Abstract
Peixe-zebra são um modelo importante organismo com vantagens inerentes que têm o potencial para fazer zebrafish um modelo amplamente aplicado para o estudo da homeostase da energia e da obesidade. O pequeno tamanho do peixe-zebra permite ensaios sobre os embriões para ser conduzido num formato de placa de 96 ou 384 poços, morfolino e tecnologias baseadas CRISPR promover a facilidade de manipulação genética, e no tratamento de droga por aplicação de banho é viável. Além disso, peixe-zebra são ideais para telas genéticos para a frente, permitindo a descoberta do gene para a novela. Dada a relativa novidade do peixe-zebra como um modelo para a obesidade, é necessário desenvolver ferramentas que exploram plenamente esses benefícios. Aqui, nós descrevemos um método para medir o gasto de energia em milhares de peixes-zebra embrionária simultaneamente. Nós desenvolvemos uma plataforma de microplacas animal completo no qual usamos placas de 96 poços para isolar cada peixe e avaliar cumulativa de produção de NADH usando a 2 disponível comercialmente cultura celular viabilidade reagente alamarBlue. Em poiquilotérmicos a relação entre NADH 2 produção e gasto de energia está intimamente ligado. Este ensaio gasto energético cria o potencial para a tela rapidamente manipulações farmacológicas ou genéticas que alteram diretamente o gasto de energia ou alteram a resposta a um fármaco aplicada (por exemplo, sensibilizadores de insulina).
Introduction
O mouse é atualmente o modelo predominante para a investigação de obesidade. O curto intervalo de geração e ferramentas genéticas disponíveis no rato têm sido inigualável até à data. No entanto, o peixe-zebra também tem um intervalo de geração curto (3 - 4 meses) e supera até mesmo o mouse na facilidade de manipulação genética 1,2. O peixe-zebra mantém quase 90% de genes de mamíferos, enquanto ultrapassando o mouse no número de descendentes e potencial para uso em telas genéticos e medicamentos 3.
Para explorar o potencial do modelo peixe-zebra para estudos em obesidade, os ensaios devem ser desenvolvidos para investigar os fatores que influenciam a regulação do peso corporal, incluindo as despesas de energia. Como metabolitos são processados através β-oxidação e o ácido tricarboxílico ciclo oxigénio é consumido NADH e 2 é produzido. Assim, NADH 2 é um indicador directo do fluxo de metabolitos através de vias metabólicas (oxidação metabolito). Em poikilotherms, H + vazar através da membrana mitocondrial interna, que desacopla o NADH 2 de oxidação a partir da síntese de ATP, é de 4 - 5 vezes menor do que em homeotérmicos 4. Assim, em NADH 2 peixe-zebra é muito bem ligados à produção de ATP através da fosforilação oxidativa. Aqui, descrevemos um ensaio que mede a produção de NADH 2 em zebrafish larval como um proxy para o gasto energético 5.
O consumo de oxigênio é o padrão ouro para medir o gasto de energia. No entanto, para melhor aproveitar o potencial de alto rendimento do peixe-zebra, ensaios de gasto de energia devem ser passíveis de high-throughput. Sistemas de consumo de oxigênio que dependem de uma câmara fechada, sistema de circulação são limitados em taxa de transferência pelo número de câmaras disponíveis 6. Open air consumo de O 2 / CO 2 ensaios de produção também foram aplicadas no peixe-zebra 5,7. Estes ar livre de 96 poços placa de baseD Systems são passíveis de alto rendimento. Infelizmente, as trocas gasosas com o ambiente de limites de sensibilidade destes ensaios. Nós publicada recentemente a aplicação de um ensaio que monitora NADH 2, utilizando o indicador redox alamarBlue 5. Este ensaio supera as limitações na taxa de transferência e sensibilidade comum às análises de consumo de oxigênio no peixe-zebra.
