Abstract
Zebravis een belangrijk modelorganisme inherente voordelen die potentieel zebravis een schaal toegepast model voor de studie van energiehomeostase en obesitas te maken. De geringe omvang van de zebravis zorgt voor tests op embryo's te worden uitgevoerd in een 96- of 384-well plaat formaat, Morfolino en CRISPR gebaseerde technologieën bevorderen gemak van genetische manipulatie, en behandeling met geneesmiddelen door bad applicatie levensvatbaar is. Bovendien zebravis zijn ideaal voor voorwaartse genetische screens waardoor nieuw gen ontdekking. Gezien de relatieve nieuwheid van de zebravis als model voor obesitas, is het nodig om instrumenten die volledig deze voordelen te benutten ontwikkelen. Hierin beschrijven we een methode om energieverbruik in duizenden embryonale zebravis simultaan meten. Wij hebben een hele dier microplaat platform waarop wij 96-well platen exemplaren isoleren ontwikkeld en beoordelen wij cumulatieve NADH 2 productie met behulp van de commercieel beschikbare celkweek levensvatbaarheid remiddel AlamarBlue. In koudbloedigen de relatie tussen NADH 2 productie en het energieverbruik is nauw verbonden. Deze energie-uitgaven test maakt het mogelijk om snel te screenen farmacologische of genetische manipulaties die direct veranderen energieverbruik of de reactie op een toegepaste geneesmiddel (bijv insulinesensibiliseermiddelen) veranderen.
Introduction
De muis is op dit moment het belangrijkste model voor obesitas onderzoek. De korte generatie interval en genetische hulpmiddelen die beschikbaar zijn in de muis zijn ongeëvenaarde tot nu toe. De zebravis biedt ook een korte generatie tijd (3-4 maanden) en overtreft zelfs de muis gemak van genetische manipulatie 1,2. De zebravis onderhoudt bijna 90% van de genen van zoogdieren, terwijl ver boven de muis in aantal nakomelingen en de mogelijkheden voor gebruik in genetische en drug screens 3.
Om het potentieel van de zebravis model voor studies van obesitas tikt, moet assays worden ontwikkeld om factoren die het lichaamsgewicht regelgeving, met inbegrip van de energie-uitgaven van invloed te onderzoeken. Aangezien metabolieten worden verwerkt via β-oxidatie en tricarbonzuur cyclus zuurstof wordt verbruikt en NADH 2 wordt geproduceerd. Aldus NADH 2 is een directe indicatie van de flux van metabolieten door middel van metabole pathways (metaboliet oxidatie). In poikilotherms, H + lekken door het binnenste mitochondriale membraan, dat NADH 2 oxidatie ontkoppelt van ATP-synthese, is 4-5 maal hoger dan in homeothermen 4. Dienovereenkomstig, in zebravis NADH 2 is zeer nauw verbonden met ATP productie door middel van oxidatieve fosforylering. Hierin beschrijven we een test die NADH 2 productie meet in larvale zebravis als proxy voor de energie-uitgaven 5.
Zuurstofverbruik is de gouden standaard voor het meten van het energieverbruik. Toch optimaal te profiteren van de high throughput mogelijkheden van de zebravis, testen van energieverbruik moet vatbaar bij hoge doorvoer zijn. Zuurstofverbruik systemen die afhankelijk zijn van een gesloten kamer circulatiesysteem zijn overslag beperkt door het aantal beschikbare kamers 6. Open lucht O 2 verbruik / CO2 productie testen zijn ook toegepast in de zebravis 5,7. Deze open lucht 96-well plaat based systemen vatbaar zijn voor high throughput. Helaas beperkt gasuitwisseling met de omgeving sensitiviteit van deze assays. We hebben onlangs publiceerde de toepassing van een test die NADH 2 bewaakt met behulp van de redox-indicator AlamarBlue 5. Deze test overwint de beperkingen in verwerkingscapaciteit en gevoeligheid gemeenschappelijke analyses van zuurstofverbruik bij de zebravis.
