Abstract
Zebrafisk er en vigtig model organisme med iboende fordele, der har potentiale til at zebrafisk en almindeligt anvendt model til undersøgelse af energihomeostase og fedme. Den lille størrelse af zebrafisk muliggør analyser på embryoner, der skal udføres i en 96- eller 384-brønds plade-format, Morpholino og CRISPR baserede teknologier fremmer nem genetisk manipulation, og medicinsk behandling ved bad ansøgning er levedygtig. Desuden zebrafisk er ideelle til forward genetiske skærme giver mulighed for hidtil ukendt gen opdagelse. I betragtning af den relative nyhed af zebrafisk som model for fedme, er det nødvendigt at udvikle værktøjer, der fuldt ud udnytter disse fordele. Heri beskriver vi en metode til at måle energiforbruget i tusindvis af embryonale zebrafisk samtidigt. Vi har udviklet et helt dyr mikroplade platform, hvor vi bruger 96-brønds plader for at isolere enkelte fisk og vi vurderer kumulative NADH 2-produktion ved hjælp af kommercielt tilgængelige cellekultur levedygtighed reagent alamarBlue. I poikilotherms forholdet mellem NADH 2-produktion og energiforbrug er tæt forbundet. Dette energiforbrug assay skaber potentiale til hurtigt at screene farmakologiske eller genetiske manipulationer, der direkte ændrer energiforbrug eller ændre respons på en anvendt lægemiddel (f.eks insulinsensibilisatorer).
Introduction
Musen er i øjeblikket den fremherskende model for fedme forskning. Den korte generationstid interval og genetiske værktøjer til rådighed i musen har været uovertruffen til dato. Dog zebrafisk har også en kort generation interval (3 - 4 måneder), og overgår endda musen i lethed genmanipulation 1,2. Zebrafisken fastholder næsten 90% af pattedyrsgener, mens langt overstiger musen i antallet af afkom og potentiel til brug i genetiske og narkotika skærme 3.
For at udnytte potentialet i den zebrafisk model til studier i fedme, skal analyser udvikles til at undersøge faktorer, der påvirker kropsvægten regulering, herunder energiforbrug. Som metabolitter behandles gennem β-oxidation og tricarboxylsyrecyklen oxygen forbruges og NADH2 produceres. Således NADH 2 er en direkte indikator for fluxen af metabolitter gennem metaboliske veje (metabolit oxidation). I poikilotherms, H + lække gennem den indre mitokondrielle membran, som kobler NADH2 oxidation fra ATP-syntese, er 4 - 5 gange lavere end i homeotherms 4. Følgelig i zebrafisk NADH2 er meget tæt knyttet til ATP-produktion ved oxidativ phosphorylering. Heri beskriver vi en analyse, der måler NADH 2 produktion i larvernes zebrafisk som proxy for energiforbrug 5.
Ilt forbrug er den gyldne standard for måling energiforbrug. Men for bedst at udnytte den høje gennemløb potentiale zebrafisk, skal assays af energiforbrug kunne underkastes high-throughput. Systemer iltforbrug der er afhængige af et lukket kammer cirkulationssystem er begrænset i gennemløb med antallet af kamre disponible 6. Open air O 2 forbrug / CO 2 produktions-analyser er også blevet anvendt i zebrafisk 5,7. Disse open air 96-brønds plade basend systemer er egnede til high throughput. Desværre gasudveksling med omgivelserne begrænser følsomheden af disse assays. Vi har for nylig offentliggjort anvendelsen af et assay, der overvåger NADH 2 under anvendelse af redoxindikator alamarBlue 5. Denne analyse overvinder begrænsningerne i gennemløb og følsomhed fælles for analyser af ilt forbrug i zebrafisk.
Zebrafisken bliver en stadig vigtigere model til studier af hele kroppen energi homøostase. Til dels, fordi zebrafisk er medgørlige at bruge i forward genetiske skærme og narkotika skærme. Desuden målrettet genetisk manipulation, herunder knockdown og knock-in, kan hurtigt anvendes. Vi har tidligere vist, at dette assay kan kombineres med bad lægemiddeltilførsel og genetisk knockdown eller knockout at identificere forbindelser og gener der ændrer stofskifte 5. Endvidere er dette assay udviklet til at udnytte de høje gennemløb fordele forbundet med zebrafisk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bemærk: Denne protokol følger retningslinjerne fra University of Arizona kontor for ansvarlig adfærd for forskning og er blevet godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg
1. Zebrafisk Avl og Embryo Vedligeholdelse
- Forbered E3 embryo medium 8. To Make 60x stamopløsning opløses 34,8 g NaCl, 1,6 g KCI, 5,8 g CaCl2 ● 2H 2 O, og 9,78 g MgCl2 ● 6H 2 O i 1,95 L ddiH 2 O. Juster pH til 7,2 ved hjælp af NaOH og HCl Juster lydstyrke til 2 L hjælp ddiH 2 O.
