Abstract
Zebrafisk är en viktig modellorganism med inneboende fördelar som har potential att göra zebrafisk en allmänt tillämpad modell för studier av energi homeostas och fetma. Den lilla storleken på zebrafisk möjliggör analyser på embryon som skall genomföras under en 96- eller 384-brunnar format, Morfolino och crispr baserad teknik främjar enkel genetisk manipulation, och läkemedelsbehandling av bad ansökan är lönsamt. Dessutom, zebrafisk är idealiska för framåt genetiska skärmar möjliggör ny gen upptäckt. Med tanke på den relativt ny zebrafisk som en modell för fetma, är det nödvändigt att utveckla verktyg som till fullo utnyttja dessa fördelar. Häri beskriver vi en metod för att mäta energiförbrukning i tusental embryonal zebrafisk samtidigt. Vi har utvecklat ett helt djur mikro plattform där vi använder 96-brunnsplattor för att isolera enskilda fiskar och vi bedömer kumulativ NADH 2 produktion med hjälp av kommersiellt tillgängliga cellodlings livskraft remedlet alamarBlue. I poikilotherms förhållandet mellan NADH 2 produktion och energiförbrukning är tätt sammanlänkade. Denna energiförbrukning analys skapar potential att snabbt screena farmakologiska eller genetiska manipulationer som direkt förändrar energiförbrukningen eller ändra svaret på en pålagd läkemedel (t.ex. insulinkänsligheten).
Introduction
Musen är för närvarande den dominerande modellen för fetma forskning. Den korta generationen intervall och genetiska verktyg som finns i mus har varit oöverträffad hittills. Emellertid har zebrafisk också en kort generationstid intervall (3 - 4 månader) och överträffar till och med musen i enkel genetisk manipulation 1,2. Den zebrafisk upprätthåller nästan 90% av däggdjursgener, medan långt över musen i antalet avkommor och potential för användning i genetisk och drogskärmar 3.
För att utnyttja den potential som zebrafisk modell för studier i fetma, måste analyser utvecklas för att undersöka faktorer som påverkar kroppsvikten reglering, inklusive energiförbrukning. Som metaboliter behandlas via β-oxidation och den trikarboxylsyra cykeln syre förbrukas och NADH 2 produceras. Således, NADH 2 är en direkt indikator på flödet av metaboliter genom metaboliska vägar (metabolit oxidation). I poikilotherms, H + läcka genom det inre mitokondriemembranet, som syftar till att skilja NADH 2 oxidation från ATP-syntes, är 4-5 gånger lägre än i homeotherms 4. Följaktligen i zebrafisk NADH 2 mycket tätt kopplat till ATP produktion genom oxidativ fosforylering. Häri beskriver vi en analys som mäter NADH 2 produktion i larver zebrafisk som en proxy för energiförbrukning 5.
Syreförbrukningen är guldmyntfoten för att mäta energiförbrukningen. Ändå, för att bäst dra nytta av den höga genomströmningen potential zebrafisk, måste analyserna enligt energiförbrukningen vara mottaglig för hög genomströmning. Syrekonsumtionssystem som är beroende av en sluten kammare cirkulationssystem är begränsade i genomströmning av antalet kamrar tillgängliga 6. Open air O2 förbrukning / CO 2 produktionsanalyser har använts även i zebrafisk 5,7. Dessa utomhus 96-brunnar basd system är mottagliga för hög genommatning. Tyvärr, gasutbyte med omgivningen begränsar känsligheten hos dessa analyser. Vi publicerade nyligen tillämpning av en analys som övervakar NADH 2 använder redoxindikator alamarBlue 5. Denna analys övervinner begränsningarna i genomströmning och känslighet som är gemensam för analyser av syreförbrukning i zebrafisk.
Den zebrafisk blir en allt viktigare modell för studier av hela kroppen energi homeostas. Delvis på grund av zebrafisk är mottagliga för användning i framåt genetiska skärmar och drogskärmar. Dessutom riktade genetisk manipulation, inklusive knockdown och knock-in, kan appliceras snabbt. Vi har tidigare visat att denna analys kan kombineras med bad drogansökan och genetiska knockdown eller knockout att identifiera föreningar och gener som förändrar ämnesomsättning 5. Dessutom är denna analys utformad för att utnyttja de höga kapacitetsmässiga fördelar som är förbundna med zebrafisk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Obs: Detta protokoll följer riktlinjerna vid universitetet i Arizona kontoret för ansvarsfullt genomförande av forskning och har godkänts av Institutional Animal Care och användning kommittén
1. Zebrafish Avel och Embryo Underhåll
- Förbered E3 embryo medium 8. Man gör 60x stamlösning, lös 34,8 g NaCl, 1,6 g KCl, 5,8 g CaCl2 ● 2H 2 O, och 9,78 g MgCl2 ● 6H 2 O i 1,95 L ddiH 2 O. Justera pH till 7,2 med användning av NaOH och HCI justera volymen till 2 L med hjälp av ddiH 2 O.