De zebravis is een steeds belangrijker model voor studies van het gehele lichaam energie homeostase. Voor een deel omdat zebravis vatbaar zijn voor gebruik in voorwaartse genetische screens en drugs schermen. Bovendien, gerichte genetische manipulatie, met inbegrip van knock-down en knock-in, kan snel worden toegepast. We hebben eerder aangetoond dat deze assay kan worden gecombineerd met bad geneesmiddeltoediening en genetische knockdown of knockout verbindingen en genen die metabolisme 5 veranderen identificeren. Bovendien is deze bepaling ontworpen om de doorvoer voordelen inherent aan de zebravis benutten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Opmerking: Dit protocol volgt de richtlijnen van de Universiteit van Arizona Bureau voor verantwoorde onderzoek en is door de Institutional Animal Care en gebruik Comite
1. zebravis Fokkerij en Embryo Onderhoud
- Bereid E3 embryo medium 8. Tot 60x voorraad-oplossing maken, los 34,8 g NaCl, 1,6 g KCI, 5,8 g CaCl2 ● 2H 2 O, en 9,78 g MgCl2 ● 6H 2 O in 1,95 L ddiH 2 O. Stel de pH tot 7,2 met NaOH en HCl Stel het volume op 2 L met ddiH 2 O.
- Om 1x E3 embryo medium te bereiden, verdun 16,5 ml 60x voorraad in 1 L ddiH20. Voeg 100 ul 1% methyleenblauw.
- Fokkerij
- Huis Mannelijke en Vrouwelijke broed voorraad (7-18 maanden oud) apart vruchtbaarheid te maximaliseren.
- De verlichting uitschakelen 1-2 uur eerder op de dag voor eieren gewenst zijn. Opgezet paring (1 man en 1-2 vrouwtjes) in crossing kooien zoals eerder beschreven 9. Crossing kooien zorgen voor de eieren predatie ontsnappen als ze door de geperforeerde bodem van de tank insertie waarin de volwassen vissen worden gehouden.
- Optioneel:. Voor getimede fokkerij, (als dat nodig zou zijn voor studies met morfolino injectie), scheiden de mannelijke en vrouwelijke vis door een doorzichtige plastic divider, Verwijder deze in de ochtend om te resulteren in een getimede leggen van de eieren en de bevruchting. Voor morfolino studies, uitgevoerd powerberekeningen het aantal embryonale vis vereist per behandeling te beoordelen. Zonder een schatting van de omvang van het effect of variatie kan een voorafgaande proef worden uitgevoerd met n = 8.
- Giet de eieren van de kruising kooi in een petrischaal (100-150 embryo's / 10 cm petrischaal). Laat de eieren naar de bodem van de schaal en giet het water. Verwijder eventuele resterende water met een fijne tip wegwerp transferpipet. Voeg back E3 embryo medium gemaakt in stap 1.1.
- Maak aflame gepolijst disposable pipet voor toekomstige eieren en vis overdracht. Met behulp van een schaar, sneed een afgestudeerd wegwerp transferpipet op 0,25 ml afstuderen. Ruwe randen, vlam polish de cut tip over een bunsenbrander te verwijderen.
- Behouden embryonale vis tot 4 dagen na de bevruchting (DPF) in 10 cm petrischalen in zebravis E3 embryo medium bij 28,5 ○ C. Twee keer per dag, gebruik maken van een vlam gepolijst afgestudeerd wegwerp transferpipet aan een onbevruchte eieren of dode embryo's (ondoorzichtige witte uiterlijk) te verwijderen. Eenmaal per dag, vervang E3 embryo medium. Giet E3 embryo medium, verwijder resterende vloeistof met een fijne tip wegwerp transferpipet en voeg terug voorverwarmde (28,5 ○ C) E3 embryo medium.
2. Bereid Assay Solution
- Bereid de testoplossing volgens tabel 1. Filtreer steriel testoplossing met een 0,22 uM filter. Vóór initiatie testen, verwarm de steriele testoplossing in een 28,5 ○ Cwaterbad.
| Bestanddeel | % Van de totale | Volume (ul / 10 ml) |
| 60x E3 Embryo Medium | 1,667 | 166,7 |
| Dubbele gedemineraliseerd (DDI) H 2 0 | 96,233 | 9623,3 |
| Alamar Blue | 1 | 100 |
| 400 mM NaOH | 1 | 100 |
| DMSO | 0.1 | 10 |
Tabel 1. Assay Medium
3. Voer Assay
- Spoel de zebravis embryo's 3 maal met steriel gefiltreerd E3 embryo medium. Combineer alle levensvatbare zebravis embryo's uit de koppeling in een bekerglas. Steriele filter 75 ml E3 embryo medium. Met een fijne tip wegwerp transferpipet, rebewegen zoveel mogelijk van de E3 embryo medium van de zebravis embryo's mogelijk. Zet terug 20 ml steriel gefiltreerd E3 embryo medium. Verwijder en vervang E3 embryo medium 3 keer.