- For at forberede 1x E3 embryo medium, fortyndes 16,5 ml 60x lager i 1 liter ddiH20. Tilføj 100 pi 1% methylenblåt.
- Avl
- Hus Mandlige og Kvindelige kuld lager (7 - 18 måneders alderen) separat for at maksimere frugtbarhed.
- Slukke lyset 1 - 2 ud hr før dagen før ønskes æg. Opsætning parring (1 han og 1 - 2 hunner) icRossing bure som tidligere beskrevet 9. Crossing bure mulighed for æggene at undslippe predation, når de passerer gennem den perforerede bunden af tanken indsatsen, hvor der afholdes af voksne fisk.
- Valgfrit:. For tidsbestemt avl, (som ville være behov for undersøgelser, der involverer morpholino injektion), adskille mandlige og kvindelige fisk ved en klar plast skillevæg, Fjern denne om morgenen for at resultere i tidsindstillet lægning af æg og befrugtning. For morpholino undersøgelser, udføre power beregninger for at vurdere antallet af embryonale fisk kræves per behandling. Uden et skøn over størrelsen af effekten eller variation, kan en foreløbig forsøg køres med en n = 8.
- Hæld æggene fra passage bur i en petriskål (100 - 150 embryoner / 10 cm petriskål). Tillad æggene at afregne til bunden af skålen og hæld vandet. Fjern eventuelle resterende vand med en fin spids engangs overførsel pipette. Tilføj back E3 embryo medium foretaget i trin 1.1.
- Foretag AFhalt poleret engangspipette til fremtidig æg og fisk overførsel. Ved hjælp af en saks, klippe en gradueret engangs overførsel pipette på 0,25 ml graduering. For at fjerne uslebne kanter, flamme polish snittet vælte en bunsenbrænder.
- Oprethold embryonale fisk til 4 dage efter befrugtning (DPF) i 10 cm petriskåle i zebrafisk E3 embryo medium på 28,5 ○ C. To gange hver dag, skal du bruge en flamme poleret gradueret engangs overførsel pipette til at fjerne eventuelle ubefrugtede æg eller døde embryoner (uigennemsigtig hvid udseende). Når hver dag, erstatte E3 embryo medium. Hæld E3 embryo medium, fjerne resterende væske med en fin spids engangs overførsel pipette og tilsæt tilbage forvarmet (28,5 ○ C) E3 embryo medium.
2. Forbered Assay Solution
- Assayet Der fremstilles ifølge tabel 1. Sterilt filter assay under anvendelse af en 0,22 um filter. Før analyse indvielse, varme den sterile assay opløsning i en 28,5 ○ Cvandbad.
| Ingrediens | % Af den samlede | Volume (ul / 10 ml) |
| 60x E3 Embryo Medium | 1.667 | 166,7 |
| Dobbelt deioniseret (DDI) H 2 0 | 96,233 | 9623,3 |
| Alamar Blå | 1 | 100 |
| 400 mM NaOH | 1 | 100 |
| DMSO | 0.1 | 10 |
Tabel 1. assaymedium
3. Udfør Assay
- Skyl zebrafisk embryoner 3 gange med sterilt filtreret E3 embryo medium. Kombiner alle levedygtige zebrafisk embryoner fra koblingen i et bæger. Sterilt filter 75 ml E3 embryo medium. Ved hjælp af en fin spids engangs overførsel pipette, reflytte så meget af E3 embryo medium fra zebrafisk embryoner som muligt. Tilføj tilbage 20 ml sterilfiltreret E3 embryo medium. Fjern og udskift E3 embryo medium 3 gange.
- Plade 1 fisk i hver af 93 brønde i en 96-brønds sorte sidet klar bundpladen. Overfør embryonale fisk til pladen ved individuelt at opfange et foster inden for en flamme poleret gradueret plast engangs overførselspipetten (trin 1.5) og forsigtigt skubbe ned i brønden. Overfør E3 embryo medium taget fra bægerglas, der indeholder skyllede fisk ind i de 3 tomme brønde. Dette sikrer, at tomme brønde har været udsat for nøjagtig samme vand som brøndene, der indeholder fisk. Begge brønde, der indeholder fisk og tomme brønde bør være mindst ½ fuld (200 ul) ved afslutningen af dette trin.
