Introduction
腺病毒包含复制在被感染细胞核的双链DNA基因组。当病毒DNA进入细胞核，它局部化相邻的PML核机构1。随着病毒的早期基因的表达，核架构大幅改组，诱导形成病毒性微环境，被称为病毒复制车厢（RC）2。由于腺病毒（广告）RC是网站，病毒基因组复制和病毒晚期基因表达发生，他们提供了一个环境，招募所有参与这些过程中必要的病毒和细胞的因素。有趣的是，各种细胞蛋白负责细胞抗病毒反应，如DNA损伤反应的，先天免疫应答和抑制肿瘤是增选到这些病毒网站2。因此，广告RC可以考虑监管中心之一，促进高效病毒复制，同时伴随调节蜂窝的抗病毒反应，表明这些结构是关键的病毒 - 宿主细胞相互作用的理解。尽管如此，钢筋混凝土形成的分子机制，其组合物和相关活动是知之甚少。
腺病毒的RC，以及RC从复制在核中的其他DNA病毒不相关联的膜，而相比之下，细胞质的RC 3。此外，这些病毒诱导的结构是可能的蛋白质和核酸的待全部由。 RC形成在感染的细胞的RNA病毒（通常被称为病毒工厂）已被分离，同时它们的细胞质定位的和膜结合的状态，这促进了对它们的详细的形态，功能和生化特征4的优势。
据我们所知，核病毒的RC没有被隔离，这可能是由于所述的核内米的核结构和不存在的复杂性embranes这将有利于他们的孤立。他们的研究一直依靠而不是在免疫荧光显微镜，荧光原位杂交和透射电子显微镜。然而，尽管固有的隔离亚核结构复杂，其它核领域，如核仁和Cajal间机构一直在5,6前隔离。因为核仁和RC都是由蛋白质和核酸的，并且具有0.5之间的直径 - 5微米，我们推测，RC也应该适合于隔离。因此，为了更精确地表征相关联的RC的分子组成和功能，我们建立了一种新方法，以分离富含RC亚核级分。为此，我们制备使用速度梯度和蔗糖垫类似程序用于分离核仁7或其他核结构域6子核级分，并建立了无细胞系统，使分子组合物的研究和有关的活动RC。因此这种技术应该提前的病毒 - 宿主细胞相互作用的理解，并表示一个强大的工具，也应有助于RC的详细分析从该复制在核中的其他病毒和诱导形成类似的尺寸的复制隔间的那些形成在腺病毒感染的细胞，如，疱疹病毒，乳头状瘤病毒或多瘤病毒。
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Protocol
1. HFF细胞培养和Ad-感染
- 传播的Ad5 WT病毒在HEK-293细胞和滴度荧光形成单元（FFU）上HFF细胞单层如前面8中所述 。
- 生长人类包皮成纤维细胞（HFF）的10ml DMEM / 10％胎牛血清（FBS）中无菌培养100mm平皿在37ºC和5％ 的 CO 2的加湿培养箱中。确定使用Neubauer室通过在4个16平方集计数细胞的细胞数量。通过计算细胞在4个16平方集的平均数和10 4乘以该数而得到每毫升细胞数，对于包括在步骤1.3每次感染后，用1×10 7 HFF细胞。
- 模拟侵染或感染HFF细胞在用1ml的Ad5的在每个培养皿的DMEM，在30聚焦的MOI 100mm组织培养皿5型腺病毒（Ad5的）野生型（WT）（H5pg4100 8）形成单位，或FFU每个细胞。孵育2小时啊umidified细胞培养培养箱中37ºC和5％的CO 2，小心摇动菜每15分钟，以确保病毒接种物在细胞上均匀分布。在此时间后，除去培养基并加入新鲜的DMEM补充有10％FBS和在湿润的细胞培养培养箱孵育16，24或36小时，在37℃，并 5％的CO 2。继续执行步骤2.1。
2.制备亚核馏分富含有腺病毒RC
- 收获的Ad5感染或模拟感染HFF细胞与细胞刮收集细胞在无菌离心管。确定细胞数如在步骤1.2。使用1×10 7个细胞用于在步骤1.3中指定的每个时间感染后。
- 离心细胞，在220×g离心，4ºC5分钟。
- 重悬在冰冷的PBS将细胞沉淀（137毫摩尔NaCl，2.7毫米氯化钾，10mM的磷酸氢二钠和1.8mM的KH 2 PO 4）。洗涤细胞沉淀S使用5毫升冰冷PBS每次洗涤3次。为了这个目的，离心细胞，在220×g离心，4ºC5分钟，倾析并弃去上清液（SN），并且重悬细胞沉淀通过温和移液。
