Abstract
Zebrafish sono un importante organismo modello con vantaggi inerenti che hanno il potenziale per fare zebrafish un modello ampiamente utilizzato per lo studio della omeostasi energetica e obesità. Le piccole dimensioni di zebrafish permette di saggi sugli embrioni da condurre in un formato piatto 96- o 384 pozzetti, tecnologie Morpholino e CRISPR basate promuovere la facilità di manipolazione genetica, e il trattamento farmacologico per applicazione bagno è praticabile. Inoltre, zebrafish sono ideali per schermi genetici a termine che consentono di scoperta del gene romanzo. Data la relativa novità di zebrafish come modello per l'obesità, è necessario sviluppare strumenti che sfruttino appieno questi benefici. Qui, si descrive un metodo per misurare il dispendio energetico in migliaia di zebrafish embrioni contemporaneamente. Abbiamo sviluppato una piattaforma completamente microplacca animale in cui usiamo piastre a 96 pozzetti per isolare singoli pesci e noi valutare cumulativo NADH 2 produzione utilizzando il disponibile in commercio coltura cellulare vitalità reagente alamarBlue. Nel poichilotermi il rapporto tra NADH 2 produzione e la spesa energetica è strettamente legata. Questo test dispendio energetico crea il potenziale per lo screening rapido manipolazioni farmacologiche o genetiche che alterano direttamente la spesa energetica o alterano la risposta ad un farmaco applicato (ad esempio sensibilizzatori dell'insulina).
Introduction
Il mouse è attualmente il modello predominante per la ricerca di obesità. L'intervallo breve generazione e strumenti genetiche disponibili nel topo sono stati fino ad oggi senza pari. Tuttavia, il pesce zebra ha anche un intervallo di generazione breve (3 - 4 mesi) e supera anche il mouse in facilità di manipolazione genetica 1,2. Il pesce zebra mantiene quasi il 90% dei geni dei mammiferi, mentre di gran lunga superiore il mouse in numero di figli e il potenziale per l'uso in schermi genetici e droga 3.
Per sfruttare il potenziale del modello di zebrafish per gli studi in obesità, le analisi devono essere sviluppati per indagare i fattori che influenzano il corpo regolazione del peso, comprese le spese di energia. Come metaboliti vengono elaborati tramite β-ossidazione e l'ossigeno ciclo degli acidi tricarbossilici viene consumato e NADH 2 viene prodotto. Così, NADH 2 è un indicatore diretto del flusso di metaboliti attraverso vie metaboliche (metabolita ossidazione). In poikilotherms, H + perdite attraverso la membrana mitocondriale interna, che disaccoppia NADH 2 ossidazione dalla sintesi di ATP, è 4 - 5 volte inferiore negli esseri omeotermi 4. Di conseguenza, in NADH zebrafish 2 è molto strettamente legata alla produzione di ATP attraverso la fosforilazione ossidativa. Qui, descriviamo un metodo che misura NADH 2 produzione nel zebrafish larvale come proxy per dispendio energetico 5.
Il consumo di ossigeno è il gold standard per la misurazione della spesa energetica. Tuttavia, per sfruttare al meglio l'elevato potenziale rendimento del zebrafish, saggi di dispendio energetico devono essere suscettibili di high-throughput. Sistemi di consumo di ossigeno che dipendono da una camera chiusa sistema di circolazione sono limitati nella velocità per il numero di camere disponibili 6. Open air consumo di O 2 / CO 2 test di produzione è stato applicato anche nel zebrafish 5,7. Questi all'aperto 96 pozzetti piastra di basesistemi d sono suscettibili di throughput elevato. Sfortunatamente, lo scambio di gas con l'ambiente limita sensibilità di questi test. Abbiamo recentemente pubblicato l'applicazione di un metodo che monitora NADH 2 utilizzando l'indicatore redox alamarBlue 5. Questo saggio supera i limiti di produttività e sensibilità comune per analisi di consumo di ossigeno in zebrafish.
