Abstract
Zebrafish zebrafish ऊर्जा homeostasis और मोटापे के अध्ययन के लिए एक व्यापक रूप से लागू मॉडल बनाने की क्षमता है कि निहित लाभ के साथ एक महत्वपूर्ण मॉडल जीव हैं। भ्रूण पर assays के एक 96 या 384 अच्छी तरह से थाली प्रारूप में आयोजित किए जाने के लिए zebrafish के छोटे आकार की अनुमति देता है, morpholino और CRISPR आधारित प्रौद्योगिकियों स्नान आवेदन द्वारा आनुवंशिक हेरफेर में आसानी, और नशीली दवाओं के उपचार को बढ़ावा देने के लिए व्यवहार्य है। इसके अलावा, zebrafish उपन्यास जीन की खोज की अनुमति के लिए आगे आनुवंशिक स्क्रीन के लिए आदर्श होते हैं। मोटापे के लिए एक मॉडल के रूप में zebrafish के रिश्तेदार नवीनता को देखते हुए, यह पूरी तरह से इन लाभों का फायदा उठाने के लिए उपकरण विकसित करने के लिए आवश्यक है। इस के साथ साथ, हम एक साथ भ्रूण zebrafish के हजारों की संख्या में ऊर्जा व्यय को मापने के लिए एक विधि का वर्णन है। हम अलग-अलग मछली को अलग-थलग करने के लिए 96 अच्छी तरह से प्लेटों का उपयोग, जिसमें एक पूरे जानवर microplate मंच का विकास किया है और हम व्यावसायिक रूप से उपलब्ध सेल संस्कृति व्यवहार्यता फिर से का उपयोग कर संचयी एनएडीएच 2 उत्पादन का आकलनएजेंट alamarBlue। Poikilotherms में एनएडीएच 2 उत्पादन और ऊर्जा व्यय के बीच संबंधों को कसकर जुड़ा हुआ है। यह ऊर्जा व्यय परख तेजी से सीधे ऊर्जा व्यय को बदलने या एक आवेदन दवा (जैसे इंसुलिन sensitizers) के जवाब में परिवर्तन है कि औषधीय या आनुवंशिक जोड़तोड़ स्क्रीन करने के लिए संभावित बनाता है।
Introduction
माउस वर्तमान में मोटापा अनुसंधान के लिए प्रमुख मॉडल है। लघु पीढ़ी अंतराल और माउस में उपलब्ध आनुवंशिक उपकरणों की तारीख करने के लिए बेजोड़ किया गया है। हालांकि, zebrafish भी एक छोटी पीढ़ी अंतराल है (3-4 महीने) और आनुवंशिक हेरफेर 1,2 के आराम में भी माउस से बढ़कर है। अब तक आनुवांशिक और दवा स्क्रीन 3 में उपयोग के लिए वंश और संभावित की संख्या में माउस से अधिक है, जबकि zebrafish, स्तनधारी जीन का लगभग 90% का कहना है।
मोटापे में पढ़ाई के लिए zebrafish मॉडल की क्षमता का दोहन करने के लिए, assays के ऊर्जा व्यय सहित शरीर के वजन विनियमन, को प्रभावित करने वाले कारकों की जांच करने के लिए विकसित किया जाना चाहिए। चयापचयों β ऑक्सीकरण और tricarboxylic एसिड चक्र ऑक्सीजन के माध्यम से कार्रवाई कर रहे हैं के रूप में सेवन किया जाता है और NADH 2 उत्पादन किया जाता है। इस प्रकार, एनएडीएच 2 चयापचय मार्ग (मेटाबोलाइट ऑक्सीकरण) के माध्यम से चयापचयों के प्रवाह का एक सीधा संकेत है। Poikil मेंhomeotherms 4 की तुलना में 5 गुना कम - otherms, एच + एटीपी संश्लेषण से एनएडीएच 2 ऑक्सीकरण uncouples 4 है जो भीतरी mitochondrial झिल्ली के माध्यम से रिसाव। तदनुसार, zebrafish एनएडीएच में 2 बहुत कसकर ऑक्सीडेटिव फास्फोरिलीकरण के माध्यम से एटीपी उत्पादन से जुड़ा हुआ है। इस के साथ साथ, हम ऊर्जा व्यय 5 के लिए एक प्रॉक्सी के रूप में लार्वा zebrafish में एनएडीएच 2 उत्पादन उपाय है कि एक परख का वर्णन है।