O peixe-zebra está se tornando um modelo cada vez mais importante para estudos da homeostase energética do corpo inteiro. Em parte, por causa do peixe-zebra são passíveis de uso em telas genéticos para a frente e telas de drogas. Além disso, orientada manipulação genética, incluindo knockdown e knock-in, pode ser aplicada rapidamente. Nós mostramos anteriormente que este ensaio pode ser combinado com a aplicação de drogas e banho de knockdown ou nocaute genético para identificar compostos e genes que alteram a taxa metabólica 5. Além disso, este ensaio foi concebido para explorar as vantagens de elevada capacidade inerentes ao peixe-zebra.
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Protocol
Nota: Este protocolo segue as diretrizes da Universidade do Arizona Gabinete de Conduta Responsável em Pesquisa e foi aprovado pelo Comitê de Cuidado e Uso do animal Institucional
1. Criação de peixe-zebra e Embryo Manutenção
- Prepare meio embrião E3 8. Fazer 60x solução estoque, dissolver 34,8 g de NaCl, 1,6 g de KCl, 5,8 g de CaCl2 ● 2H 2 O, e 9,78 g de MgCl2 ● 6H 2 O em 1,95 L ddiH 2 O. Ajustar o pH para 7,2 usando NaOH e HCl Ajustar o volume para 2 L, utilizando ddiH 2 O.
- Para preparar o meio embrião E3 1x, diluir 16,5 ml 60x estoque em 1 L ddiH20. Adicionar 100 mL de 1% de azul de metileno.
- Reprodução
- Casa Masculino e Feminino reprodutores (7 - 18 meses de idade) separadamente para maximizar a fecundidade.
- Desligue as luzes 1 - 2 horas antes, no dia anterior ovos são desejados. Configure o acasalamento (1 macho e 1 - 2 fêmeas) em cgaiolas Rossing 9 como previamente descrito. Cruzando gaiolas para permitir que os ovos a predação escapar à medida que passam através da base perfurada da peça inserta na qual o tanque de peixes adultos são realizadas.
- Opcional:. Para reprodução programada, (como seria necessário para estudos envolvendo morfolino injeção), separe a peixes machos e fêmeas por um divisor de plástico transparente, Remover esta manhã para resultar na colocação cronometrado dos ovos e fertilização. Para morfolino estudos, realizar cálculos de energia para avaliar o número de peixes embrionário exigido por tratamento. Sem uma estimativa da magnitude do efeito, ou variação, um ensaio preliminar pode ser executado com uma N = 8.
- Despeje os ovos a partir do cruzamento de gaiola em uma placa de Petri (100 - 150 embriões / 10 centímetros placa de Petri). Permita que os ovos se depositam no fundo do prato e despeje a água. Retire toda a água restante usando uma ponta fina transferência descartável da pipeta. Adicionar costas meio E3 embrião feita na etapa 1.1.
- Faça afpipeta descartável polido lame para o ovo futuro e transferência de peixes. Com uma tesoura, corte uma pipeta de transferência descartável formado pela graduação de 0,25 ml. Para remover arestas, polonês chama a ponta corte sobre um bico de Bunsen.
- Manter peixes embrionárias para 4 dias após a fertilização (DPF) em 10 cm placas de Petri em meio E3 embrião de peixe-zebra a 28,5 ○ C. Duas vezes por dia, use uma chama polido formou pipeta de transferência descartável para remover quaisquer ovos não fertilizados ou embriões mortos (aparência branca opaca). Uma vez por dia, substitua meio embrião E3. Deitar fora meio embrião E3, remover o líquido restante usando uma ponta fina transferência descartável da pipeta, e adicionar novamente pré-aquecido (28,5 ○ C) meio embrião E3.