- Plaat 1 vissen in elk van 93 putjes van een 96 putjes zwart eenzijdige doorzichtige bodemplaat. Breng de embryonale vis op de plaat door individueel vastleggen van een embryo in een vlam gepolijst afgestudeerd plastic wegwerp transferpipet (stap 1.5) en voorzichtig te werpen in de put. Transfer E3 embryo medium uit de beker die gespoeld vissen in de 3 lege putten. Dit zorgt ervoor dat lege putjes werden blootgesteld aan exact hetzelfde water als putjes die vis bevatten. Beide putten die vis en blanco putjes die moet ten minste ½ volledige (200 ui) aan het einde van deze stap.
- Vervang E3 embryo medium met assay oplossing in alle 96 putten, met inbegrip van lege putten. Deze stap moet worden uitgevoerd 1 kolom per keer voor elk van de 12 kolommen in een 96 wells plaat. Met een fijne tip wegwerp transfer pipet, verwijder E3 embryo medium vanuit elke put in één kolom van de plaat (8 wells). Zorg ervoor dat de zebravis embryo niet aan. Voeg 300 pl testoplossing aan elk putje waaruit water is verwijderd. Herhaal de verwijdering van E3 embryo medium en vervanging testoplossing voor 12 kolommen van de plaat.
- Optioneel: Om de stofwisseling verandering in respons op een testverbinding, maak een oplossing die 100 keer (100X) de gewenste concentratie behandeld. Van de nota, ervoor zorgen dat de 100x oplossing niet meer dan 10% DMSO om de uiteindelijke DMSO-concentratie te beperken tot niet meer dan 0,1%. Voeg 3 ul van de 100x oplossing in elk van de putjes behandeling.
OPMERKING: Voer de macht berekeningen om het aantal van de behandeling putten beoordelen. Zonder een schatting van de omvang van de respons of variant, een voorafgaande proef worden uitgevoerd in 8 verbinding behandelde en 8 vehikel behandelde controleputjes die vis bevatten.- Voeg 3 ul van voertuigcontrole controle (geen drug behandeling) putten die vis bevatten. Om de respons op fluorescente verbinding gevolge van acties binnen de vis, passen geneesmiddel en vehikel behandelingen 3 blanco putjes in een 96 wells plaat.
- Lees vis gevuld bord op fluorescerende plaat lezer met excitatie golflengte bij 530 nm en emissie golflengte bij 590 nm.
- Plaats plaat in bevochtigde incubator ingesteld op 28,5 ○ C (plaat in het donker heel assay behouden om fotobleken van de test oplossing te voorkomen). De test kan worden uitgevoerd gedurende perioden van tijd die varieert van 1 uur tot 24 uur. De duur van de test hangt af van de doelstelling van de studie. Voor het testen van de respons op een kortwerkende niet stabiele verbinding korte duur kan het meest geschikt. Maar voor stabiele verbinding tests of tests van de genetische effecten, maximaliseren test duration voorkeur om de voordelen van de cumulatieve signaal benutten.
- Op een vooraf bepaald tijdstip (zie stap 3.6 om te bepalen tijdstip)lees fluorescentie van visrijke plaat opnieuw met dezelfde instellingen als punt 3.5.
4. Beoordeel de relatieve verandering in fluorescentie geassocieerd met Behandeling
- Bereken verandering in fluorescentie van elk putje door het aftrekken van de fluorescentie op tijdstip 0 van de fluorescentie aan het einde van de studie. Wells zonder vis (spaties) moeten waarden in de buurt van 0, ver onder de waarden uit putten die vis bevatten.
Verandering in fluorescentie = Fluorescentie bij sluiten - Fluorescence op tijdstip 0 - Om de relatieve verandering in fluorescentie vernemen Bereken de gemiddelde verandering in fluorescentie voor controleputjes verdeel de verandering in fluorescentie van elk putje van de gemiddelde verandering in fluorescentie van de controleputjes. Van de nota, zou controles ofwel bedieningsorganen van het voertuig of genetische controles.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Testoplossing geen fluorescentie verhoging bij afwezigheid van embryonale vis (figuur 1). De test is zeer gevoelig voor kleine veranderingen in de stofwisseling in de put. Een enkele vis in een put wordt een signaal significant verschilt van blanco putjes binnen 1 uur (p <0,0001). Figuur 2 geeft een visuele representatie van signalen van embryonale vis na 24 uur incubatie. Ten behoeve van deze afbeelding duidelijke eenzijdige putjes werden toegepast. Toch zijn zwarte eenzijdig putten voorkeur assay prestaties om uitlogen van het fluorescente signaal van nabijgelegen putten te voorkomen.