आक्सीजन की खपत ऊर्जा व्यय को मापने के लिए स्वर्ण मानक है। फिर भी, सबसे अच्छा zebrafish के उच्च throughput क्षमता का लाभ लेने के लिए, ऊर्जा व्यय के assays के उच्च throughput के लिए उत्तरदायी होना चाहिए। सिस्टम घूम एक बंद कक्ष पर निर्भर करती है कि ऑक्सीजन की खपत सिस्टम 6 उपलब्ध कक्षों की संख्या से throughput में सीमित हैं। खुली हवा ओ 2 खपत / सीओ 2 उत्पादन assays भी zebrafish 5,7 में लागू किया गया है। ये खुली हवा में 96 अच्छी तरह से थाली आधारविकास सिस्टम उच्च throughput के लिए उत्तरदायी हैं। दुर्भाग्य से, पर्यावरण के साथ गैस विनिमय इन परीक्षणों की संवेदनशीलता को सीमित करता है। हमने हाल ही में रेडोक्स सूचक alamarBlue 5 का उपयोग कर एनएडीएच 2 पर नज़र रखता है कि एक परख के आवेदन को प्रकाशित किया। इस परख throughput और zebrafish में ऑक्सीजन की खपत के विश्लेषण के लिए आम संवेदनशीलता में सीमाओं पर काबू।
zebrafish पूरे शरीर को ऊर्जा homeostasis के अध्ययन के लिए एक तेजी से महत्वपूर्ण मॉडल बनता जा रहा है। भाग में, zebrafish क्योंकि आगे आनुवंशिक स्क्रीन और दवा स्क्रीन में उपयोग करने के लिए उत्तरदायी हैं। इसके अलावा, पछाड़ना और दस्तक, जल्दी से लागू किया जा सकता सहित आनुवंशिक हेरफेर को निशाना बनाया। हम पहले इस परख यौगिकों और चयापचय दर 5 बदल कि जीन की पहचान करने के लिए स्नान दवा आवेदन और आनुवंशिक पछाड़ना या पीटकर के साथ जोड़ा जा सकता है कि पता चला है। इसके अलावा, इस परख zebrafish के लिए निहित उच्च throughput लाभ का फायदा उठाने के लिए बनाया गया है।
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Protocol
नोट: इस प्रोटोकॉल अनुसंधान के जिम्मेदार आचरण के लिए एरिजोना कार्यालय विश्वविद्यालय के दिशा-निर्देशों का पालन करता है और संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया है
1. Zebrafish प्रजनन और भ्रूण रखरखाव
- E3 भ्रूण माध्यम 8 तैयार करें। 60x शेयर समाधान बनाने के लिए, 1.95 एल ddiH 2 ओ में 34.8 ग्राम सोडियम क्लोराइड, 1.6 ग्राम KCl, 5.8G 2 CaCl ● 2H 2 हे, और 9.78 ग्राम 2 MgCl ● 6H 2 हे भंग DdiH 2 ओ का उपयोग कर 2 एल मात्रा समायोजित NaOH और एचसीएल का उपयोग 7.2 पीएच को समायोजित करें
- 1 एल ddiH20 में 16.5 मिलीलीटर 60x शेयर पतला, 1x E3 भ्रूण मध्यम तैयार करने के लिए। 100 μl 1% methylene नीले जोड़ें।
- प्रजनन
- हाउस पुरुष और महिला बच्चे शेयर (7 - उम्र के 18 महीने) अलग से उपजाऊपन को अधिकतम करने के लिए।
- अंडे वांछित हैं पहले दिन से पहले 2 घंटा - 1 बंद रोशनी बारी। ग में - सेट अप संभोग (2 महिलाओं 1 पुरुष और 1)Rossing पिंजरों के रूप में पहले 9 का वर्णन किया। वे वयस्क मछली आयोजित कर रहे हैं जिसमें टैंक डालने के छिद्रित आधार के माध्यम से पास के रूप में अंडे शिकार बचने के लिए पार पिंजरों अनुमति देते हैं।
