Abstract
Sebrafisk er en viktig modellorganisme med naturgitte fordeler som har potensial til å gjøre sebrafisk en mye brukt modell for studiet av energi homeostase og fedme. Den lille størrelsen på sebrafisk åpner for analyser om embryoene som skal gjennomføres i en 96- eller 384-brønners plate format, Morfolino og CRISPR baserte teknologier fremme enkel genetisk manipulasjon, og medikamentell behandling av bad programmet er levedyktig. Videre sebrafisk er ideelle for termin genetiske skjermene der for romanen genet oppdagelse. Gitt den relative nyheten av sebrafisk som modell for fedme, er det nødvendig å utvikle verktøy som fullt ut utnytter disse fordelene. Heri beskriver vi en metode for å måle energiforbruket i tusenvis av embryonale sebrafisk samtidig. Vi har utviklet et helt dyr mikro plattform der vi bruker 96-brønners plater til å isolere enkelte fisk og vi vurdere kumulative NADH 2 produksjon ved hjelp av den kommersielt tilgjengelige cellekultur levedyktighet reagenten alamarBlue. I poikilotherms forholdet mellom NADH 2 produksjon og energiforbruk er tett knyttet sammen. Dette energiforbruk analysen gir mulighet til raskt å screene farmasøytiske eller genetiske manipulasjoner som direkte endrer energiforbruk eller endrer reaksjon på en tilført medikament (f.eks insulinsensibilisatorer).
Introduction
Musen er i dag den dominerende modellen for fedme forskning. Den korte generasjonsintervall og genetiske verktøy tilgjengelig i mus har vært enestående hittil. Imidlertid har sebrafisk også en kort generasjon intervall (3 - 4 måneder) og overgår selv musen i enkle genetisk manipulasjon 1,2. Sebrafisk opprettholder nesten 90% av pattedyr gener, mens langt overstiger musen i antall avkom og potensial for bruk i genetiske og narkotika-skjermer 3.
Å tappe potensialet i sebrafisk modell for studier i fedme, må analysene bli utviklet for å undersøke hvilke faktorer som påvirker kroppsvekt regulering, inkludert energiforbruk. Som metabolitter behandles gjennom β-oksidasjon og trikarboksylsyre sykle oksygen forbrukes, og NADH 2 er produsert. Således NADH 2 er en direkte indikator på fluksen av metabolitter gjennom metabolske veier metabolitt (oksidasjon). I poikilotherms, H + lekke gjennom den indre mitokondrie-membran, som frakobler NADH 2 oksidasjon fra ATP-syntese, er 4-5 ganger lavere enn i homeotherms 4. Følgelig, i sebrafisk NADH 2 er svært tett knyttet til ATP produksjonen gjennom oksidativ fosforylering. Heri beskriver vi en metode som måler NADH 2 produksjon i larvesebrafisk som en proxy for energiforbruk 5.
Oksygenforbruk er gullstandarden for måling av energiforbruk. Likevel, til beste dra nytte av høy gjennomstrømning potensialet i sebrafisk, må analyser av energiforbruk være mottagelig for høy gjennomstrømming. Oksygenforbruk systemer som avhenger av et lukket kammer sirkulerende system er begrenset i gjennomstrømningen med antall kamre tilgjengelige 6. Friluft O 2 forbruk / CO2-produksjon analyser har også blitt brukt i sebrafisk 5,7. Disse friluft 96-brønns plate basend systemer er mottagelig for høy gjennomstrømning. Dessverre, gassutveksling med omgivelsene begrenser følsomheten av disse analyser. Vi har nylig publisert anvendelsen av en analyse som overvåker NADH 2 bruker Redox indikatoren alamarBlue 5. Denne analysen overvinner begrensningene i gjennomstrømming og følsomhet felles for analyser av oksygenforbruk i sebrafisk.
Sebrafisk blir en stadig viktigere modell for studier av hele kroppen energi homeostase. Delvis fordi sebrafisk er mottagelig for å bruke i termin genetiske skjermer og narkotika-skjermer. Videre målrettet genetisk manipulasjon, inkludert knockdown og knock-in, kan raskt brukes. Vi har tidligere vist at denne analysen kan kombineres med bad medikament anvendelse og genetisk knockdown eller utstansing for å identifisere forbindelser og gener som endrer metabolismen 5. Dessuten er denne analysen er utformet for å utnytte de fordeler som ligger høy gjennomstrømning for sebrafisk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Merk: Denne protokollen følger retningslinjene fra University of Arizona kontoret Ansvarlig Conduct for forskning og har blitt godkjent av Institutional Animal Care og bruk komité
1. Sebrafisk Avl og Embryo Vedlikehold
- Forbered E3 embryo medium 8. Lage 60x stamløsning, oppløse 34,8 g NaCl, 1,6 g KCl, 5,8 g CaCI2 ● 2H 2 O, og 9,78 g MgCI2 ● 6 H 2 O i 1,95 L ddiH 2 O. Juster pH til 7,2 med NaOH og HCl justere volumet til to L bruker ddiH 2 O.