Omdat de NADH 2 geïnduceerde reductie van AlamarBlue is niet omkeerbaar, het signaal accumuleert tijd. Hierdoor kunnen kleine wijzigingen worden versterkt. Aantonen dat verschillen ophopen en dus verhoging van de tijd, gevolgd we de relatieve verandering in fluorescentie geïnduceerd door 1-5 vis 1, 2 en 4 uur (Figuur 3). Bij elk aantal vissen / put de relatieve verandering in fluorescentie verhoogd in de tijd (p <0,001). Nog belangrijker, omdat signaal accumuleert met de tijd, de grootte van de verschillen in fluorescentie verandering als gevolg van het manipuleren van het aantal vissen / put is robuuster in 4 uur dan in 1 uur incubatie. Aldus, door het vergroten van de blootstellingsduur we de mogelijkheid om verschillen met een behandeling detecteren verbeteren.
Figuur 1. Vergelijking van Noise Signal. Een waarneembare verandering in fluorescentie wordt opgewekt door 1 zebravis in een 96 goed plaat in 1 uur. Wells die geen vis (spaties) bevatten genereren weinig signaal. Fout balken geven SEM (n = 5-8). Klik hier om een grotere versie te bekijkendit cijfer.
Figuur 2. visuele weergave van Assay Plate op 24 uur. Representatief beeld van de resultaten verkregen met behulp van deze test. Roze putten zijn een indicatie van vis met een hoge stofwisseling, paars putten een gematigde stofwisseling en blauw putten een lage stofwisseling. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3. signaalverschillen Amplify Met Time. Het verschil in fluorescentiesignaal gegenereerd door het variëren van het aantal vissen / put met de tijd toeneemt. Omdat signaal accumuleert met de tijd, de omvang van de fluorescentieverandering divergeert tijdstip t betweensampleshoed verschillen in snelheid van het signaal generatie. Fout balken geven SEM (n = 7).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Contaminatie met bacteriën of schimmels wordt sterk beperkt de toepassing van deze assay. De methyleenblauw in de E3 embryo medium beperkt de mogelijkheid van schimmel besmetting. Hele embryo grootbrengen is het essentieel dat zorg wordt genomen om de dode embryo's twee keer per dag te verwijderen. Daarnaast is het essentieel om grondig spoelen met steriel embryo E3 embryo medium op de dag van assay initiatie. Deze 2 stappen beperken de mogelijke bacteriële besmetting van het embryo. Het opnemen van blanco putjes in stap 3.2 maakt detectie van elke bacteriële verontreiniging. Bacteriële besmetting die een meetbaar signaal oplevert is zeldzaam. Indien de blanco putjes vallen een sterk signaal, de test worden herhaald met zorg om embryo schoon te houden. Als de gebruiker verwacht dat verontreiniging die vóór embryo, kan de embryo's gebleekt zoals eerder beschreven (blz. 22) 10. Een defect experimentator vermoedt datbesmetting optreedt na de inzameling van de gebruiker mag gebruiken E2 met penicilline en streptomycine aan de achterzijde van de embryo's tot 4 DPF (p. 23) 10.
Hoewel deze test is waardevol voor toepassing in embryo's, hebben we niet getest op validiteit in volwassen zebravissen. We vermoeden dat de functionaliteit van deze test bij volwassen vis zou worden beperkt door de slechte penetratie van AlamarBlue. Bovendien is in het voeden van vissen de darmflora kan een diepe signaal, geen indicatie van het metabolisme van de vissen produceren. Daarom is deze assay beperkt tot het gebruik in dooier voeden embryonale vis. De relatieve inactiviteit van embryonale vis biedt een uniek voordeel, omdat dit beperkt de variatie die zou worden geassocieerd met de activiteit geïnduceerd energieverbruik 11. Dus deze test is een uniek instrument om de stofwisseling reactie op genetische of farmacologische manipulatie in een geheel dier systeem screenen.
De zebravis is hard op weg een toonaangevende model voor de metabolic verstoringen dat obesitas te begeleiden. In feite zijn er gepubliceerde modellen van zowel de transgene en dieet-geïnduceerde obesitas zebravis 12,13. Vergelijkbaar met muismodellen, voeding geïnduceerde zwaarlijvigheid in de zebravis verhoogt serum triglyceriden en lever lipide accumulatie 12. Bovendien hebben overvoerd zebravis nuchtere glucose verhoogd, wat suggereert glucose-intolerantie 14. Volgens de hieronder beschreven we hebben aangetoond dat 24 uur voorbehandeling met metformine, een insuline sensibilisator, verhoogt de stofwisseling respons op insuline 5 assay. Aldus kan de zebravis blijken ideaal geheel diermodel geneesmiddelen die insulinegevoeligheid (embryo) versterken ontdekken en om hun effectiviteit vast te stellen verlichten obesitas gerelateerde insulineresistentie (volwassen) zijn.