- För att förbereda 1x E3 embryo medium, späd 16,5 ml 60x lager i en L ddiH20. Lägg 100 | il 1% metylenblått.
- Avel
- Hus manliga och kvinnliga avels (7 - 18 månaders ålder) separat för att maximera fruktsamhet.
- Släcker belysningen 1-2 h före dagen innan äggen önskas. Ställ in parning (1 hane och 1 - 2 kvinnor) i CRossing burar som tidigare beskrivits 9. Crossing burar möjliggöra äggen att undkomma predation när de passerar genom den perforerade basen av tanken insättningen i vilken de vuxna fiskarna hålls.
- Tillval:. För tidsinställd avel, (som skulle behövas för studier med morfolino injektion), separera manliga och kvinnliga fisk genom en klar plast avdelare, Ta bort det här på morgonen för att resultera i tids utläggning av ägg och befruktning. För morpholino studier, utföra effektberäkningar för att bedöma antalet embryonala fiskar krävs per behandling. Utan en uppskattning av storleken på effekten eller variation, kan en preliminär prövning köras med en n = 8.
- Häll ägg från korsningen buren i en petriskål (100 - 150 embryon / 10 cm petriskål). Låt äggen att sedimentera till botten av skålen och häll bort vattnet. Ta bort eventuellt kvarvarande vatten med en fin spets engångs överföringspipett. Lägg tillbaka E3 embryo medium i steg 1.1.
- Gör aflame polerat engångspipett för framtida ägg och fisk överföring. Med sax, klippa en graderad engångs överföringspipett på 0,25 ml gradering. För att ta bort ojämna kanter, låga polska snittet välta en bunsenbrännare.
- Bibehåll embryonal fisk till 4 dagar efter befruktning (dpf) i 10 cm petriskålar i zebrafisk E3 embryo medium vid 28,5 ○ C. Två gånger varje dag, använd en flamma polerad graderad engångs överföringspipetten för att avlägsna eventuella obefruktade ägg eller döda embryon (ogenomskinlig vit utseende). När varje dag, byt E3 embryo medium. Häll av E3 embryo medium, ta bort kvarvarande vätska med en fin spets disponibel överföringspipett, och lägg tillbaka förvärmda (28,5 ○ C) E3 embryo medium.
2. Förbered analyslösningen
- Bered analyslösningen enligt tabell 1. Sterilfiltrera analyslösning med användning av ett 0,22 pm filter. Före analys initiering, värma den sterila analyslösningen i en 28,5 ○ Cvatten bad.
| Ingrediens | % Av total | Volym (^ il / 10 ml) |
| 60x E3 embryo medium | 1,667 | 166,7 |
| Dubbel avjoniserat (ddl) H 2 0 | 96,233 | 9623,3 |
| Alamar Blue | 1 | 100 |
| 400 mM NaOH | 1 | 100 |
| DMSO | 0,1 | 10 |
Tabell 1. analysmedium
3. Utför Analys
- Skölj zebrafisk embryon 3 gånger med sterilt filtrerad E3 embryo medium. Kombinera alla livskraftiga zebrafisk embryon från kopplings i en bägare. Sterilfiltrera 75 ml E3 embryo medium. Med hjälp av en fin spets disponibel överföringspipett, reflytta så mycket av E3 embryo medium från zebrafisk embryon som möjligt. Lägg tillbaka 20 ml sterilfiltrerad E3 embryo medium. Ta bort och ersätt E3 embryo medium 3 gånger.
- Plansch en fisk i var och en av 93 brunnar i en 96-brunnars svart ensidig klar bottenplåten. Överför embryonala fisk till plattan genom att individuellt fånga ett embryo i en flamma polerad graderad plast disponibel överföringspipett (steg 1,5) och försiktigt mata ut i brunnen. Överför E3 embryo medium tas från bägare innehållande sköljas fisk i 3 tomma brunnarna. Detta säkerställer att bakgrundsbrunnar har utsatts för exakt samma vatten som brunnarna som innehåller fisken. Båda brunnarna som innehåller fisk och tomma brunnar bör vara minst ½ full (200 l) i slutet av detta steg.