- Udskift E3 embryo medium med assay løsning i alle 96 brønde, herunder tomme brønde. Dette trin bør udføres 1 kolonne ad gangen for hver af de 12 søjler i en plade med 96 brønde. Ved hjælp af en fin spids engangs transfer pipette til at fjerne E3 embryo medium fra hver brønd i en kolonne af pladen (8 brønde). Pas på ikke at røre ved zebrafisk foster. Der tilsættes 300 pi assay-opløsning til hver brønd, hvorfra vandet blev fjernet. Gentag fjernelse af E3 embryo medium og erstatning med assay løsning for alle 12 søjler af pladen.
- Valgfrit: For at teste stofskiftet ændring som reaktion på en forbindelse, lave en løsning, der er den ønskede koncentration behandling 100 gange (100x). Af note, sikre, at 100x opløsningen ikke overstiger 10% DMSO for at begrænse den endelige DMSO-koncentration på højst 0,1%. Tilsæt 3 pi af 100x opløsning til hver af behandlingsgrupperne brønde.
BEMÆRK: Udfør magt beregninger for at vurdere antallet af behandlingsmuligheder brønde. Men uden et skøn over størrelsen af respons eller variation, en foreløbig undersøgelse kan udføres i forbindelse 8 behandles og 8 vehikelbehandlede kontrolbrønde, der indeholder fisk.- Tilsæt 3 pi af køretøjer kontrol til kontrol (ingen Drug behandling) brønde, der indeholder fisk. For at sikre, at den fluorescerende respons på forbindelsen er et resultat af aktioner i fisk, anvendes lægemiddel- og Bilklargøringer til 3 tomme brønde i en plade med 96 brønde.
- Læs fisk fyldt plade på fluorescerende pladelæser med excitationsbølgelængde på 530 nm og emissionsbølgelængde på 590 nm.
- Sæt plade i befugtet inkubator indstillet til 28,5 ○ C (fastholde pladen i mørke hele assay for at undgå fotoblegning af prøveopløsning). Assayet kan køres for varigheder af tid, der spænder fra 1 time til 24 timer. Varigheden af assayet afhænger af formålet med undersøgelsen. Til afprøvning af respons på et korttidsvirkende ikke-stabil forbindelse en kort varighed kan være mest egnet. Men for stabile sammensatte test eller test af genetiske virkninger, maksimering assay varighed er at foretrække at udnytte de fordele, der er forbundet med den kumulative signal.
- På et forudbestemt tidspunkt (se trin 3.6 til at bestemme timing)læse fluorescens af fisk fyldt plade igen med de samme indstillinger som trin 3.5.
4. Vurdere den relative ændring i fluorescens associeret med behandling
- Beregn ændring i fluorescensen af hver brønd ved at fratrække fluorescensen på tidspunkt 0 fra fluorescensen ved afslutningen af undersøgelsen. Brønde uden fisk (blanks) bør have værdier i nærheden af 0, langt under værdierne fra brønde, der indeholder fisk.
Ændring i fluorescens = fluorescens ved afslutningen - fluorescens ved tiden 0 - For at konstatere den relative ændring i fluorescens, beregne den gennemsnitlige ændring i fluorescens for kontrolbrønde derefter dividere ændringen i fluorescensen af hver brønd ved den gennemsnitlige ændring i fluorescens af kontrolbrøndene. Notatet kunne kontroller være enten vehikelkontroller eller genetiske kontroller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Prøveopløsningen øger ikke fluorescens i fravær af embryonale fisk (Figur 1). Men assayet er meget følsomt over for små ændringer i stofskiftet i brønden. En enkelt fisk i en brønd skaber et signal signifikant forskellig fra tomme brønde inden for 1 time (P <0,0001). Figur 2 giver en visuel repræsentation af signaler genereret af embryonale fisk efter 24 timers inkubation. Med henblik på dette billede klare sidede brønde blev anvendt. Alligevel er sorte sidede brønde foretrækkes til analysens ydeevne for at forhindre udvaskning af det fluorescerende signal fra nærliggende brønde.