- For å forberede 1x E3 embryo medium, fortynne 16,5 ml 60x lager i en L ddiH20. Tilsett 100 ul 1% metylenblått.
- Oppdrett
- Huset Mann og Kvinne stamfisk (7 - 18 måneders alder) separat for å maksimere fruktbarhet.
- Slå av lyset 1 - 2 timer før på dagen før eggene er ønskelig. Sett opp parring (1 hann og 1 - 2 kvinner) i cRossing bur som tidligere beskrevet ni. Krysser bur tillater egg å unnslippe rovdyr som de passerer gjennom den perforerte bunnen av tanken innsatsen hvori voksen fisk blir holdt.
- Valgfritt:. For tidsbestemt avl, (som ville være nødvendig for studier med morfolino- injeksjon), skiller den mannlige og kvinnelige fisk av en klar plast skillelinjen, Fjern dette i morgen til å resultere i tidsbestemt legging av egg og befruktning. For morfolino studier, utføre styrkeberegning for å vurdere antall embryonale fisk kreves per behandling. Uten et estimat av størrelsen av effekten eller variant, kan en innledende prøveperiode kjøres med en n = 8.
- Hell eggene fra krysset buret inn i en petriskål (100 - 150 embryoer / 10 cm petriskål). La eggene å bosette til bunnen av fatet og hell av vannet. Fjern eventuelle gjenværende vann med en fin spiss disponibel overføringspipetten. Legg tilbake E3 embryo medium gjort i trinn 1.1.
- Gjør afhalt polert engangspipette for fremtiden egg og fisk overføring. Ved hjelp av saks, klippe en gradert engangsoverføring pipette på 0,25 ml konfirmasjonen. For å fjerne grove kanter, flamme polish kuttet velte en Bunsen-brenner.
- Oppretthold embryonale fisk til 4 dager etter befruktning (DPF) i 10 cm petriskåler i sebrafisk E3 embryo medium på 28,5 ○ C. To ganger hver dag, bruker en flamme polert gradert engangsoverføring pipette for å fjerne eventuelle ubefruktede egg eller døde embryoer (ugjennomsiktig hvit utseende). En gang hver dag, erstatte E3 embryo medium. Hell av E3 embryo medium, fjerne gjenværende væske med en fin spiss disponibel transfer pipette, og legge tilbake forvarmet (28,5 ○ C) E3 embryo medium.
2. Forbered analyse Solution
- Klargjør analyseoppløsning i henhold til tabell 1. Steril filter analyseoppløsning ved bruk av et 0,22 pM filter. Før analysen initiering, varme sterile analysen løsning i en 28,5 ○ Cvann bad.
| Ingrediens | % Av Total | Volum (mL / 10 ml) |
| 60x E3 Embryo Medium | 1,667 | 166,7 |
| Double ionisert (DDI) H 2 0 | 96,233 | 9623,3 |
| Alamar Blå | 1 | 100 |
| 400 mM NaOH | 1 | 100 |
| DMSO | 0.1 | 10 |
Tabell 1. Analyse Medium
3. Utfør analyse
- Skyll sebrafisk embryo 3 ganger med sterilt filtrert E3 embryo medium. Kombiner alle levedyktige sebrafisk embryo fra clutch i et beger. Sterilt filter 75 ml E3 embryo medium. Ved hjelp av en fin spiss disponibel overføringspipetten, rebevege seg så mye av E3 embryo medium fra sebrafisk embryoer som mulig. Legg tilbake 20 ml sterilt filtrert E3 embryo medium. Fjerne og erstatte E3 embryo medium 3 ganger.
- Plate en fisk i hver av 93 brønner på en 96-brønners sorte ensidig klar bunnplaten. Overfør den embryoniske fisken til platen ved individuelt å fange et embryo i en flamme polert gradert plastengangsoverføring pipette (trinn 1,5) og forsiktig med å mate ut i brønnen. Overfør E3 embryo medium tas fra beger inneholdende renset fisk inn i de 3 blanke brønner. Dette sikrer at tomme brønner har vært utsatt for det samme vannet som brønnene som inneholder fisk. Begge brønnene som inneholder fisk og tomme brønner bør være minst ½ full (200 ul) ved avslutningen av dette trinn.