- Byt E3 embryo medium med analyslösning i alla 96 brunnar, inklusive blankbrunnar. Detta steg bör utföras en kolumn i taget för varje av de 12 kolumnerna i en 96-brunnsplatta. Med hjälp av en fin spets engångs transfer pipett avlägsna E3 embryo medium från varje brunn i en kolumn av plattan (8 brunnar). Var noga med att inte röra zebrafisk embryot. Tillsätt 300 | il analyslösning till varje brunn, från vilken vatten avlägsnades. Upprepa avlägsnandet av E3 embryo medium och ersättning med analyslösning för alla 12 kolumnerna av plattan.
- Valfritt: För att testa den metaboliska förändringen hastigheten som svar på en förening, göra en lösning som är 100 gånger (100X) av den önskade behandlingskoncentrationen. Notera att det 100x lösningen inte överstiger 10% DMSO för att begränsa den slutliga DMSO-koncentrationen till högst 0,1%. Lägg 3 pl av 100x lösningen till var och en av behandlings brunnarna.
OBS: Utför kraft beräkningar för att bedöma antalet behandlings brunnar. Men utan en uppskattning av storleken på svaret eller variation, en preliminär prövning kan köras i 8 förening behandlade och 8 vehikelbehandlade kontrollbrunnar som innehåller fisk.- Tillsätt 3 il av fordon för att styra (ingen drug behandling) brunnar som innehåller fisk. För att säkerställa att den fluorescerande svar på förening är ett resultat av åtgärder inom fisk, applicera drogen och fordonsbehandlingar till 3 tomma brunnar i en 96-brunnsplatta.
- Läs fisk fylld tallrik på fluorescerande plattläsare med excitation våglängd vid 530 nm och emissionsvåglängd på 590 nm.
- Placera plattan i fuktas inkubator inställd på 28,5 ○ C (hålla plattan i mörker hela analysen för att undvika fotoblekning av analyslösningen). Analysen kan köras för löptider på tid som sträcker sig från 1 h till 24 h. Varaktigheten av analys beror på syftet med studien. För testning av svar på ett kortverkande icke-stabil förening en kort varaktighet kan vara mest lämpliga. Men maximera analystiden är att föredra att utnyttja fördelarna förknippade med den kumulativa signalen för stabil förening tester eller tester av genetiska effekter,.
- Vid en förutbestämd tidpunkt (se steg 3.6 för att fastställa tidpunkten)Läs fluorescens av fiskrika plattan igen med samma inställningar som steg 3,5.
4. Utvärdera den relativa förändringen i fluorescens i samband med behandling
- Beräkna förändringen i fluorescens för varje brunn genom att subtrahera fluorescensen vid tiden 0 från fluorescensen vid avslutningen av studien. Brunnar utan fisk (ämnen) bör ha värden nära 0, långt under värden från brunnar som innehåller fisk.
Förändring i fluorescens = fluorescens vid slutsats - fluorescens vid tiden 0 - För att fastställa den relativa förändringen i fluorescens, beräkna den genomsnittliga förändringen i fluorescens för kontrollbrunnar dela sedan förändringen i fluorescens av varje brunn av den genomsnittliga förändringen i fluorescens av kontrollbrunnarna. Notera kunde kontrollerna vara antingen fordonets reglage eller genetiska kontroller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Analyslösningen ökar inte fluorescens i frånvaro av embryonala fisk (fig 1). Emellertid är analysen mycket känslig för små förändringar i ämnesomsättning inom brunnen. En enda fisk inuti en brunn skapar en signal signifikant olika från blankbrunnar inom en timme (P <0,0001). Figur 2 ger en visuell representation av signaler som alstras av embryonal fisk efter 24 h av inkubation. Vid tillämpningen av den här bilden tydliga sidiga brunnar användes. Ändå är svart sidiga brunnar dras för analysens prestanda för att förhindra läckage av den fluorescerande signalen från närliggande brunnar.