- वैकल्पिक:। समयबद्ध प्रजनन के लिए, (morpholino इंजेक्शन शामिल अध्ययन के लिए आवश्यक होगा के रूप में), एक स्पष्ट प्लास्टिक विभक्त द्वारा नर और मादा मछली को अलग, अंडे और निषेचन की समय पर बिछाने में परिणाम के लिए सुबह में इस निकालें। Morpholino पढ़ाई के लिए, इलाज के प्रति अपेक्षित भ्रूण मछली की संख्या का आकलन करने के लिए बिजली की गणना करते हैं। प्रभाव या परिवर्तन की भयावहता का अनुमान बिना, एक प्रारंभिक परीक्षण एक n = 8 के साथ चलाया जा सकता है।
- (- 150 भ्रूण / 10 सेमी पेट्री डिश 100) एक पेट्री डिश में क्रासिंग पिंजरे से अंडे डालो। अंडे पकवान के नीचे बसा है और पानी टपकना करने की अनुमति दें। एक अच्छी टिप डिस्पोजेबल हस्तांतरण पिपेट का उपयोग कर किसी भी शेष पानी निकाल दें। 1.1 चरण में बनाया E3 भ्रूण माध्यम वापस जोड़ें।
- वायुसेना बनाओभविष्य अंडा और मछली के हस्तांतरण के लिए लंगड़ा पॉलिश डिस्पोजेबल पिपेट। कैंची का प्रयोग, 0.25 मिलीग्राम स्नातक स्तर पर एक स्नातक की उपाधि प्राप्त डिस्पोजेबल हस्तांतरण पिपेट काटा। किसी न किसी किनारों, ज्योति पोलिश एक लेम्प बर्नर पर कटौती टिप को दूर करने के लिए।
- Zebrafish E3 भ्रूण माध्यम में पेट्री डिश में 28.5 ○ सी पर बाद निषेचन 10 सेमी में (DPF) 4 दिनों के लिए भ्रूण मछली बनाए रखें दो बार प्रत्येक दिन, एक लौ किसी unfertilized अंडे या मृत भ्रूण (अपारदर्शी सफेद उपस्थिति) को हटाने के लिए डिस्पोजेबल हस्तांतरण पिपेट स्नातक की उपाधि प्राप्त पॉलिश का उपयोग करें। प्रत्येक दिन एक बार, E3 भ्रूण मध्यम जगह। एक अच्छी टिप डिस्पोजेबल हस्तांतरण पिपेट का उपयोग कर शेष तरल निकालने, E3 भ्रूण माध्यम डालो, और पूर्व गर्म (28.5 ○ सी) E3 भ्रूण माध्यम वापस जोड़ने।
2. परख समाधान तैयार
- 0.22 सुक्ष्ममापी फिल्टर का उपयोग कर तालिका 1. बाँझ फिल्टर परख समाधान के अनुसार परख समाधान तैयार है। एक 28.5 ○ सी में बाँझ परख समाधान, दीक्षा परख गर्म करने से पहलेपानी स्नान।
| घटक | % का कुल | मात्रा (μl / 10 एमएल) |
| 60x E3 भ्रूण मध्यम | 1.667 | 166.7 |
| डबल विआयनीकृत (DDI) एच 2 0 | 96.233 | 9623.3 |
| Alamar ब्लू | 1 | 100 |
| 400 मिमी NaOH | 1 | 100 |
| DMSO | 0.1 | 10 |
तालिका 1 परख माध्यम
3. परख प्रदर्शन
- Zebrafish भ्रूण बाँझ फ़िल्टर E3 भ्रूण मध्यम के साथ 3 बार कुल्ला। एक बीकर में क्लच से सभी व्यवहार्य zebrafish भ्रूण का मिश्रण। बाँझ फिल्टर 75 मिलीलीटर E3 भ्रूण माध्यम। ठीक एक टिप डिस्पोजेबल हस्तांतरण पिपेट पुनः का उपयोगसंभव के रूप में zebrafish भ्रूण से E3 भ्रूण माध्यम के रूप में ज्यादा चलते हैं। 20 मिलीलीटर बाँझ फ़िल्टर E3 भ्रूण माध्यम वापस जोड़ें। निकालें और E3 भ्रूण माध्यम 3 गुना की जगह।