- Bytt E3 embryo medium med analyse løsning i alle 96 brønner, inkludert tomme brønner. Dette trinn skal utføres en kolonne om gangen for hver av de 12 kolonnene i en 96-brønners plate. Ved hjelp av en fin spiss disponibel transfer pipette, fjerner E3 embryo medium fra hver brønn i en kolonne av platen (8 brønner). Vær nøye med å ikke ta på sebrafisk embryo. Tilsett 300 ul av analyseoppløsning til hver brønn fra hvilken vann ble fjernet. Gjenta fjerning av E3 embryo medium og erstatning med analyseoppløsning for alle 12 kolonner av platen.
- Valgfritt: For å teste den metabolske rate endringen i respons til en forbindelse, lage en løsning som er 100 ganger (100X) det ønskede behandlings konsentrasjon. Av notatet, sikre at løsningen 100x ikke overstiger 10% DMSO for å begrense den endelige DMSO konsentrasjon til ikke mer enn 0,1%. Tilsett 3 ul av oppløsningen 100x til hver av behandlingsbrønnene.
MERK: Utfør kraftberegninger for å vurdere antall behandlings brønner. Men uten et estimat av størrelsen av responsen eller variant, en innledende prøveperiode kan kjøres i 8 forbindelse behandles og 8 vehikkelbehandlede kontrollbrønner som inneholder fisk.- Tilsett 3 mL av kjøretøy kontroll til kontroll (ingen drug behandling) brønner som inneholder fisk. For å sikre at den fluorescerende reaksjon på forbindelsen er et resultat av handlinger i fisken, gjelder medikament og kjøretøy behandlinger til 3 tomme brønner i en 96-brønners plate.
- Les fisk fylt plate på fluorescerende plate leseren med eksitasjonsbølgelengden på 530 nM og emisjon bølgelengde på 590 nm.
- Sett platen inn i fuktet inkubator satt til 28,5 ○ C (opprettholde plate i mørket gjennom analysen for å unngå fotobleking av analyseløsning). Analysen kan kjøres for varigheten av tid som varierer fra 1 time til 24 timer. Varigheten av analysen er avhengig av målet med denne studien. For å teste responsen til en kortvirkende ikke-stabil forbindelse en kort varighet kan være mest passende. Likevel, for stabile sammensatte tester eller tester av genetiske effekter, maksimere analysen varighet er å foretrekke å utnytte de fordeler forbundet med den kumulative signal.
- På et forhåndsbestemt tidspunkt (se trinn 3.6 for å fastslå timing)lese fluorescens av fisk fylt plate igjen med de samme innstillingene som steg 3,5.
4. Vurdere den relative endringen i fluorescens i forbindelse med behandling
- Beregne endring i fluorescens av hver brønn ved å subtrahere fluorescens ved tid 0 fra fluorescensen ved avslutningen av undersøkelsen. Wells uten fisk (blanks) bør ha verdier nær 0, langt under verdiene fra brønner som inneholder fisk.
Endre i fluorescens = fluorescens på konklusjonen - Fluorescens ved tid 0 - For å fastslå den relative endringen i fluorescens, beregne den gjennomsnittlige endring i fluorescens for kontrollbrønner deretter dividere endringen i fluorescens av hver brønn av den gjennomsnittlige endring i fluorescensen til kontrollbrønnene. Av notatet, kan kontrollene være enten kjøretøykontroller eller genetiske kontroller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Assay løsning øker ikke fluorescens i fravær av embryonale fisk (figur 1). Imidlertid er analysen svært følsom for små endringer i metabolske hastighet i brønnen. En enkelt fisk i en brønn skaper et signal som er signifikant forskjellig fra tomme brønner løpet av 1 time (P <0,0001). Figur 2 gir en visuell fremstilling av signaler generert av embryonale fisk etter 24 timers inkubering. For formålet med dette bildet klart sidige brønner ble benyttet. Likevel blir sorte sidige brønner foretrukket for målemetoden for å hindre utvasking av det fluorescente signalet fra nærliggende brønner.