Eftersom NADH 2 inducerad minskning av alamarBlue är icke-reversibel, ackumulerar signalen med tiden. Detta medger för små förändringar som skall amplifieras. För att visa att skillnader ackumuleras och sålunda öka med tiden, övervakade vi den relativa förändringen i fluorescens inducerad av en till fem fiskar i ett, två, och 4 h (Figur 3). Vid varje antal fiskar / brunn den relativa förändringen i fluorescens ökade signifikant med tiden (p <0,001). Ännu viktigare är att eftersom signalen ackumuleras med tiden, storleken på skillnader i fluorescensförändring som resulterar från att manipulera antalet fiskar / brunn är mer robust vid 4 h än vid en timme av inkubation. Således, genom att öka exponeringstiden vi kan förbättra förmågan att upptäcka skillnader i samband med en viss behandling.
Figur 1. Jämförelse av brus till signal. En detekterbar förändring i fluorescens alstras av en zebrafisk i en 96 brunnars platta vid en timme. Brunnar som inte innehåller fisk (ämnen) genererar lite signal. Felstaplar representerar SEM (n = 5-8). Klicka här för att se en större version avdenna siffra.
Figur 2. visuell representation av analysplatta vid 24 h. Representativ bild av resultat som erhållits med användning av denna analys. Rosa brunnar är ett tecken på fisk med en hög ämnesomsättning, lila brunnar en måttlig ämnesomsättning och blå brunnar låg ämnesomsättning. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Signal Skillnader Förstärk med tiden. Skillnaden i fluorescenssignal som genereras genom variering av antalet fiskar / brunn ökar med tiden. Eftersom signalen ackumuleras med tiden, omfattningen av fluorescens förändring avviker med tids betweensamples thatt skiljer sig i graden av signalgenerering. Felstaplar representerar SEM (n = 7).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Förorening med bakterier eller svampar kommer att kraftigt begränsa tillämpningen av denna analys. Metylenblått i E3 embryo medium begränsar risken för svampkontaminering. Under hela embryot uppfödning är det viktigt att man ser till att ta bort döda embryon två gånger varje dag. Dessutom är det viktigt att noggrant skölja embryona med sterilt E3 embryo medium på analysdagen inledande. Dessa 2 steg begränsa risken för bakteriell kontamination av embryona. Införandet av tomma brunnar som beskrivs i steg 3,2 medger upptäckt av bakteriell kontaminering. Bakteriell kontaminering som ger en mätbar signal är sällsynt. Men om tomma brunnarna gör visar en robust signal, analysen bör upprepas med omsorg för att upprätthålla embryo renlighet. Om användaren förväntar sig att föroreningen uppkommit före embryosamlingen, kan embryona blekas såsom tidigare beskrivits (s. 22) 10. Alternativt, om försöksledaren misstänker attförorening sker efter insamling kan användaren använda E2 med penicillin och streptomycin bakåt embryon till 4 DPF (s. 23) 10.
Även om denna analys är värdefull för användning i embryon, har vi inte testat för validitet hos vuxna zebrafisk. Vi misstänker att funktionaliteten i denna analys skulle vara begränsad i vuxen fisk genom dålig vävnads penetration av alamarBlue. Dessutom, i att livnära fisk tarmfloran kan ge en djup signal, inte ett tecken på fisk metabolism. Således är denna analys begränsad till användning i äggula utfodring embryonala fisk. Den relativa inaktivitet embryonal fisk ger en unik fördel, eftersom det begränsar variationen som skulle vara förknippade med aktivitet inducerad energiförbrukning 11. Denna analys är alltså ett unikt verktyg för att screena ämnesomsättning svar på genetisk eller farmakologisk manipulation i ett helt djur system.
Den zebrafisk har snabbt blivit en ledande modell för metabolic störningar som åtföljer fetma. I själva verket är det publicerade modeller av både transgena och dietinducerad zebrafisk fetma 12,13. I likhet med musmodeller ökar dieten framkallad övervikt i zebrafisk serum triglycerider och lever lipidackumulering 12. Dessutom har overfed zebrafisk förhöjd fasteglukos, vilket tyder på glukosintolerans 14. Med användning av analysen beskriven här har vi visat att 24 h av förbehandling med metformin, ett insulinsensibiliserande medel, ökar den metaboliska hastigheten svar på insulinbehandling 5. Således kan zebrafisk visa sig vara en idealisk hela djurmodell för att upptäcka läkemedel som ökar insulinkänslighet (embryo) och att fastställa deras effektivitet när det gäller att lindra fetma relaterade insulinresistens (vuxen).