- एक 96 अच्छी तरह से काला के 93 कुओं में से प्रत्येक में प्लेट एक मछली स्पष्ट नीचे की थाली दिया। एक लौ प्लास्टिक डिस्पोजेबल हस्तांतरण पिपेट स्नातक की उपाधि प्राप्त पॉलिश के भीतर अलग-अलग (1.5 कदम) एक भ्रूण पर कब्जा करने और धीरे कुएं में बाहर खदेड़ना द्वारा थाली करने के लिए भ्रूण मछली स्थानांतरण। 3 खाली कुओं में rinsed मछली युक्त बीकर से लिया E3 भ्रूण माध्यम स्थानांतरण। इस खाली कुओं मछली होते हैं कि कुओं के रूप में ठीक उसी पानी को उजागर किया गया है। मछली और खाली कुओं में होते हैं कि दोनों कुओं इस कदम के समापन पर (200 μl) में कम से कम आधा भरा होना चाहिए।
- खाली कुओं सहित सभी 96 कुओं में परख समाधान के साथ E3 के भ्रूण के माध्यम से बदलें। यह कदम एक 96 अच्छी तरह से थाली में 12 कॉलम से प्रत्येक के लिए एक समय में एक स्तंभ किया जाना चाहिए। ठीक एक टिप का उपयोग डिस्पोजेबल किन्नरफेर पिपेट, प्लेट (8 कुओं) के एक स्तंभ में हर अच्छी तरह से E3 भ्रूण माध्यम को हटा दें। Zebrafish भ्रूण स्पर्श नहीं करने के लिए ध्यान रखना। पानी में अच्छी तरह से हटा दिया गया था, जिसमें से प्रत्येक के लिए परख समाधान के 300 μl जोड़ें। प्लेट के सभी 12 कॉलम के लिए परख समाधान के साथ E3 भ्रूण मध्यम और प्रतिस्थापन के हटाने दोहराएँ।
- वैकल्पिक: एक यौगिक के जवाब में चयापचय दर परिवर्तन का परीक्षण करने के लिए, 100 गुना (100x) वांछित उपचार एकाग्रता है कि एक समाधान करें। ध्यान से, 100x समाधान 0.1% से अधिक नहीं करने के लिए अंतिम DMSO एकाग्रता सीमित करने के लिए 10% DMSO से अधिक नहीं है कि यह सुनिश्चित करें। उपचार के कुओं में से प्रत्येक के लिए 100x समाधान के 3 μl जोड़ें।
नोट: उपचार के कुओं की संख्या का आकलन करने के लिए बिजली की गणना प्रदर्शन। हालांकि, प्रतिक्रिया या परिवर्तन की भयावहता का अनुमान बिना, एक प्रारंभिक परीक्षण में इलाज 8 यौगिक और मछली होते हैं कि 8 वाहन इलाज नियंत्रण कुओं में चलाया जा सकता है।- (नियंत्रण करने के लिए कोई DRU वाहन पर नियंत्रण के 3 μl जोड़ेंजी उपचार) मछली होते हैं कि कुओं। परिसर में फ्लोरोसेंट प्रतिक्रिया मछली के भीतर कार्रवाई का एक परिणाम है कि यह सुनिश्चित करने के लिए, एक 96 अच्छी तरह से थाली में 3 खाली कुओं के लिए दवा और वाहन के उपचार लागू होते हैं।
- 590 एनएम पर 530 एनएम पर उत्तेजना तरंगदैर्ध्य और तरंग दैर्ध्य उत्सर्जन के साथ फ्लोरोसेंट प्लेट रीडर पर मछली भरी थाली पढ़ें।
- Humidified इनक्यूबेटर में जगह की थाली 28.5 ○ सी (परख समाधान की photobleaching से बचने के लिए परख भर अंधेरे में प्लेट बनाए रखने) के लिए निर्धारित किया है। परख 1 घंटा से 24 घंटा तक होती है कि समय की अवधि के लिए चलाया जा सकता है। परख की अवधि के अध्ययन के उद्देश्य पर निर्भर करता है। एक छोटी अवधि के सबसे उपयुक्त हो सकता है एक छोटी अभिनय गैर स्थिर यौगिक के जवाब के परीक्षण के लिए। फिर भी, स्थिर यौगिक परीक्षण या आनुवंशिक प्रभाव का परीक्षण, के लिए परख अवधि अधिकतम संचयी संकेत के साथ जुड़े लाभ का फायदा उठाने के लिए बेहतर है।