Fordi NADH 2 inducerede reduktion af alamarBlue er ikke vendbare, signalet akkumuleres med tiden. Dette giver mulighed for små ændringer, der skal forstærkes. For at vise, at forskellene akkumuleres og dermed stige med tiden, monitorerede vi den relative ændring i fluorescens induceret af 1 til 5 fisk på 1, 2 og 4 timer (Figur 3). Ved hver antal fisk / brønd den relative ændring i fluorescens signifikant forøget med tiden (P <0,001). Endnu vigtigere, fordi signalet akkumuleres med tiden, størrelsen af forskelle i fluorescens ændring, der skyldes manipulation af antallet af fisk / brønd er mere robust på 4 timer end efter 1 time inkubation. Ved således at forøge varigheden af eksponeringen kan vi forbedre evnen til at detektere forskelle i forbindelse med en given behandling.
Figur 1. Sammenligning af støj til signalet. En påviselig ændring i fluorescens genereres af 1 zebrafisk i en plade med 96 brønde efter 1 time. Brønde, der ikke indeholder fisk (blanke) genererer lidt signal. Fejl søjler repræsenterer SEM (n = 5-8). Klik her for at se en større version afdette tal.
Figur 2. Visuel repræsentation assaypladen på 24 timer. Repræsentant billede af resultater opnået ved hjælp af denne analyse. Pink brønde er tegn på fisk med en høj stofskifte, lilla brønde en moderat stofskifte, og blå brønde et lavt stofskifte sats. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. signalforskelle Forstærk med tiden. Forskellen i fluorescerende signal genereret ved at variere antallet af fisk / brønd stiger med tiden. Fordi signalet akkumuleres med tiden, størrelsen af fluorescensændring divergerer med tiden betweensamples that adskiller sig i antallet af signalet generation. Fejlbjælkerne viser SEM (n = 7).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Forurening med bakterier eller svampe i høj grad vil begrænse anvendelsen af dette assay. Methylenblåt i E3 embryo medium begrænser muligheden for svampekontamination. Gennem embryo opdræt er det afgørende, at der drages omsorg for at fjerne døde fostre to gange hver dag. Derudover er det vigtigt at skylle dem grundigt embryonerne med sterilt E3 embryo medium på dagen for assayet indledning. Disse 2 trin begrænse muligheden for bakteriel kontaminering af embryonerne. Optagelse af tomme brønde beskrevet i trin 3.2 muliggør påvisning af en bakteriel forurening. Bakteriel forurening, der giver et måleligt signal er sjælden. Men hvis de tomme brønde ikke viser et kraftigt signal, assayet bør gentages med omhu for at bevare embryo renlighed. Hvis brugeren forventer, at forureningen er opstået forud for embryonindsamlingsteam, kan fostrene bleges som tidligere beskrevet (s. 22) 10. Alternativt, hvis forsøgslederen mistanke om, atforurening forekommer efter opsamling brugeren kan anvende E2 med penicillin og streptomycin til bag de embryoner til 4 dpf (s. 23) 10.
Selv om denne analyse er værdifuld til anvendelse i embryoner, har vi ikke testet for gyldighed i voksne zebrafisk. Vi formoder, at funktionaliteten af denne analyse vil være begrænset i voksne fisk af dårlig væv penetration af alamarBlue. Desuden fodring fisk tarmen mikrobiota kan frembringe en dyb signal, ikke udtryk for den metabolisme i fisk. Således er dette assay begrænset til brug i blommen fodring embryonale fisk. Den relative inaktivitet i embryonale fisk giver en unik fordel, da dette begrænser variation, der ville være forbundet med aktiviteten induceret energiforbrug 11. Dette assay er således et unikt værktøj til at screene stofskiftet reaktion på genetisk eller farmakologisk manipulation i et helt dyr system.
Zebrafisken er hurtigt ved at blive en førende model for metabolic perturbationer, der ledsager fedme. Faktisk er der offentliggjort modeller for både transgene og kost-induceret fedme zebrafisk 12,13. Svarende til musemodeller, kost-induceret fedme i zebrafisk øger serum triglycerider og hepatisk lipidakkumulering 12. Desuden har bøvet zebrafisk forhøjet fastende glukose, hvilket tyder glucoseintolerance 14. Anvendelse af assayet beskrevet her har vi vist, at 24 timers forbehandling med metformin, et insulin-sensitiverende, øger stofskiftet reaktion på insulinbehandling 5. Således kan zebrafisk vise sig at være en ideel hele dyremodel at opdage lægemidler, der øger insulinfølsomhed (embryo) og at de er effektive til at lindre fedmerelaterede insulinresistens (voksen).