Utvecklingen av genetiska och diet inducerad fetma zebrafisk modeller som efterliknar fenotyper observerats i feta däggdjur skapar incitament för att initiera zebrafisk studör fokuserat på metabola sjukdomar. Hög genomströmning analyser är viktiga för fullt uppskatta värdet av den zebrafisk modell för att studier av energi homeostas. Innovativa verktyg för att utvärdera fagisk enhet kommer att möjliggöra för skärmar med fokus på energiintag, medan hög genomströmning lipid lagringsanalyser kommer att leda till studier på hela kroppen lipidhomeostas 15-17. Analysen beskriver vi här ger en hög genomströmning verktyg för att bedöma betydelsen av gener, föreningar eller deras interaktioner på hela kroppen energiförbrukning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AlamarBlue | Fisher Scientific | 10-230-103 | Manufactured by Thermo Scientific |
| Fine Tip DisposableTransfer Pipette | Fisher Scientific | 13-711-26 | Manufactured by Thermo Scientific |
| Fisherbrand Graduated Disposable Transfer Pipette | Fisher Scientific | 13-771-9AM | Manufactured by Thermo Scientific |
| Black sided clear bottom 96-well plates | Fisher Scientific | 50-320-785 | Manufactured by E&K Scientific Products Inc. |
References
- Jao, L. E., Wente, S. R., Chen, W. Efficient multiplex biallelic zebrafish genome editing using a CRISPR nuclease system. PNAS. 110, 13904-13909 (2013).
- Kimura, Y., Hisano, Y., Kawahara, A., Higashijima, S. Efficient generation of knock-in transgenic zebrafish carrying reporter/driver genes by CRISPR/Cas9-mediated genome engineering. Sci. Rep. 4, 6545 (2014).
- Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nat. Rev. Genet. 8, 353-367 (2007).
- Brand, M. D., Couture, P., Else, P. L., Withers, K. W., Hulbert, A. J. Evolution of energy metabolism. Proton permeability of the inner membrane of liver mitochondria is greater in a mammal than in a reptile. Biochem. J. 275 (Pt 1), 81-86 (1991).
- Renquist, B. J., Zhang, C., Williams, S. Y., Cone, R. D. Development of an assay for high-throughput energy expenditure monitoring in the zebrafish. Zebrafish. 10, 343-352 (2013).
- Livingston, R. J. A volumetric respirometer for long-term studies of small aquatic animals. J.Mar. Biol. Assoc. U.K. 48, 485-497 (1968).
- Makky, K., Duvnjak, P., Pramanik, K., Ramchandran, R., Mayer, A. N. A whole-animal microplate assay for metabolic rate using zebrafish. J. Biomol. Screen. 13, 960-967 (2008).
- E3 medium (for zebrafish embryos) Cold Spring Harb. Protoc. , http://cshprotocols.cshlp.org/citmgr?gca=protocols%3B2011%2F10%2Fpdb.rec66449 (2011).
- Nasiadka, A., Clark, M. D.
- Brand, M., Granato, M., Nusslein-Volhard, C. Zebrafish, A practical approach. Nusslein-Volhard, C., Dahm, R. , Oxford University Press. (2002).
- Fry, F. E. J., Hart, J. S. Cruising speed of goldfish in relation to water temperature. J. Fish. Res. Board Can. 7, 169-175 (1948).
- Oka, T., et al. Diet-induced obesity in zebrafish shares common pathophysiological pathways with mammalian obesity. BMC physiol. 10 (21), (2010).
- Song, Y., Cone, R. D. Creation of a genetic model of obesity in a teleost. FASEB J. 21, 2042-2049 (2007).
- Maddison, L. A., Joest, K. E., Kammeyer, R. M., Chen, W. Skeletal muscle insulin resistance in zebrafish induces alterations in beta-cell number and glucose tolerance in an age and diet dependent manner. Am. J. physiol. Endocrinol. , (2015).
- Flynn, E. J. 3rd, Trent , C. M., Rawls, J. F. Ontogeny and nutritional control of adipogenesis in zebrafish (Danio rerio). J. lipid res. 50, 1641-1652 (2009).
- Shimada, Y., Hirano, M., Nishimura, Y., Tanaka, T. A high-throughput fluorescence-based assay system for appetite-regulating gene and drug screening. PloS one. 7, e52549 (2012).
- Tingaud-Sequeira, A., Ouadah, N., Babin, P. J. Zebrafish obesogenic test: a tool for screening molecules that target adiposity. J. lipid res. 52, 1765-1772 (2011).