- 破坏细胞膜，重悬在700细胞沉淀μ升冰冷的低渗缓冲液（10mM HEPES pH为7.9，10mM的氯化钾，1.5mM的MgCl 2的，0.5mM的DTT，20μ微克/毫升苯甲磺酰氟（PMSF） ，半胱氨酸，丝氨酸，苏氨酸和天冬氨酰蛋白酶抑制剂的混合物包括10μ克/毫升牛胰蛋白酶抑制剂，10μ微克/毫升胃蛋白酶抑制素A和10μ克/ 毫升 N-乙酰基-L-亮氨酰-L-亮氨酰-L- -argininal），并让细胞膨胀在冰上3小时。
- 裂解使用均化器以宽松的A型聚四氟乙烯杵的细胞。执行80 DOUNCE笔画和监视器样品每20笔通过亮视野显微镜，以确保所有细胞已被溶解，但该核具有n个加时赛被损坏或破裂。
- 离心细胞匀浆在300×g离心，4ºC5分钟。存储SN作为在-20 C在离心管中的胞质级分。
- 从细胞核除去细胞碎片，重悬沉淀在750μ升溶液1（S1）的（0.25M蔗糖，10mM的MgCl 2的20μ克/毫升PMSF，半胱氨酸，丝氨酸，的混合物苏氨酸和天冬氨酰蛋白酶抑制剂，包括10 μ克/毫升牛胰蛋白酶抑制剂，10μ微克/毫升胃蛋白酶抑制素A和10μ克/ 毫升 N-乙酰基-L-亮氨酰-L-亮氨酰-L- argininal）和层以上的溶液2等体积（S2） （0.35M的蔗糖，0.5mM的MgCl 2的，20μ克/毫升PMSF，半胱氨酸，丝氨酸，苏氨酸和天冬氨酰蛋白酶抑制剂，包括10μ克/ ml牛胰胰蛋白酶抑制剂，10μ微克/毫升胃蛋白酶抑制素A和10μ的混合物克/ 毫升 N-乙酰基-L-亮氨酰-L-亮氨酰-L- argininal）。 CENTRifuge在1400×g离心，4ºC5分钟。
- 丢弃使用微量的SN。避免干扰颗粒。
- 重悬在含有750μ升S2的分离的细胞核沉淀。
- 为了分离富含腺病毒RC（RCF）亚核分数，超声处理悬浮细胞核用超声波浴，用两个5分钟的脉冲，或直到所有核裂解通过亮视野显微镜观察到。根据需要将样本保持在或低于4℃在超声浴用冰。
- 层的超声处理的核以上的溶液3（S3）（0.88蔗糖，0.5mM的MgCl 2的）和离心机以3,000×g离心，4ºC10分钟的等体积。存放1.5毫升上清液作为核质馏分（NPL）在-70ºC。悬浮颗粒在700μ升S2的和存储的RCF在-70ºC。
RCF 3. Western印迹分析
注：对于不良贷款和RCF分数西部印迹分析等预留640 微升的不良贷款和300μl对于RCF从步骤2.11中获得的总体积。
- 混合15μ升在Laemmli缓冲液2倍每个亚核级分（4％SDS，20％甘油，10％2-巯基乙醇，0.004％溴酚蓝，0.125摩尔Tris盐酸pH6.8）中并煮沸，在95°C下5分钟。加载样品中10％的十二烷基硫酸钠 - 聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）变性凝胶和分离蛋白1.5小时，在20毫安（mA）的。
- 通过以400mA电印迹1.5小时到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜转移蛋白。
- 方框膜进行2小时，在使用3％脱脂奶粉的PBS室温。
- 孵育O / N在4ºC与针对病毒的E2A DNA结合蛋白（B6-8 9）第一抗体以1：500稀释在PBS / 0.3％脱脂奶粉。
- 洗涤膜3次，用PBS / 0.1％吐温20 10分钟。
- 孵育小鼠抗IgG二的膜耦合到辣根过氧化物酶（HRP）tibody以1：10,000稀释在PBS中2小时，在室温。
- 用PBS洗膜3次/ 0.1％吐温20 10分钟。
- 开发使用增强的化学发光和X光片的膜。
4.病毒DNA检测RCF
注：对于从不良贷款和RCF部分DNA的提取，使用210μl对于不良贷款和100μl对于在步骤2.11中获得的总体积的RCF。
- 在55ºC孵育子核级分1小时用蛋白酶K为1mg / ml和0.5％吐温20。
- 通过温育样品10分钟，在95℃下失活的蛋白酶K。
- 离心样品在20000×g离心，在室温2分钟。
- 收集SN。沉淀DNA与1/10体积的3M醋酸钠和异丙醇中的一个体积，O / N在4℃下。