Udviklingen af genetiske og kost-induceret fede zebrafisk modeller, der efterligner fænotyper observeret i overvægtige pattedyr skaber afsæt for at indlede zebrafisk studør fokuseret på metabolisk sygdom. Analyser med høj kapacitet er afgørende for fuldt værdsætte værdien af zebrafisk model studier af energihomeostase. Innovative værktøjer designet til at vurdere phagic drev vil give mulighed for skærme med fokus på energiindtaget, mens high throughput lipid storage analyser vil føre til undersøgelser af hele kroppen lipid homeostase 15-17. Analysen vi beskriver her giver et højt gennemløb redskab til at vurdere den rolle, gener, forbindelser eller deres interaktioner på hele udgifter kroppen energi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AlamarBlue | Fisher Scientific | 10-230-103 | Manufactured by Thermo Scientific |
| Fine Tip DisposableTransfer Pipette | Fisher Scientific | 13-711-26 | Manufactured by Thermo Scientific |
| Fisherbrand Graduated Disposable Transfer Pipette | Fisher Scientific | 13-771-9AM | Manufactured by Thermo Scientific |
| Black sided clear bottom 96-well plates | Fisher Scientific | 50-320-785 | Manufactured by E&K Scientific Products Inc. |
References
- Jao, L. E., Wente, S. R., Chen, W. Efficient multiplex biallelic zebrafish genome editing using a CRISPR nuclease system. PNAS. 110, 13904-13909 (2013).
- Kimura, Y., Hisano, Y., Kawahara, A., Higashijima, S. Efficient generation of knock-in transgenic zebrafish carrying reporter/driver genes by CRISPR/Cas9-mediated genome engineering. Sci. Rep. 4, 6545 (2014).
- Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nat. Rev. Genet. 8, 353-367 (2007).
- Brand, M. D., Couture, P., Else, P. L., Withers, K. W., Hulbert, A. J. Evolution of energy metabolism. Proton permeability of the inner membrane of liver mitochondria is greater in a mammal than in a reptile. Biochem. J. 275 (Pt 1), 81-86 (1991).
- Renquist, B. J., Zhang, C., Williams, S. Y., Cone, R. D. Development of an assay for high-throughput energy expenditure monitoring in the zebrafish. Zebrafish. 10, 343-352 (2013).
- Livingston, R. J. A volumetric respirometer for long-term studies of small aquatic animals. J.Mar. Biol. Assoc. U.K. 48, 485-497 (1968).
- Makky, K., Duvnjak, P., Pramanik, K., Ramchandran, R., Mayer, A. N. A whole-animal microplate assay for metabolic rate using zebrafish. J. Biomol. Screen. 13, 960-967 (2008).
- E3 medium (for zebrafish embryos) Cold Spring Harb. Protoc. , http://cshprotocols.cshlp.org/citmgr?gca=protocols%3B2011%2F10%2Fpdb.rec66449 (2011).
- Nasiadka, A., Clark, M. D.
- Brand, M., Granato, M., Nusslein-Volhard, C. Zebrafish, A practical approach. Nusslein-Volhard, C., Dahm, R. , Oxford University Press. (2002).
- Fry, F. E. J., Hart, J. S. Cruising speed of goldfish in relation to water temperature. J. Fish. Res. Board Can. 7, 169-175 (1948).
- Oka, T., et al. Diet-induced obesity in zebrafish shares common pathophysiological pathways with mammalian obesity. BMC physiol. 10 (21), (2010).
- Song, Y., Cone, R. D. Creation of a genetic model of obesity in a teleost. FASEB J. 21, 2042-2049 (2007).
- Maddison, L. A., Joest, K. E., Kammeyer, R. M., Chen, W. Skeletal muscle insulin resistance in zebrafish induces alterations in beta-cell number and glucose tolerance in an age and diet dependent manner. Am. J. physiol. Endocrinol. , (2015).
- Flynn, E. J. 3rd, Trent , C. M., Rawls, J. F. Ontogeny and nutritional control of adipogenesis in zebrafish (Danio rerio). J. lipid res. 50, 1641-1652 (2009).
- Shimada, Y., Hirano, M., Nishimura, Y., Tanaka, T. A high-throughput fluorescence-based assay system for appetite-regulating gene and drug screening. PloS one. 7, e52549 (2012).
- Tingaud-Sequeira, A., Ouadah, N., Babin, P. J. Zebrafish obesogenic test: a tool for screening molecules that target adiposity. J. lipid res. 52, 1765-1772 (2011).