Fordi NADH 2-indusert reduksjon i alamarBlue er ikke-reversibel, akkumulerer signal med tiden. Dette gjør det mulig for små endringer som skal forsterkes. For å vise at forskjeller akkumuleres og således øke med tiden, overvåkes vi den relative endringen i fluorescens som induseres av 1 til 5, fisk på 1, 2 og 4 timer (Figur 3). På hvert antall fisk / brønn relativ endring i fluorescens betydelig øket med tiden (P <0,001). Enda viktigere, fordi signal akkumuleres med tiden, størrelsen av forskjellene i fluorescens endring som følge av manipulering av antall fisk / brønn er mer robust i 4 timer enn ved 1 time av inkubasjon. Således, ved å øke varigheten av eksponeringen vi kan forbedre evnen til å oppdage forskjeller i forbindelse med en gitt behandling.
Figur 1. Sammenligning av støy til signalet. En detekterbar endring i fluorescens blir generert av en sebrafisk i en 96-brønners plate i en time. Brønner som ikke inneholder fisk (blanks) genererer lite signal. Feilfelt representerer SEM (n = 5-8). Klikk her for å se en større versjon avdette tallet.
Figur 2. visuell representasjon av Assay Plate i 24 timer. Representativt bilde av resultatene oppnådd ved anvendelse av denne analysen. Rosa brønner er veiledende av fisk med høy metabolic rate, lilla brønner en moderat metabolic rate, og blå brønner lavt stoffskifte. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Signal Forskjeller Forsterk med tiden. Forskjellen i fluorescerende signal som genereres ved å variere antallet av fisk / brønn øker med tiden. Fordi signal akkumuleres med tiden, størrelsen av fluorescens endring divergerer med tids betweensamples tlue varierer i hastighet på signalgenerering. Feilstolpene representerer SEM (n = 7).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Forurensning med bakterier eller sopp vil i stor grad begrenser anvendelsen av denne analysen. Den metylenblått i E3 embryo medium begrenser muligheten for soppforurensning. Gjennom embryo oppdragelse er det viktig at omsorg er tatt for å fjerne døde embryoer to ganger hver dag. I tillegg er det viktig å skylle embryoene med sterilt E3 embryo medium på dagen for analysen innvielse. Disse 2 trinn begrense potensialet for bakteriell forurensning av embryoene. Inkluderingen av blanke brønner som er beskrevet i trinn 3.2 gir mulighet for påvisning av en hvilken som helst bakteriell forurensning. Bakteriell forurensning som gir et målbart signal er sjelden. Men hvis de blanke brønner gjør viser et robust signal, analysen bør gjentas med omtanke for å beholde fosteret renhet. Hvis brukeren venter at forurensning er oppstått før fosteret samling, kan embryoene bli bleket som beskrevet tidligere (s. 22) 10. Alternativt, hvis eksperimentator har mistanke om atforurensning er oppstått etter samling brukeren kan bruke E2 med penicillin og streptomycin til bak embryoene til fire DPF (s. 23) 10.
Selv om denne analysen er verdifullt for anvendelse i embryoer, har vi ikke testet for validitet i voksen sebrafisk. Vi mistenker at funksjonaliteten til denne analysen vil være begrenset i voksen fisk av dårlig vevspenetrasjon av AlamarBlue. Videre, i å mate fisk tarmen bakterieflora kan frembringe en dyp signal, ikke indikasjon på fiskens metabolisme. Dermed er denne analysen begrenset til bruk i plomme mating embryonale fisk. Den relative inaktivitet av embryonisk fisk gir en unik fordel, da dette begrenser variasjonen som ville være forbundet med aktivitet indusert energiforbruk 11. Derfor er denne analysen er et unikt verktøy for å skjerme den metabolic rate respons på genetisk eller farmakologisk manipulasjon i et helt dyr system.
The sebrafisk raskt bli ledende modell for metabolic forstyrrelsene som følger fedme. Faktisk er det publisert modeller av både transgene og diett-indusert sebrafisk fedme 12,13. I likhet med musemodeller, kosthold indusert fedme i sebrafisk øker serum triglyserider og lever lipidakkumulering 12. Videre har forspist sebrafisk forhøyet fastende glukose, noe som tyder på glukoseintoleranse 14. Ved hjelp av den analysen som er beskrevet her har vi vist at 24-timers av forbehandling med Metformin, en insulinsensibilisator, øker den metabolske rate respons på insulin behandling 5. Dermed kan sebrafisk vise seg å være en ideell hele dyremodell for å oppdage narkotika som øker insulinfølsomheten (embryo) og å etablere sin effektivitet i å lindre fedme relatert insulinresistens (voksen).