- 离心样品在20000×g离心，在室温10分钟。
- 丢弃SNü唱微量。在20000×g离心，4℃5分钟洗涤用70％乙醇，离心沉淀。
- 重悬的DNA在10μ升的10mM的Tris-盐酸pH 7.4的
- 使用分光光度计通过测量光密度（OD）在260nm处定量的DNA。
- 为了扩增病毒DNA，使用100ng的DNA的使用Taq DNA聚合酶在标准PCR反应各亚核级分在25μ升反应体积的用引物，其允许主要晚期转录单位内的区域的放大，从核苷酸7273至核苷酸7353（81基点）（FW：GAGCGAGGTGTGGGTGAGC; RV：GGATGCGACGACACTGACTTCA）。使用下面的循环条件：初始变性3分钟，在95°C下，之后20个循环的扩增（在95°C下，退火1分钟，在62ºC和延伸30秒，在72ºC1分钟）和用于最终延伸步骤3分钟72ºC。
- 运行PCR产物在2％琼脂糖凝胶上，在90V。色漆乙锭溴化物在0.5μ克/毫升的终浓度和可视化的DNA以证实病毒DNA富集区域合作框架。处理溴化乙锭格外小心，并始终确保要戴手套，因为这种化合物是一种有效的诱变剂。根据制度规定进行处置的溴化乙锭。
5.晚期病毒mRNA检测的RCF
注：对于从不良贷款和RCF部分RNA分离，用640μl对于不良贷款和300μl对于RCF从步骤2.11中获得的总体积。
- 使用Trizol根据制造商的说明书分离自亚核级分的RNA。重悬RNA在50μ升DEPC（diethilpyrocarbonate）处理过的水。
- 量化使用分光光度计测量的OD 260nm处的核糖核酸（大约3μg的获得）。存放RNA在50毫微克/ 微升分装置于-70ºC。
- 检查纯化RNA为不存在DNA污染的通过进行在不存在逆转录酶（RT）的控制PCR反应中，用5纳克总RNA，并且在步骤4.9中描述的循环的条件。
- 如果DNA污染不存在任何扩增子应来制造。如果DNA污染存在，孵育样品与10单位的DNase I U RNA酶抑制剂，10，0.1M的Tris-HCl pH值8.3，0.5M KCl和15mM的MgCl 2的30分钟，在37ºC。继续执行重新分离RNA如在步骤5.1。
- 分析相关的RCF病毒mRNA，放大100纳克RNA的通过RT-PCR，使用设计用于检测从不同的基因家族（表1）的腺病毒晚期mRNA的引物各亚核级分。
- 进行反转录（RT）下，用M-MuLV的逆转录酶在20μ升反应容积为1小时，在42ºC并在70ºC10分钟用100纳克的RNA，来自每个亚核级分在一个标准的RT反应。
- 对于扩增，使用1μ升在PCR反应中，将cDNA的如在步骤4.9。使用下面的循环条件：初始变性3分钟，在95°C下，接着扩增25个循环（在95°C下1分钟，退火在30秒，在72ºC 于表1和延伸规定的温度1分钟）和一为3分钟，在72ºC最终延伸步骤。
- 运行RT-PCR产物在2％琼脂糖凝胶上，在90五染色凝胶用溴化乙锭，在0.5μ微克/毫升的最终浓度和可视化，以证实病毒晚期mRNA关联到RCF。处理溴化乙锭如在步骤4.10所示。
RCF 6.免疫可视化
注：进位出这个过程在层流柜，以避免样品污染的任何尘埃颗粒，并在使用前过滤所有的解决方案。
- 现货5 微升步骤2.10可怕获得的RCF分数ctly上的硅烷涂覆的滑动。
- 让光点干约5分钟，在室温。
- 重新水合物缓慢和间接吸取PBS 500μL的RCF点旁边的降低，且让它通过倾斜滑动流动。从侧面流掉过量PBS中。
- 由覆盖用500μ升的PBS / 5％牛血清白蛋白（BSA）的样品进行2小时，在室温块。
- 轻轻和间接吹打的PBS 500μ升到样品洗载玻片3次。倾斜滑动流掉过量PBS中。
- 孵育针对病毒的E2A DNA结合蛋白（B6-8 9）在一个1第一抗体样品1:500稀释在PBS中2小时，在室温。覆盖20μ升抗体溶液的点样的样品，孵育在潮湿室中，以避免干燥。
- 用PBS / 0.02％吐温20轻轻和间接吹打500μ升的PBS到样品洗样品3次。倾斜滑动流掉前塞斯洗涤液。
- 孵育样品与耦合到该被激发在488nm以1荧光团的小鼠抗IgG第二抗体：在4ºC2000稀释在PBS中，1小时。覆盖20μ升抗体溶液的点样的样品，孵育在潮湿室中，以避免干燥。