Il pesce zebra sta diventando un modello sempre più importante per gli studi di tutto omeostasi energia del corpo. In parte, perché zebrafish sono suscettibili di utilizzare schermi genetici avanti e schermi di droga. Inoltre, mirata manipolazione genetica, tra cui knockdown e knock-in, può essere applicato rapidamente. Abbiamo precedentemente dimostrato che questo test può essere combinato con l'applicazione di droga bagno e atterramento genetica o knockout per identificare i composti e geni che alterano il tasso metabolico 5. Inoltre, questo test è stato progettato per sfruttare i vantaggi di throughput elevati inerenti il pesce zebra.
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Protocol
Nota: Questo protocollo segue le linee guida della University of Arizona Ufficio per una gestione responsabile della Ricerca ed è stato approvato dalla cura degli animali e del Comitato Usa Istituzionale
1. Allevamento Zebrafish e Embryo manutenzione
- Preparare E3 embrione media 8. Fare 60x soluzione madre, sciogliere 34,8 g di NaCl, 1,6 g KCl, 5.8g CaCl 2 ● 2H 2 O, e 9,78 g MgCl 2 ● 6H 2 O a 1,95 L ddiH 2 O. Regolare il pH a 7,2 con NaOH e HCl Regolare il volume a 2 L utilizzando ddiH 2 O.
- Per preparare 1x E3 medio embrione, diluire 16,5 ml 60x magazzino in 1 L ddiH20. Aggiungere 100 ml 1% di blu di metilene.
- Allevamento
- Casa Maschio e femmina nidiata magazzino (7 - 18 mesi di età) separatamente per massimizzare la fecondità.
- Spegnere le luci 1-2 ore prima del giorno precedente uova sono desiderati. Impostare l'accoppiamento (1 maschio e 1 - 2 femmine) in cgabbie Rossing come precedentemente descritto 9. Gabbie Crossing consentono per le uova di sfuggire predazione che passano attraverso la base forata dell'inserto vasca in cui i pesci adulti sono detenuti.
- Optional:. Per la riproduzione temporizzata, (come sarebbe necessario per gli studi che coinvolgono morfolino iniezione), separare il maschio e pesce femmina da un chiaro divisorio in plastica, Rimuovi questa mattina di provocare temporizzato deposizione delle uova e la fecondazione. Per morpholino studi, eseguire calcoli di potenza per valutare il numero di pesci embrionale necessaria per il trattamento. Senza una stima della dimensione dell'effetto o variazione, una prova preliminare può essere eseguito con un n = 8.
- Versare le uova da gabbia traversata in una capsula di Petri (100 - 150 embrioni / 10 centimetri di Petri). Lasciare le uova di depositarsi sul fondo del piatto e versare l'acqua. Rimuovere eventuale acqua residua con una punta fine trasferimento monouso pipetta. Aggiungere indietro medio E3 embrione fatto in fase 1.1.
- Fai afzoppo pipetta monouso lucido per il futuro di uova e il trasferimento del pesce. Utilizzando le forbici, tagliare una pipetta di trasferimento monouso diplomato al diploma 0,25 ml. Per rimuovere i bordi irregolari, polacco fiamma la punta taglio sopra un becco Bunsen.
- Mantenere pesce embrionale a 4 giorni dopo la fecondazione (DPF) di 10 cm capsule di Petri in zebrafish media E3 embrione a 28,5 ○ C. Due volte al giorno, utilizzare fiamme lucido laureato monouso pipetta di trasferimento per rimuovere eventuali uova non fecondate o embrioni morti (aspetto bianco opaco). Una volta al giorno, sostituire E3 medio embrione. Eliminare E3 medio embrione, rimuovere il liquido restante con una punta fine trasferimento monouso pipetta e aggiungere di nuovo pre-riscaldato (28,5 ○ C) E3 medio embrione.