2. Preparar a Solução de Ensaio
- Preparar a solução de ensaio de acordo com a Tabela 1. Solução de ensaio de filtração estéril utilizando um filtro de 0,22 um. Antes do ensaio de iniciação, aquecer a solução de ensaio estéril numa 28,5 ○ Cbanho d'água.
| Ingrediente | % Do Total | Volume (mL / 10 mL) |
| 60x E3 Embryo Médio | 1.667 | 166,7 |
| Duplo deionizada (DDI) H 2 0 | 96,233 | 9623,3 |
| Alamar Blue | 1 | 100 |
| 400 mM de NaOH | 1 | 100 |
| DMSO | 0,1 | 10 |
Tabela 1. Ensaio Médio
3. Execute Assay
- Enxágüe embriões de peixe-zebra 3 vezes com meio embrião E3 filtrada estéril. Misture todos os embriões de peixe-zebra viáveis do embreagem para um copo. Filtro estéril 75 ml meio embrião E3. Usando uma ponta fina transferência descartável pipeta, remover-se tanto a forma de embrião E3 a partir dos embriões de peixe-zebra quanto possível. Adicionar 20 ml de volta médio embrião estéril filtrada E3. Remover e substituir meio embrião E3 3 vezes.
- Placa 1 peixe para cada um dos 93 poços de uma de 96 poços preto sided placa clara de fundo. Transferir o peixe embrionária para a placa de captura individualmente por um embrião dentro de uma chama de plástico graduado lustrado pipeta descartável (passo 1.5) e ejectar suavemente para dentro do poço. Transferir meio embrião E3 retirado da proveta contendo os peixes enxaguado em 3 poços em branco. Isto assegura que os poços em branco foram expostas a água da mesma exacta como os poços que contêm peixes. Ambos os poços que contêm peixes e poços de branco deve ser de, pelo menos, ½ completo (200 ul) à conclusão deste passo.
- Substituir meio embrião E3 com solução de ensaio em todos os 96 poços, incluindo poços em branco. Esta etapa deve ser realizada uma coluna de cada vez para cada uma das 12 colunas de uma placa de 96 poços. Usando uma ponta fina descartável transfer pipeta, remover o meio embrião E3 de cada poço numa coluna de a placa (8 poços). Tome cuidado para não tocar o embrião de peixe-zebra. Adicionar 300 ul de solução de ensaio a cada poço a partir do qual a água foi removida. Repetir a remoção do meio de embrião E3 e substituição com a solução de ensaio para todas as 12 colunas da placa.
- Opcional: Para testar a alteração da taxa metabólica em resposta a um composto, fazer uma solução que é 100 vezes (100X) a concentração de tratamento desejado. De nota, assegurar que a solução 100x não exceda 10% DMSO para limitar a concentração de DMSO final a não mais do que 0,1%. Adicionar 3 mL da solução de 100x a cada um dos poços de tratamento.
NOTA: Executar cálculos de potência para avaliar o número de poços de tratamento. No entanto, sem uma estimativa da grandeza da resposta ou variação, um ensaio preliminar pode ser executado em 8 tratado com composto e 8 tratados com veículo poços de controlo que contêm peixes.- Adicionar 3 mL de controlo do veículo para o controlo (sem Drutratamento g) poços que contêm peixes. Para assegurar que a resposta ao composto fluorescente é um resultado das acções dentro do peixe, aplicam-se tratamentos com drogas e 3 do veículo para poços em branco em placa de 96 poços.
- Leia peixes cheio placa fluorescente leitor de placas com comprimento de onda de excitação a 530 nm e comprimento de onda de emissão a 590 nm.
- Colocar a placa na incubadora umidificado definida para 28,5 ○ C (placa de manter na escuridão durante todo ensaio para evitar a fotodegradação de solução de ensaio). O ensaio pode ser executado por períodos de tempo que variam desde 1 h a 24 h. A duração do ensaio depende do objectivo do estudo. Para testar a resposta de um composto não-estável de curta duração de curta duração pode ser mais adequado. No entanto, para os testes composto estável ou testes de efeitos genéticos, maximizando a duração do ensaio é preferível explorar as vantagens associadas com o sinal cumulativo.
