High Throughput<em&gt; Danio rerio</em&gt; Dépense énergétique Assay

Résumé

Les poissons-zèbres sont un organisme modèle important pour l’étude de l’homéostasie énergétique. En utilisant un indicateur redox sensible au NADH₂, alamar Blue, nous avons mis au point un test qui mesure le taux métabolique des larves de poisson-zèbre dans un format de plaque à 96 puits et peut être appliqué à la découverte de médicaments ou de gènes.

Résumé

Poisson zèbre sont une importante organisme modèle avec des avantages inhérents qui ont le potentiel pour faire un poisson zèbre modèle largement appliqué pour l'étude de l'homéostasie énergétique et l'obésité. La petite taille du poisson zèbre permet des dosages sur les embryons soient menées dans un format de plaque à 96 ou 384 puits, les technologies basées Morpholino et CRISPR promouvoir la facilité de manipulation génétique, et de traitement de la toxicomanie par l'application de bain est viable. En outre, le poisson-zèbre sont idéales pour les écrans avant génétique permettant la découverte de nouveaux gènes. Compte tenu de la relative nouveauté de poisson zèbre comme un modèle pour l'obésité, il est nécessaire de développer des outils qui exploitent pleinement ces avantages. Ici, nous décrivons une méthode pour mesurer la dépense énergétique en milliers de poisson zèbre embryonnaire simultanément. Nous avons développé ensemble une plate-forme de microplaques animal dans lequel nous utilisons des plaques à 96 puits pour isoler chaque poisson et nous évaluer production cumulative NADH _{2 à l'aide} disponible dans le commerce culture cellulaire viabilité rel'agent alamarBlue. Dans poïkilothermes la relation entre NADH ₂ production et la dépense d'énergie est étroitement liée. Cette analyse de la dépense d'énergie crée le potentiel pour cribler rapidement les manipulations génétiques ou pharmacologiques qui modifient directement des dépenses d'énergie ou modifient la réponse à un médicament appliquée (par exemple des sensibilisateurs à l'insuline).

Introduction

La souris est actuellement le modèle prédominant pour la recherche sur l'obésité. Le court intervalle de génération et des outils génétiques disponibles chez la souris ont été inégalée à ce jour. Cependant, le poisson zèbre a aussi un intervalle de génération court (3 - 4 mois) et dépasse même la souris dans la facilité de la manipulation génétique ^1,2. Le poisson zèbre maintient près de 90% des gènes de mammifères, tout en dépassant de loin la souris dans nombre de descendants et le potentiel pour une utilisation dans les écrans génétiques et drogues ^3.

Pour exploiter le potentiel du modèle de poisson zèbre pour....

Protocole

Remarque: Ce protocole suit les lignes directrices de l'Université de l'Arizona Bureau pour la conduite responsable de la recherche et a été approuvé par le Comité de protection des animaux et l'utilisation institutionnelle

1. élevage de poisson zèbre et de l'embryon Entretien

1. Préparer E3 moyen d'embryons ^8. Pour Faire 60x stocks solution, dissoudre 34,8 g NaCl, 1,6 g de KCl, 5,8 g _de CaCl2 ^● 2H _{2 O,} et 9,78 g _de MgCl2 ^● 6H _{2 O dans} 1,95 L ddiH ₂ O. Ajuster le pH à 7,2 en utilisant NaOH et HCl Ajuster le volume à l'ai....

Résultats

Solution de dosage ne ​​pas augmenter la fluorescence en l'absence de poisson embryonnaire (Figure 1). Cependant, le dosage est très sensible à de petits changements dans le taux de métabolisme dans le puits. Un poisson unique dans un puits crée un signal significativement différente de puits à blanc dans les 1 h (P <0,0001). La figure 2 fournit une représentation visuelle des signaux générés par les poissons embryonnaire après 24 heures d'incubation. Aux fins de cette image .......

Discussion

La contamination par des bactéries ou des champignons considérablement limiter l'application de cette analyse. Le bleu de méthylène dans le support d'embryon E3 limite la possibilité d'une contamination fongique. Tout au long de l'embryon cabrait il est essentiel que l'on prend soin de retirer les embryons morts deux fois par jour. En outre, il est indispensable de rincer abondamment les embryons avec le milieu d'embryon de E3 stérile sur le jour de l'analyse initiation. Ces 2 étapes de limit.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
AlamarBlue	Fisher Scientific	10-230-103	Fabriqué par Thermo Scientific
Pipette de transfert jetable à pointe fine	Fisher Scientific	13-711-26	Fabriqué par Thermo Scientific
Fisherbrand Pipette de transfert jetable graduée	Fisher Scientific	13-771-9AM	Fabriqué par Thermo Scientific
Plaques à fond transparent à flancs noirs à 96 puits	Fisher Scientific	50-320-785	Fabriqué par E& Produits K Scientific Inc.