2. Preparare Assay Solution
- Preparare la soluzione test secondo la Tabella 1. Soluzione saggio Filtro sterile utilizzando un filtro da 0,22 micron. Prima del dosaggio iniziazione, scaldare la soluzione test sterile in una 28,5 ○ Cbagnomaria.
| Ingrediente | % Del totale | Volume (ml / 10 ml) |
| 60x E3 Embrione Media | 1.667 | 166,7 |
| Doppia deionizzata (DDI) H 2 0 | 96,233 | 9.623,3 |
| Alamar blu | 1 | 100 |
| NaOH 400 mm | 1 | 100 |
| DMSO | 0.1 | 10 |
Tabella 1. Assay Media
3. Eseguire Assay
- Sciacquare embrioni di zebrafish 3 volte con sterile filtrata medio embrione E3. Unire tutti gli embrioni vitali zebrafish dalla frizione in un bicchiere. Filtro sterile da 75 ml E3 medio embrione. Utilizzando una punta fine trasferimento monouso pipetta, rispostare tanto del mezzo embrione E3 dagli embrioni zebrafish possibile. Aggiungere 20 ml di nuovo sterile filtrata medio embrione E3. Rimuovere e sostituire E3 medio embrione 3 volte.
- Tavola 1 pesce in ciascuno dei 93 pozzetti di una nera 96 pozzetti lati chiara piatto fondo. Trasferire il pesce embrionale alla piastra catturando individualmente un embrione all'interno di una fiamma lucido laureato plastica pipetta usa e getta (punto 1.5) e l'espulsione delicatamente nel pozzo. Trasferire E3 embrione medio tratto dal bicchiere contenente pesce risciacquati nei 3 pozzetti del bianco. Questo assicura che i pozzi vuoti sono stati esposti per la stessa acqua dei pozzi che contengono pesci. Entrambi i pozzetti che contengono pesce e pozzetti vuoti devono essere almeno a metà (200 microlitri) al termine di questa fase.
- Sostituire E3 medio embrione con la soluzione di test in tutti i 96 pozzi, tra cui pozzetti del bianco. Questa operazione deve essere eseguita 1 colonna alla volta per ciascuna delle 12 colonne in una piastra da 96 pozzetti. Utilizzando una punta fine e getta transfer pipetta, rimuovere E3 medio embrione da ciascun pozzetto in una colonna della piastra (8 pozzetti). Fare attenzione a non toccare l'embrione zebrafish. Aggiungere 300 ml di soluzione di dosaggio per ciascun pozzetto da cui l'acqua è stata rimossa. Ripetere la rimozione di E3 medio embrione e sostituzione con la soluzione test per tutte le colonne 12 della piastra.
- Opzionale: Per testare il cambiamento di tasso metabolico in risposta ad un composto, fare una soluzione che è 100 volte (100x) la concentrazione trattamento desiderato. Di nota, assicurarsi che la soluzione 100x non supera il 10% DMSO a limitare la concentrazione finale di DMSO a non più di 0,1%. Aggiungere 3 ml di soluzione 100x a ciascuno dei pozzetti di trattamento.
NOTA: eseguire calcoli di potenza per valutare il numero di pozzi di trattamento. Tuttavia, senza una stima della entità della risposta o variazione, una prova preliminare può essere eseguito in 8 compound trattata e 8 veicoli trattati pozzetti di controllo contenenti pesci.- Aggiungere 3 ml di controllo del veicolo al controllo (senza drug trattamento) pozzi che contengono pesci. Per assicurare che la risposta fluorescente composto è un risultato di azioni ai pesci, applicare trattamenti farmacologici e veicoli a 3 pozzetti di bianco in una piastra da 96 pozzetti.
- Leggi pesce piatto pieno su lettore fluorescente piatto con lunghezza d'onda di eccitazione a 530 nm e lunghezza d'onda di emissione a 590 nm.
- Posizionare la piastra in incubatore umidificato impostata a 28,5 ○ C (mantenere piastra al buio per tutta test per evitare photobleaching di soluzione test). Il saggio può essere eseguito per periodi di tempo che vanno da 1 ora a 24 ore. La durata del saggio dipende dallo scopo dello studio. Per testare la risposta ad una breve composto non stabile recitazione breve durata può essere più adatto. Tuttavia, per le prove di composti stabili o test di effetti genetici, massimizzando durata saggio è preferibile sfruttare i vantaggi connessi con il segnale cumulativo.