- एक पूर्व निर्धारित समय बिंदु पर (समय निर्धारित करने में मदद करने के लिए 3.6 कदम देखें)3.5 कदम के रूप में एक ही सेटिंग के साथ फिर से मछली भरी थाली के प्रतिदीप्ति पढ़ा।
4. उपचार के साथ प्रतिदीप्ति एसोसिएटेड में रिश्तेदार परिवर्तन का आकलन
- अच्छी तरह से अध्ययन के समापन पर प्रतिदीप्ति से समय 0 पर प्रतिदीप्ति घटाकर प्रत्येक के प्रतिदीप्ति में परिवर्तन की गणना। मछली (कारतूस) के बिना वेल्स मछली होते हैं कि कुओं से दूर मूल्यों के नीचे, 0 के पास मूल्यों होनी चाहिए।
समापन पर प्रतिदीप्ति = प्रतिदीप्ति में बदलें - प्रतिदीप्ति समय 0 पर - नियंत्रण कुओं तो नियंत्रण कुओं के प्रतिदीप्ति में औसत परिवर्तन से प्रत्येक अच्छी तरह से प्रतिदीप्ति में परिवर्तन को विभाजित करने के लिए प्रतिदीप्ति में रिश्तेदार परिवर्तन का पता लगाने के लिए, प्रतिदीप्ति में औसत परिवर्तन की गणना। ध्यान से, नियंत्रण वाहन नियंत्रण या आनुवंशिक नियंत्रण तो किया जा सकता है।
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Representative Results
परख समाधान भ्रूण मछली (चित्रा 1) के अभाव में प्रतिदीप्ति वृद्धि नहीं करता है। हालांकि, परख अच्छी तरह से भीतर चयापचय दर में छोटे बदलाव करने के लिए बेहद संवेदनशील है। एक अच्छी तरह से भीतर एक ही मछली 1 घंटा (पी <0.0001) के भीतर खाली कुओं से काफी अलग एक संकेत बनाता है। 2 ऊष्मायन के 24 घंटे के बाद भ्रूण मछली से उत्पन्न संकेतों के एक दृश्य प्रतिनिधित्व प्रदान करता है चित्रा। इस तस्वीर के प्रयोजन के लिए स्पष्ट तरफा कुओं इस्तेमाल किया गया। फिर भी, काला तरफा कुओं पास के कुओं से फ्लोरोसेंट संकेत के leaching को रोकने के लिए परख प्रदर्शन के लिए पसंद कर रहे हैं।
AlamarBlue की एनएडीएच 2 प्रेरित कमी गैर प्रतिवर्ती है, क्योंकि संकेत समय के साथ जम जाता है। छोटे परिवर्तन परिलक्षित किया जा करने के लिए अनुमति देता है। मतभेद जमा है और इस तरह समय के साथ वृद्धि हुई है कि दिखाने के लिए, हम रिश्तेदार, 1 पर 5 मछली के लिए 1 से 2 प्रेरित प्रतिदीप्ति में परिवर्तन, और 4 घंटा (निगरानी रखीचित्रा 3)। मछली के प्रत्येक संख्या में अच्छी तरह / प्रतिदीप्ति में रिश्तेदार परिवर्तन काफी समय (पी <0.001) के साथ वृद्धि हुई है। संकेत समय के साथ जम जाता है क्योंकि इससे भी महत्वपूर्ण बात, मछलियों की संख्या में हेर-फेर से होने वाली प्रतिदीप्ति परिवर्तन में मतभेद की भयावहता / अच्छी तरह से ऊष्मायन के 1 घंटा में से 4 घंटा में अधिक मजबूत है। इस प्रकार, जोखिम की अवधि को बढ़ाने के द्वारा हम किसी दिए गए उपचार के साथ जुड़े मतभेदों को पता लगाने की क्षमता बढ़ा सकते हैं।
