möss, kan den bioluminescens detekteras externt på ett icke-invasivt sätt 11. Därför kan tumörtillväxt seriellt bedömas utan behov av djuroffer eller kostsamma MRI eller CT.
De kritiska stegen i protokollet innebär inte bara lentiviral transduktion, men också kontroll av stabilt uttryck av luciferas in vitro innan några in vivo-försök. Förlust av transduktion kan behöver utförasre upprepa lentivirus infektion. Införande av en antibiotikaresistensgen i expressionsvektorn kan också användas för att selektera för luciferasuttryck. Noggrann teknik krävs för intrakraniell implantation att reproducerbart placera en konsekvent antalet celler i en exakt anatomisk plats för att möjliggöra jämförelser av olika behandlingsgrupper. En stor skillnad mellan den aktuella studien och tidigare studier av luciferas som uttrycker GL261 celler är användningen av fria händer teknik för att implantera celler jämfört med användning av en stereotaktisk ram 18. Vi har tidigare visat konsekventa implantation resultat med den fria handen tekniken 19. Fördelen med den fria handen teknik är förmågan att utföra med hög kapacitet analyser av olika behandlingsmedel. I våra händer, kan vi implantera cirka 60 djur i en timme.
Efter att behärska tekniken, de framtida tillämpningar av tekniken är obegränsade. Som GL261 demonstratörerrar förhöjda mitoser och snabb tumörtillväxt liknar mänsklig glioblastom, kan antiproliferativa behandlingar utvärderas. På liknande sätt kan anti-invasiva och antiangiogena terapier användas som GL261 tumörer är invasiva och angiogen. Försiktighet bör iakttas vid bedömningen av effekten av kemoterapeutiska medel som syftar till att mänskliga mål. Jämfört med tidigare studier där man använt humana glioblastom xenografter uttrycker luciferas 20, skulle detta betraktas som en begränsning av vår modell. Dessutom kan studerade effekten av immunterapeutiska strategier för tumörtillväxt i GL261 xenotransplanterat modellen.
The authors have nothing to disclose.
We would like to thank Rajwant Kaur for technical assistance. We would like to thank Maxwell Tom for assistance with lentivirus preparation. This work was supported by the Reza and Georgianna Khatib Endowed Chair in Skull Base Tumor Surgery at UCSF, and the Michael J. Marchese Professor and Chair at Northwestern University.
D-Luciferin, Potassium Salt | Gold Biotechonology | LUCK-100 | Store away from light |
Living Image Software | Caliper Life Sciences | Contact for Quote | none |
Xenogen Lumina | Caliper Life Sciences | Contact for Quote | none |
24-well; Standard tissue culture; flat-bottom | Falcon | 353047 | |
CellTiter 96® AQueous One Solution Cell Proliferation Assay | Promega | G3582 | none |
Synergy 2 Multi-Mode Reader | BioTek | Contact for Quote | none |
96 well Assay Plate, Black Plate, Clear bottom with Lid, Tissue culture Tretaed | Coster | 3603 | none |
Ketaset | Pfizer | NDC 0856-2013-01 | Control substance |
Xylazine | Sigma-Aldrich | 23076-35-9 | none |
28G Needle (with syringe) | Fisher | 22-004-270 | AKA Insulin Syringe |
2% Chlorhexidine | Fisher | NC9756995 | AKA “Nolvasan” |
3% Hydrogen Peroxide | Fisher | H312P-4 | Store away from light |
Ophthalmic Ointment | Cardinal Health | 1272830 | AKA “Akwa Tears” |
25G 1 1/2 needle | BD Becton Dickinson | 305127 | none |
Disposable Scalpels | Feather | 2975 | No. 21 |
Gauze | Fisher | 22028563 | Autoclave before use |
Heating Pad | Dunlap | HP950 | none |
Skin Stapler, Staples, Remover | Stoelting | 59020 | none |
PDI Alchol Prep Pads | Fisher | 23-501-711 | none |
Reflex 7mm Wound Clips 100 pack | Brain Tree Scientific, INC | 203 1000 | Autoclave before use |
Reflex 7mm Wound Clip Applier | Brain Tree Scientific, INC | 204 1000 | Autoclave before use |
Reflex 7mm Wound Clip Remover | Brain Tree Scientific, INC | 205 1000 | none |
Single Ended Round Tip Swab with Wood handle | Qosmedix | 10107 | Autoclave before use |
Hanks' Balanced Salt Solution without Ca2+ and Mg2+ (HBSS) | Gibco | 14170-112 | none |
Hamilton Syringe | Hamilton | 80300 | none |
FuGENE 6 Transfection Reagent | Promega | E2961 | none |
Bone Wax | Harvard Apparatus | 599864 | none |