- In un punto tempo predeterminato (vedere la fase 3.6 per aiutare a determinare i tempi)leggere la fluorescenza di piatto di pesce pieno di nuovo con le stesse impostazioni di passo 3.5.
4. Valutare la variazione relativa a fluorescenza associata al trattamento con
- Calcolare variazione di fluorescenza di ciascun pozzetto sottraendo la fluorescenza al tempo 0 dal fluorescenza al termine dello studio. Wells senza pesce (spazi) devono avere valori prossimi a 0, ben al di sotto dei valori da pozzi che contengono pesci.
Cambia in Fluorescenza = Fluorescenza a conclusione - Fluorescenza al tempo 0 - Per accertare la variazione relativa di fluorescenza, calcolare la variazione media della fluorescenza per pozzetti di controllo poi dividono la variazione di fluorescenza di ciascun bene dal variazione media di fluorescenza dei pozzetti di controllo. Da segnalare, i controlli potrebbero essere sia comandi del veicolo o controlli genetici.
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Representative Results
Soluzione Assay non aumenta la fluorescenza in assenza di pesci embrionali (Figura 1). Tuttavia, l'analisi è molto sensibile a piccole variazioni del tasso metabolico nel pozzo. Un singolo pesce entro un ben crea un segnale significativamente diverso da pozzetti bianchi entro 1 ora (p <0,0001). La Figura 2 fornisce una rappresentazione visiva dei segnali generati dai pesci embrionale dopo 24 ore di incubazione. Ai fini di questa immagine sono stati utilizzati chiare pozzi lati. Eppure, i pozzi neri lati sono preferiti per le prestazioni del dosaggio per prevenire la lisciviazione del segnale fluorescente da fonti vicine.
Poiché la riduzione NADH 2 indotta alamarBlue è irreversibile, il segnale accumula con il tempo. Questo permette piccoli cambiamenti da amplificare. Per mostrare che le differenze accumulano e quindi aumentare col tempo, abbiamo monitorato la variazione relativa di fluorescenza indotta da 1 a 5 pesci a 1, 2, e 4 ore (Figura 3). Ad ogni numero di pesci / pozzetto la variazione relativa della fluorescenza aumentata significativamente nel tempo (p <0.001). Ancora più importante, perché il segnale accumula con il tempo, la grandezza delle differenze di cambiamento di fluorescenza che derivano da manipolare il numero di pesci / pozzetto è più solido a 4 ore a 1 ora di incubazione. Pertanto, aumentando la durata di esposizione è possibile migliorare la capacità di rilevare differenze associati con un dato trattamento.
Figura 1. Confronto tra rumore di segnale. Un cambiamento rilevabile della fluorescenza è generata da uno zebrafish in una piastra ben 96 in 1 ora. Wells che non contengono pesci (spazi) generano poco segnale. Barre di errore rappresentano SEM (n = 5-8). Cliccate qui per vedere una versione più grandequesta figura.
Figura 2. Rappresentazione visiva di test di germi a 24 ore. Immagine Rappresentante dei risultati ottenuti con questo test. Pozzi rosa sono indicativi di pesce con un alto tasso metabolico, pozzi viola un tasso metabolico moderata, e pozzi blu un basso tasso metabolico. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Differenze Figura 3. Amplificazione segnale con il tempo. La differenza nel segnale fluorescente generato variando il numero di pesci / pozzetto aumenta con il tempo. Perché il segnale si accumula con il tempo, l'entità della variazione di fluorescenza diverge con betweensamples tempo tcappello si differenziano per velocità di generazione del segnale. Barre di errore rappresentano SEM (n = 7).