चित्रा सिग्नल के लिए शोर 1. तुलना करें। प्रतिदीप्ति में एक detectable परिवर्तन 1 घंटा में एक 96 अच्छी तरह से थाली में 1 zebrafish से उत्पन्न होता है। मछली (रिक्त स्थान) होते थोड़ा संकेत उत्पन्न नहीं है कि वेल्स। त्रुटि सलाखों SEM प्रतिनिधित्व (एन = 5-8)। का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करेंयह आंकड़ा।
चित्रा 24 घंटा पर परख थाली 2. दृश्य प्रतिनिधित्व। इस परख का उपयोग कर प्राप्त परिणामों के प्रतिनिधि चित्र। गुलाबी कुओं एक उच्च चयापचय दर, बैंगनी कुओं एक उदारवादी चयापचय दर, और नीले रंग के कुओं एक कम चयापचय दर के साथ मछली के संकेत हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 3. सिग्नल मतभेद समय के साथ बढ़ाना। / अच्छी तरह से समय के साथ बढ़ जाती है मछली की संख्या अलग से उत्पन्न फ्लोरोसेंट संकेत में अंतर। संकेत समय के साथ जम जाता है, क्योंकि प्रतिदीप्ति परिवर्तन की भयावहता समय betweensamples टी के साथ divergesटोपी संकेत पीढ़ी की दर में मतभेद है। त्रुटि सलाखों SEM प्रतिनिधित्व (एन = 7)।
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Discussion
बैक्टीरिया या कवक के साथ प्रदूषण को बहुत इस परख के आवेदन सीमित कर देगा। E3 भ्रूण माध्यम में methylene नीले फंगल संक्रमण की संभावना को सीमित करता है। भ्रूण के दौरान यह ध्यान दो बार प्रत्येक दिन मृत भ्रूण को दूर करने के लिए लिया जाता है, महत्वपूर्ण है कि पालन। इसके अतिरिक्त, यह अच्छी तरह से परख दीक्षा के दिन बाँझ E3 भ्रूण माध्यम से भ्रूण कुल्ला करने के लिए आवश्यक है। इन 2 चरणों भ्रूण के जीवाणु संक्रमण के लिए क्षमता की सीमा। 3.2 चरण में वर्णित खाली कुओं के शामिल किए जाने के किसी भी जीवाणु संक्रमण का पता लगाने के लिए अनुमति देता है। एक औसत दर्जे का संकेत है कि पैदावार जीवाणु संक्रमण दुर्लभ है। खाली कुओं एक मजबूत संकेत दिखा कर हालांकि, अगर परख भ्रूण सफाई बनाए रखने के लिए उठाए गए देखभाल के साथ दोहराया जाना चाहिए। उपयोगकर्ता संदूषण भ्रूण संग्रह करने से पहले उत्पन्न होने वाली है उम्मीद है कि अगर पहले से (पृ। 22) 10 में वर्णित के रूप में, भ्रूण प्रक्षालित किया जा सकता है। वैकल्पिक रूप से, प्रयोगकर्ता को संदेह है कि यदिसंदूषण उपयोगकर्ता 4 DPF (पृ। 23) 10 पीछे करने के लिए पेनिसिलिन और स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ भ्रूण E2 उपयोग कर सकते हैं संग्रह के बाद हो रहा है।
इस परख भ्रूण में आवेदन के लिए मूल्यवान है, हम वयस्क zebrafish में वैधता के लिए परीक्षण नहीं किया है। हम इस परख की कार्यक्षमता AlamarBlue के गरीब ऊतक प्रवेश द्वारा वयस्क मछली में सीमित हो जाएगा कि संदेह है। इसके अलावा, खिला मछली में पेट microbiota मछली चयापचय का संकेत नहीं एक गहरा संकेत, उत्पादन हो सकता है। इस प्रकार, इस परख भ्रूण मछली खिलाने की जर्दी में उपयोग करने के लिए प्रतिबंधित है। इस गतिविधि प्रेरित ऊर्जा व्यय 11 के साथ संबद्ध किया जाएगा कि परिवर्तनशीलता की सीमा के रूप में भ्रूण मछली के रिश्तेदार निष्क्रियता, एक अनूठा लाभ प्रदान करता है। इस प्रकार इस परख एक पूरे जानवर प्रणाली में आनुवंशिक या औषधीय हेरफेर करने के लिए चयापचय दर प्रतिक्रिया स्क्रीन करने के लिए एक अनूठा उपकरण है।