- 用PBS / 0.02％吐温20轻轻和间接吹打500μ升的PBS到样品洗样品3次。倾斜滑动以排干多余的洗涤溶液中。
- 还包括与使用2μ升的PBS / 10％甘油作为安装平台盖玻片载玻片上的点样的样品。轴封采用透明指甲油和存储人-20ºC。
- 分析使用荧光显微镜的样品中，用63×物镜和一个1.4数值孔径（NA），在488nm处的波长。
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Representative Results
因为病毒复制室（RC）是蛋白质和核酸，类似于其他核结构域组成的亚核病毒诱导的结构，他们证明了通过基于生物化学特征速度梯度以便能够进行隔离。在分馏协议关键步骤示于图1.在每一步骤中，样品需要通过亮视野显微镜进行监测，以确保不同的亚细胞级分的完整性。例如，肿胀的细胞时，需要在低渗缓冲液孵育时间以溶胀细胞质避免了对细胞核进行标准化。细胞均化，完整的细胞核，自由细胞质成分包括内质网的膜后，需要获得。而且，声波处理时间的需要，以破裂所有细胞的核膜不中断的RC标准化。
获得子核级分之后，键控件需要包括确定区域合作框架的关联和善意 RC标志物富集。腺病毒的RC使用抗体针对病毒的E2A-72K蛋白（DBP）通常显现在感染细胞的免疫荧光。舒张压是一种病毒蛋白直接参与病毒基因组的复制;因此，舒张压在颗粒中的存在富集在RCF演示此病毒蛋白与孤立粒子的直接关联， 如图1，此外，检测舒张压在RCF通过Western印迹的证实这种蛋白质的分离的关联RC。 在图2中示出，通过后期倍感染后（36 HPI），DBP富集在RCF相比，核质馏分（NPL），这表明RC与此过程在不同的时间感染后反映预期的时间得到DBP协会RC模式。钢筋混凝土的主要病毒组分是病毒DNA ITSELF。在这样的实验中，如图3所示，我们表明，增加量与RCF病毒DNA准作为病毒复制循环的进行，这表明，对于DBP，DNA复制在这些部分的时间模式，也可以研究。
除了含有病毒蛋白和病毒基因组，RC也病毒晚期基因表达的位点。在图4中 ，我们提出的设计通过RT-PCR测量各种物种病毒晚期mRNA，并在36 HPI RCF和NPL之间的隔离的水平实验的代表性结果。病毒晚期mRNA合成在RC和他们postranscriptional处理在这些网站发起;之后，这些病毒mRNA从RC分离，被释放出来的核质，并随后出口到细胞质中。使用放大三方领导人的外显子交界的引物成熟的病毒晚期mRNA的总池（ML mRNA）的测量，一序列构成的5'所有的腺病毒晚期mRNA（ 图4A）的。外显子结在L2的具体成熟转录mRNA的，L4和L5的家庭也测量。已经确定，由于病毒复制循环的后期阶段的进展，增加量的病毒晚期mRNA出口到细胞质;然而，由晚倍生产L5的mRNA种类的进一步与其他晚期mRNA家庭比较增加。在播种于图4中的代表性结果，在ML的mRNA的约2.5倍的差异是观察NPL与RCF相比，如预期。有趣的是，当我们从特定家庭比较的mRNA，L2和L4的mRNA似乎分布在这两个亚核级分（图4B 和C，分别地）之间相似水平，而与此相反，L5的mRNA显示在NPL几乎2倍的增加相比于RCF。这些结果表明，在SY差动模式 nthesis和解放的不同病毒晚期mRNA种腺病毒的RC（如已提出10之前）。显著，这些结果也表明的不同步骤中的病毒mRNA的生物合成的精确测量可以使用分离的RC与此新颖程序进行。
在分馏过程中各个步骤的图1明场显微术。在钢筋混凝土的隔离，样品需要通过光学显微镜进行监测，以确保亚细胞级分的完整性。该图显示了该过程中使用，以获得RCF的步骤，从HFF细胞的肿胀，对核的通过蔗糖垫分离和RCF的隔离。 40倍的显微照片：比例尺50μ米; 63X显微照片：比例尺5μ米; DBP显示为绿色。TPS：//www.jove.com/files/ftp_upload/53296/53296fig1large.jpg“目标=”_空白“>点击此处查看该图的放大版本。