De ontwikkeling van genetische en dieet geïnduceerde zwaarlijvige zebravis modellen die de waargenomen bij obese zoogdieren fenotypes bootsen creëert de impuls voor het initiëren van de zebravis stusterft gericht op metabole ziekten. High throughput testen zijn van essentieel belang voor de waarde van de zebravis model volledig waarderen studies van energie homeostase. Innovatieve instrumenten ontwikkeld om phagic rijden beoordelen zal zorgen voor schermen gericht op de energie-inname, terwijl de high throughput lipide opslag assays zullen leiden tot studies over het hele lichaam lipide homeostase 15-17. De assay hier beschreven verschaft een hoge doorvoer instrument om de rol van genen, verbindingen of hun interacties in gehele lichaam energieverbruik beoordelen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AlamarBlue | Fisher Scientific | 10-230-103 | Manufactured by Thermo Scientific |
| Fine Tip DisposableTransfer Pipette | Fisher Scientific | 13-711-26 | Manufactured by Thermo Scientific |
| Fisherbrand Graduated Disposable Transfer Pipette | Fisher Scientific | 13-771-9AM | Manufactured by Thermo Scientific |
| Black sided clear bottom 96-well plates | Fisher Scientific | 50-320-785 | Manufactured by E&K Scientific Products Inc. |
References
- Jao, L. E., Wente, S. R., Chen, W. Efficient multiplex biallelic zebrafish genome editing using a CRISPR nuclease system. PNAS. 110, 13904-13909 (2013).
- Kimura, Y., Hisano, Y., Kawahara, A., Higashijima, S. Efficient generation of knock-in transgenic zebrafish carrying reporter/driver genes by CRISPR/Cas9-mediated genome engineering. Sci. Rep. 4, 6545 (2014).
- Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nat. Rev. Genet. 8, 353-367 (2007).
- Brand, M. D., Couture, P., Else, P. L., Withers, K. W., Hulbert, A. J. Evolution of energy metabolism. Proton permeability of the inner membrane of liver mitochondria is greater in a mammal than in a reptile. Biochem. J. 275 (Pt 1), 81-86 (1991).
- Renquist, B. J., Zhang, C., Williams, S. Y., Cone, R. D. Development of an assay for high-throughput energy expenditure monitoring in the zebrafish. Zebrafish. 10, 343-352 (2013).
- Livingston, R. J. A volumetric respirometer for long-term studies of small aquatic animals. J.Mar. Biol. Assoc. U.K. 48, 485-497 (1968).
- Makky, K., Duvnjak, P., Pramanik, K., Ramchandran, R., Mayer, A. N. A whole-animal microplate assay for metabolic rate using zebrafish. J. Biomol. Screen. 13, 960-967 (2008).
- E3 medium (for zebrafish embryos) Cold Spring Harb. Protoc. , http://cshprotocols.cshlp.org/citmgr?gca=protocols%3B2011%2F10%2Fpdb.rec66449 (2011).
- Nasiadka, A., Clark, M. D.
- Brand, M., Granato, M., Nusslein-Volhard, C. Zebrafish, A practical approach. Nusslein-Volhard, C., Dahm, R. , Oxford University Press. (2002).
- Fry, F. E. J., Hart, J. S. Cruising speed of goldfish in relation to water temperature. J. Fish. Res. Board Can. 7, 169-175 (1948).
- Oka, T., et al. Diet-induced obesity in zebrafish shares common pathophysiological pathways with mammalian obesity. BMC physiol. 10 (21), (2010).
- Song, Y., Cone, R. D. Creation of a genetic model of obesity in a teleost. FASEB J. 21, 2042-2049 (2007).
- Maddison, L. A., Joest, K. E., Kammeyer, R. M., Chen, W. Skeletal muscle insulin resistance in zebrafish induces alterations in beta-cell number and glucose tolerance in an age and diet dependent manner. Am. J. physiol. Endocrinol. , (2015).
- Flynn, E. J. 3rd, Trent , C. M., Rawls, J. F. Ontogeny and nutritional control of adipogenesis in zebrafish (Danio rerio). J. lipid res. 50, 1641-1652 (2009).
- Shimada, Y., Hirano, M., Nishimura, Y., Tanaka, T. A high-throughput fluorescence-based assay system for appetite-regulating gene and drug screening. PloS one. 7, e52549 (2012).
- Tingaud-Sequeira, A., Ouadah, N., Babin, P. J. Zebrafish obesogenic test: a tool for screening molecules that target adiposity. J. lipid res. 52, 1765-1772 (2011).