zebrafish तेजी से मीटर के लिए एक अग्रणी मॉडल बनता जा रहा हैकि मोटापे के साथ etabolic अव्यवस्थाएं। वास्तव में, दोनों ट्रांसजेनिक और आहार प्रेरित zebrafish मोटापा 12,13 के मॉडल प्रकाशित कर रहे हैं। माउस मॉडल के लिए इसी प्रकार, zebrafish में आहार प्रेरित मोटापा सीरम ट्राइग्लिसराइड्स और यकृत लिपिड संचय 12 बढ़ जाती है। इसके अलावा, overfed zebrafish ग्लूकोज असहिष्णुता 14, सुझाव उपवास ग्लूकोज उठाया है। यहाँ वर्णित हम मेटफोर्मिन, एक इंसुलिन sensitizer, साथ pretreatment के 24 घंटा इंसुलिन उपचार के लिए 5 चयापचय दर प्रतिक्रिया बढ़ जाती है पता चला है कि परख का प्रयोग। इस प्रकार, zebrafish इंसुलिन के प्रति संवेदनशीलता (भ्रूण) को बढ़ाने कि दवाओं की खोज के लिए और मोटापे से संबंधित इंसुलिन प्रतिरोध (वयस्क) को समाप्त करने में अपने प्रभाव स्थापित करने के लिए एक आदर्श पूरे पशु मॉडल साबित हो सकता है।
मोटापे से ग्रस्त स्तनधारियों में मनाया phenotypes कि नकल आनुवंशिक और आहार प्रेरित मोटे zebrafish मॉडल के विकास के लिए zebrafish स्टू की शुरुआत के लिए प्रोत्साहन बनाता हैचयापचय रोग पर ध्यान केंद्रित मर जाता है। उच्च throughput assays के लिए पूरी तरह से ऊर्जा homeostasis के अध्ययन के लिए zebrafish मॉडल के मूल्य की प्रशंसा के लिए आवश्यक हैं। उच्च throughput लिपिड भंडारण assays के पूरे शरीर लिपिड समस्थिति 15-17 पर अध्ययन करने के लिए नेतृत्व करेंगे, जबकि phagic ड्राइव का आकलन करने के लिए बनाया गया नवीन उपकरणों, ऊर्जा खपत पर ध्यान केंद्रित स्क्रीन के लिए अनुमति देगा। हम यहाँ वर्णन परख जीन, यौगिकों या पूरे शरीर को ऊर्जा व्यय पर उनकी बातचीत की भूमिका का आकलन करने के लिए एक उच्च throughput उपकरण प्रदान करता है।
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AlamarBlue | Fisher Scientific | 10-230-103 | Manufactured by Thermo Scientific |
| Fine Tip DisposableTransfer Pipette | Fisher Scientific | 13-711-26 | Manufactured by Thermo Scientific |
| Fisherbrand Graduated Disposable Transfer Pipette | Fisher Scientific | 13-771-9AM | Manufactured by Thermo Scientific |
| Black sided clear bottom 96-well plates | Fisher Scientific | 50-320-785 | Manufactured by E&K Scientific Products Inc. |
References
- Jao, L. E., Wente, S. R., Chen, W. Efficient multiplex biallelic zebrafish genome editing using a CRISPR nuclease system. PNAS. 110, 13904-13909 (2013).