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Discussion
La contaminazione con batteri o funghi limiterà notevolmente l'applicazione di questo test. Il blu di metilene in mezzo embrione E3 limita la possibilità di contaminazione fungina. Nel corso embrione rialzando è fondamentale che la cura è presa per eliminare l'embrione è morto due volte al giorno. Inoltre, è essenziale risciacquare abbondantemente gli embrioni con E3 sterile medio embrione del giorno di dosaggio iniziazione. Questi 2 passaggi limitano il potenziale di contaminazione batterica degli embrioni. L'inclusione dei pozzi vuoti descritte al punto 3.2 permette di individuare qualsiasi contaminazione batterica. La contaminazione batterica che produce un segnale misurabile è rara. Tuttavia, se i pozzetti del bianco fanno mostrano un segnale più forte, il test deve essere ripetuto con cura in modo da mantenere la pulizia embrione. Se l'utente si aspetta che la contaminazione è sorgendo prima della raccolta degli embrioni, gli embrioni possono essere sbiancate come descritto in precedenza (p. 22) 10. In alternativa, se lo sperimentatore sospetta checontaminazione sta avvenendo dopo la raccolta l'utente può utilizzare E2 con la penicillina e la streptomicina a posteriori gli embrioni di 4 dpf (pag. 23) 10.
Anche se questo test è utile per applicazioni in embrioni, non abbiamo testato per la validità di zebrafish adulto. Abbiamo il sospetto che la funzionalità di questo test sarebbe limitata a pesci adulti dalla scarsa penetrazione nei tessuti di AlamarBlue. Inoltre, nel pesce alimentazione flora intestinale può produrre un segnale profonda, non indicativa del metabolismo dei pesci. Pertanto, questo test è limitato ad utilizzare nel tuorlo d'alimentazione dei pesci embrionale. La relativa inattività del pesce embrionale fornisce un vantaggio unico, poiché ciò limita la variabilità che risulterebbe da indotto dispendio energetico 11. Così questo saggio è uno strumento unico per lo screening della risposta tasso metabolico alla manipolazione genetica o farmacologica in un sistema animale intero.
Il pesce zebra sta rapidamente diventando un modello di punta per il mperturbazioni etabolic che accompagnano l'obesità. In realtà, ci sono pubblicati modelli sia transgeniche e obesità indotta dalla dieta zebrafish 12,13. Simile a modelli murini, dieta obesità indotta nel zebrafish aumenta i trigliceridi sierici e lipidico epatico accumulo 12. Inoltre, zebrafish sovralimentati hanno elevato glucosio a digiuno, suggerendo glucosio intolleranza 14. Utilizzando il test descritto qui abbiamo dimostrato che 24 ore di pre-trattamento con Metformina, un sensibilizzatore dell'insulina, aumenta la risposta tasso metabolico a trattamento insulinico 5. Così, il pesce zebra può rivelarsi un modello ideale animale intero per scoprire farmaci che aumentano la sensibilità all'insulina (embrione) e di stabilire la loro efficacia nell'alleviare obesità correlati insulino-resistenza (adulto).
Lo sviluppo di modelli di zebrafish obesi genetici e dieta indotta che imitano i fenotipi osservati nei mammiferi obesi crea l'impulso per l'avvio di stu zebrafishmuore incentrata sulla malattia metabolica. Saggi high throughput sono essenziali per apprezzare pienamente il valore del modello zebrafish agli studi di omeostasi energetica. Strumenti innovativi progettati per valutare unità fagica consentiranno schermi incentrati sul consumo di energia, mentre i test di archiviazione elevato throughput di lipidi porterà a studi su tutto il corpo lipidi omeostasi 15-17. Il test che descriviamo qui fornisce uno strumento ad alto rendimento per valutare il ruolo dei geni, composti o loro interazioni su tutto il dispendio energetico del corpo.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AlamarBlue | Fisher Scientific | 10-230-103 | Manufactured by Thermo Scientific |
| Fine Tip DisposableTransfer Pipette | Fisher Scientific | 13-711-26 | Manufactured by Thermo Scientific |
| Fisherbrand Graduated Disposable Transfer Pipette | Fisher Scientific | 13-771-9AM | Manufactured by Thermo Scientific |
| Black sided clear bottom 96-well plates | Fisher Scientific | 50-320-785 | Manufactured by E&K Scientific Products Inc. |
References
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