Utviklingen av genetiske og kosthold indusert overvektige sebrafisk modeller som etterligner fenotyper observert hos overvektige pattedyr skaper drivkraft for å initiere sebrafisk studør fokusert på metabolsk sykdom. Høy gjennomstrømning analyser er nødvendig for fullt ut å verdsette verdien av sebrafisk modellen til studier av energihomeostase. Innovative verktøy utviklet for å vurdere phagic stasjon vil gi rom for skjermer med fokus på energiinntaket, mens høy gjennomstrømming lipid lagrings analyser vil føre til studier på hele kroppen lipid homeostase 15-17. Analysen vi beskriver her gir en høy gjennomstrømning verktøy for å vurdere rollen til gener, forbindelser eller deres interaksjoner på hele kroppen energiforbruk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AlamarBlue | Fisher Scientific | 10-230-103 | Manufactured by Thermo Scientific |
| Fine Tip DisposableTransfer Pipette | Fisher Scientific | 13-711-26 | Manufactured by Thermo Scientific |
| Fisherbrand Graduated Disposable Transfer Pipette | Fisher Scientific | 13-771-9AM | Manufactured by Thermo Scientific |
| Black sided clear bottom 96-well plates | Fisher Scientific | 50-320-785 | Manufactured by E&K Scientific Products Inc. |
References
- Jao, L. E., Wente, S. R., Chen, W. Efficient multiplex biallelic zebrafish genome editing using a CRISPR nuclease system. PNAS. 110, 13904-13909 (2013).
- Kimura, Y., Hisano, Y., Kawahara, A., Higashijima, S. Efficient generation of knock-in transgenic zebrafish carrying reporter/driver genes by CRISPR/Cas9-mediated genome engineering. Sci. Rep. 4, 6545 (2014).
- Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nat. Rev. Genet. 8, 353-367 (2007).
- Brand, M. D., Couture, P., Else, P. L., Withers, K. W., Hulbert, A. J. Evolution of energy metabolism. Proton permeability of the inner membrane of liver mitochondria is greater in a mammal than in a reptile. Biochem. J. 275 (Pt 1), 81-86 (1991).
- Renquist, B. J., Zhang, C., Williams, S. Y., Cone, R. D. Development of an assay for high-throughput energy expenditure monitoring in the zebrafish. Zebrafish. 10, 343-352 (2013).
- Livingston, R. J. A volumetric respirometer for long-term studies of small aquatic animals. J.Mar. Biol. Assoc. U.K. 48, 485-497 (1968).
- Makky, K., Duvnjak, P., Pramanik, K., Ramchandran, R., Mayer, A. N. A whole-animal microplate assay for metabolic rate using zebrafish. J. Biomol. Screen. 13, 960-967 (2008).
- E3 medium (for zebrafish embryos) Cold Spring Harb. Protoc. , http://cshprotocols.cshlp.org/citmgr?gca=protocols%3B2011%2F10%2Fpdb.rec66449 (2011).
- Nasiadka, A., Clark, M. D.
- Brand, M., Granato, M., Nusslein-Volhard, C. Zebrafish, A practical approach. Nusslein-Volhard, C., Dahm, R. , Oxford University Press. (2002).
- Fry, F. E. J., Hart, J. S. Cruising speed of goldfish in relation to water temperature. J. Fish. Res. Board Can. 7, 169-175 (1948).
- Oka, T., et al. Diet-induced obesity in zebrafish shares common pathophysiological pathways with mammalian obesity. BMC physiol. 10 (21), (2010).
- Song, Y., Cone, R. D. Creation of a genetic model of obesity in a teleost. FASEB J. 21, 2042-2049 (2007).
- Maddison, L. A., Joest, K. E., Kammeyer, R. M., Chen, W. Skeletal muscle insulin resistance in zebrafish induces alterations in beta-cell number and glucose tolerance in an age and diet dependent manner. Am. J. physiol. Endocrinol. , (2015).
- Flynn, E. J. 3rd, Trent , C. M., Rawls, J. F. Ontogeny and nutritional control of adipogenesis in zebrafish (Danio rerio). J. lipid res. 50, 1641-1652 (2009).
- Shimada, Y., Hirano, M., Nishimura, Y., Tanaka, T. A high-throughput fluorescence-based assay system for appetite-regulating gene and drug screening. PloS one. 7, e52549 (2012).
- Tingaud-Sequeira, A., Ouadah, N., Babin, P. J. Zebrafish obesogenic test: a tool for screening molecules that target adiposity. J. lipid res. 52, 1765-1772 (2011).