- Kimura, Y., Hisano, Y., Kawahara, A., Higashijima, S. Efficient generation of knock-in transgenic zebrafish carrying reporter/driver genes by CRISPR/Cas9-mediated genome engineering. Sci. Rep. 4, 6545 (2014).
- Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nat. Rev. Genet. 8, 353-367 (2007).
- Brand, M. D., Couture, P., Else, P. L., Withers, K. W., Hulbert, A. J. Evolution of energy metabolism. Proton permeability of the inner membrane of liver mitochondria is greater in a mammal than in a reptile. Biochem. J. 275 (Pt 1), 81-86 (1991).
- Renquist, B. J., Zhang, C., Williams, S. Y., Cone, R. D. Development of an assay for high-throughput energy expenditure monitoring in the zebrafish. Zebrafish. 10, 343-352 (2013).
- Livingston, R. J. A volumetric respirometer for long-term studies of small aquatic animals. J.Mar. Biol. Assoc. U.K. 48, 485-497 (1968).
- Makky, K., Duvnjak, P., Pramanik, K., Ramchandran, R., Mayer, A. N. A whole-animal microplate assay for metabolic rate using zebrafish. J. Biomol. Screen. 13, 960-967 (2008).
- E3 medium (for zebrafish embryos) Cold Spring Harb. Protoc. , http://cshprotocols.cshlp.org/citmgr?gca=protocols%3B2011%2F10%2Fpdb.rec66449 (2011).
- Nasiadka, A., Clark, M. D.
- Brand, M., Granato, M., Nusslein-Volhard, C. Zebrafish, A practical approach. Nusslein-Volhard, C., Dahm, R. , Oxford University Press. (2002).
- Fry, F. E. J., Hart, J. S. Cruising speed of goldfish in relation to water temperature. J. Fish. Res. Board Can. 7, 169-175 (1948).
- Oka, T., et al. Diet-induced obesity in zebrafish shares common pathophysiological pathways with mammalian obesity. BMC physiol. 10 (21), (2010).
- Song, Y., Cone, R. D. Creation of a genetic model of obesity in a teleost. FASEB J. 21, 2042-2049 (2007).
- Maddison, L. A., Joest, K. E., Kammeyer, R. M., Chen, W. Skeletal muscle insulin resistance in zebrafish induces alterations in beta-cell number and glucose tolerance in an age and diet dependent manner. Am. J. physiol. Endocrinol. , (2015).
- Flynn, E. J. 3rd, Trent , C. M., Rawls, J. F. Ontogeny and nutritional control of adipogenesis in zebrafish (Danio rerio). J. lipid res. 50, 1641-1652 (2009).
- Shimada, Y., Hirano, M., Nishimura, Y., Tanaka, T. A high-throughput fluorescence-based assay system for appetite-regulating gene and drug screening. PloS one. 7, e52549 (2012).
- Tingaud-Sequeira, A., Ouadah, N., Babin, P. J. Zebrafish obesogenic test: a tool for screening molecules that target adiposity. J. lipid res. 52, 1765-1772 (2011).