- Em um ponto de tempo pré-determinado (veja o passo 3.6 para ajudar a determinar sincronismo)leia fluorescência de placa cheio de peixe novamente com as mesmas configurações do passo 3.5.
4. Avaliar a mudança relativa na fluorescência associada ao tratamento
- Calcular alteração na fluorescência de cada cavidade subtraindo a fluorescência no tempo 0 da fluorescência após a conclusão do estudo. Wells sem peixe (espaços em branco) deverá ter valores próximos de 0, muito abaixo dos valores dos poços que contêm peixe.
Alteração na fluorescência = Fluorescência na conclusão - fluorescência no tempo 0 - Para determinar a alteração relativa da fluorescência, calcular a variação média da fluorescência para os poços de controlo, em seguida, dividir a alteração na fluorescência de cada poço pela variação média da fluorescência dos poços de controlo. De nota, controles poderia ser ou comandos do veículo ou controles genéticos.
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Representative Results
Solução de ensaio não aumenta de fluorescência na ausência de peixe embrionário (Figura 1). No entanto, o ensaio é altamente sensível a pequenas alterações na taxa metabólica dentro do poço. Um peixe dentro de um único poço cria um sinal significativamente diferente de poços em branco dentro de 1 h (P <0,0001). A Figura 2 proporciona uma representação visual de sinais gerados pelo peixe embrionário após 24 h de incubação. Para a finalidade da imagem foram usadas poços claras lados. No entanto, os poços lados pretos são preferidos para o desempenho do ensaio para evitar a lixiviação do sinal fluorescente de poços nas proximidades.
Uma vez que o NADH 2 redução induzida de alamarBlue é não-reversível, o sinal se acumula com o tempo. Isto permite para pequenas mudanças a ser amplificada. Para mostrar que as diferenças de acumular e, assim, aumentar com o tempo, que acompanhou a variação relativa da fluorescência induzida por 1 a 5 de peixe a 1, 2, e 4 horas (A Figura 3). Em cada série de peixe / poço a mudança relativa na fluorescência aumentou significativamente com o tempo (P <0,001). Mais importante, porque se acumula com o tempo do sinal, a magnitude das diferenças na alteração da fluorescência que resultam da manipulação do número de peixes / poço é mais robusta do que a 4 horas a 1 hora de incubação. Assim, aumentando a duração da exposição que pode melhorar a capacidade para detectar diferenças associadas com um dado tratamento.
Figura 1. Comparação do ruído de sinal. Uma alteração detectável na fluorescência é gerado por um peixe-zebra de uma placa de 96 poços em 1 h. Wells que não contenham peixe (espaços em branco) geram pouco sinal. As barras de erro representam SEM (n = 5-8). Por favor clique aqui para ver uma versão maioresta figura.
Figura 2. Uma representação visual de ensaio de placas às 24 h. Quadro representativo dos resultados obtidos utilizando este ensaio. Poços-de-rosa são indicativos de peixe com uma alta taxa metabólica, poços roxas uma taxa metabólica moderada e poços azuis uma baixa taxa metabólica. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Diferenças Figura 3. O sinal Amplificar com o tempo. A diferença no sinal fluorescente gerado pela variação do número de peixes / poço aumenta com o tempo. Em virtude do sinal se acumula com o tempo, a magnitude da mudança de fluorescência diverge com betweensamples tempo tchapéu diferem na taxa de geração de sinal. As barras de erro representam SEM (n = 7).