图2.西方反对DBP印迹的样品通过SDS-PAGE分析并处理对DBP，病毒性RC的真正标志物免疫印迹。以确定在RCF的蛋白质的富集，这是有用的存在和DBP的相对丰度在两个RCF和NPL在不同时间感染后比较。在HFF细胞16 HPI代表了腺病毒复制周期中的早期; 24 HPI标志着过渡到感染的病毒DNA合成开始的晚期; 36 HPI代表一晚的时间后感染。舒张压的预期分子量被示出。 请CLICķ此处查看该图的放大版本。
图3. PCR检测病毒DNA（VDNA）的RCF。DNA的RCF和不良贷款进行纯化，在24和36 HPI。病毒DNA，使用特异于病毒基因组的引物通过PCR扩增。该图显示病毒DNA在RCF在36 HPI的富集。 请点击此处查看该图的放大版本。
。图4的病毒晚期的mRNA的RNA 分析从RCF和NPL分离并通过RT-PCR分析，以检测特定病毒晚期mRNA（A）总病毒晚期基因（ML：主要晚期）;（B）从L mRNA的2家;（C）的mRNA从L4家庭;（四）从L5家族基因。数值代表平均值±一式三份样品的标准偏差。 请点击此处查看该图的放大版本。
| 名称 | 正向引物序列（5'-3'） | 反向引物序列（5'-3'） | 退火温度 |
| ML基因 | GCCTCCGAACGGTACTCCGCC | CGCCACGGTGCTCAGCCTACC | 60ºC |
| L2的mRNA | GTCACAGTCGCAAGATGTCCAAGC | GCAACGCCAGCATGTCCTTATGC | 58ºC |
| L4基因 | CCTCCGAACGGTACTCCGC | CCTTGCTCATCTTGCGACTGTG | 58ºC |
| L5的mRNA | GTCACAGTCGCAAGATGAAGCG | GGTAACTAGAGGTTCGGATAGGCG | 60ºC |
表1.引物用于病毒晚期基因扩增的mRNA的ML：这些引物允许内的三联前导的区域的扩增，在5'序列是共同的所有病毒晚期mRNA; L 2的mRNA的引物允许在PV的mRNA内的特定区域的放大; L4的mRNA的引物允许为100K的mRNA内的特定区域的放大; L5的mRNA允许区域内的纤维的mRNA的扩增。的顺序和退火温度为每个拘谨示器。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Gibco | 12100-046 | Warm in 37 ºC water bath before use |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 12484-028 | |
| Sucrose, Ultra Pure | Research Organics | 0928S | Prepare a 2.55 M stock solution and store at 4 ºC |
| Dounce homogenizer | Kontess Glass Company | 884900-0000 | |
| Branson 1800 Ultrasonic Bath | Branson | Z769533 SIGMA | Turn on 15 min before use. |
| Goat anti-Mouse IgG1 Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate | Life Technologies | A-21121 | Use at a 1:2,000 dilution in PBS |
| Silane-Prep Slides | Sigma | S4651-72EA | Open in a laminar flow cabinet |
| SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate | Pierce ThermoScientific | 34080 |
References
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