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Discussion
A contaminação com bactérias ou fungos limita grandemente a aplicação deste ensaio. O azul de metileno no meio embrião E3 limita a possibilidade de contaminação por fungos. Ao longo embrião criação é fundamental que o cuidado é tomado para remover embriões mortos duas vezes por dia. Além disso, é essencial para lavar cuidadosamente os embriões com meio embrião E3 estéril no dia do início do ensaio. Estes passos 2 limitar o potencial para a contaminação bacteriana dos embriões. A inclusão de poços em branco descritos no passo 3.2 permite a detecção de qualquer contaminação bacteriana. A contaminação bacteriana que produz um sinal mensurável é rara. No entanto, se os poços em branco mostram um sinal robusto, o ensaio deve ser repetido com o cuidado de manter a limpeza do embrião. Se o usuário espera que a contaminação está a surgir antes da colheita de embriões, os embriões podem ser branqueada como descrito anteriormente (p. 22) 10. Alternativamente, se o experimentador suspeita quecontaminação ocorre após a recolha, o utilizador pode usar E2 com penicilina e estreptomicina para criar os embriões de 4 dpf (p. 23) 10.
Embora este ensaio é valioso para aplicação em embriões, nós não testamos a validade no peixe-zebra adulto. Nós suspeitamos que a funcionalidade deste ensaio seria limitada em peixes adultos por penetração nos tecidos pobres de AlamarBlue. Além disso, na alimentação de peixes a microbiota intestinal pode produzir um sinal profundo, não é indicativo do metabolismo dos peixes. Assim, este ensaio é restrito para usar em gema de alimentação de peixes embrionários. A inactividade relativa de peixes embrionários proporciona uma vantagem única, o que limita a variabilidade que estaria associada com a actividade induzida gasto de energia 11. Assim, este ensaio é uma ferramenta única para a tela a resposta taxa metabólica para a manipulação genética ou farmacológico num sistema animal inteiro.
O peixe-zebra está rapidamente se tornando um modelo de liderança para o metabolic perturbações que acompanham a obesidade. Na verdade, existem modelos de ambos os peixes-zebra transgénicos obesidade induzida por dieta e 12,13 publicado. Semelhante aos modelos de mouse, dieta obesidade induzida no zebrafish aumenta triglicéridos séricos e lipídico acumulação hepática 12. Além disso, peixe-zebra superalimentados têm elevados de glicose em jejum, sugerindo intolerância à glicose 14. Usando o ensaio descrito aqui mostrámos que 24 horas de pré-tratamento com metformina, um sensibilizador de insulina, aumenta a taxa metabólica da resposta ao tratamento com insulina 5. Assim, o peixe-zebra pode revelar-se um modelo animal ideal para descobrir fármacos que aumentam a sensibilidade à insulina (embrião) e para determinar a sua eficácia em aliviar a obesidade relacionada com a resistência à insulina (adulto).
O desenvolvimento de modelos de peixe-zebra obesos genéticos e dieta induzida que imitam os fenótipos observados em mamíferos obesos cria o impulso para iniciar stu peixe-zebramorre focada na doença metabólica. Os ensaios de alto rendimento são essenciais para apreciar completamente o valor do modelo do peixe-zebra para estudos da homeostase energética. Ferramentas inovadoras destinadas a avaliar unidade phagic permitirá telas com foco em consumo de energia, enquanto os testes de armazenamento de alta taxa de transferência de lípidos levará a estudos sobre corpo inteiro lipídico homeostase 15-17. O ensaio aqui descrito fornece uma ferramenta de alto rendimento para avaliar o papel dos genes, compostos ou suas interações sobre o gasto energético de todo o corpo.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AlamarBlue | Fisher Scientific | 10-230-103 | Manufactured by Thermo Scientific |
| Fine Tip DisposableTransfer Pipette | Fisher Scientific | 13-711-26 | Manufactured by Thermo Scientific |
| Fisherbrand Graduated Disposable Transfer Pipette | Fisher Scientific | 13-771-9AM | Manufactured by Thermo Scientific |
| Black sided clear bottom 96-well plates | Fisher Scientific | 50-320-785 | Manufactured by E&K Scientific Products Inc. |
References
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