Zebra balığı, enerji homeostazı çalışmaları için önemli bir model organizmadır. NADH2'ye duyarlı bir redoks indikatörü olan alamar Blue'yu kullanarak, zebra balığı larvalarının metabolik hızını 96 oyuklu plaka formatında ölçen ve ilaç veya gen keşfine uygulanabilen bir test geliştirdik.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Bu makalede
Özet
Özet
Zebra balığı Zebra balığı, enerji homeostazı ve obezite çalışma için yaygın olarak uygulanan bir model yapmak potansiyeline sahip doğal avantajları ile önemli bir model organizma vardır. Embriyolardaki deneyler, 96 veya 384 oyuklu plaka formatmda gerçekleştirilir edilmesi için zebrabalıkları küçük boyutu sağlar Morfolino ve CRISPR tabanlı teknolojiler banyo uygulaması tarafından genetik manipülasyon kolaylığı ve ilaç tedavisi iyileştiren yaşayabilir olduğunu. Ayrıca, Zebra balığı roman gen keşfi için izin ileri genetik ekranlar için idealdir. Obezite için bir model olarak zebrafish göreceli yenilik göz önüne alındığında, tam bu faydaları istismar araçları geliştirmek için gereklidir. Burada, aynı zamanda embriyonik zebrafish binlerce enerji harcanmasını ölçmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Biz, bireysel balık izole etmek için, 96 gözlü levhalar kullanan bir bütün hayvan mikroplaka platformu geliştirdik ve ticari olarak temin edilebilen hücre kültürü canlılığı yeniden hesaplanan toplam NADH 2 üretimini değerlendirmekAjan AlamarBIue. Poikilotherms NADH 2 üretim ve enerji tüketimi arasındaki ilişki sıkıca bağlanır. Bu enerji harcaması tahlil hızla doğrudan enerji tüketimini değiştirmek veya uygulamalı ilaç (örn insülin duyarlılığını) yanıtı değiştirebilir farmakolojik veya genetik manipülasyonlar taramak için potansiyel oluşturur.
Giriş
Fare şu anda obezite araştırmaları için baskın modeldir. Kısa nesil aralığı ve fare kullanılabilir genetik araçları bugüne kadar eşsiz olmuştur. Ancak, Zebra balığı da kısa bir nesil aralığı vardır (3-4 ay) ve genetik manipülasyon 1,2 kolaylığı hatta fare geçti. Kadar genetik ve ilaç ekranlar 3 kullanım için yavruları ve potansiyeli sayıda fare üzerinde gerçekleşmiştir zebra balığı memeli genlerinin yaklaşık% 90 tutar.
Obezitede çalışmalar için zebrabalıkları modelinin potansiyelini, tahliller enerji harcaması da dahil olmak üzere vücut ağırlığı regülasyonu, etkileyen faktörleri araştırmak amacıyla geliştirilmesi ger....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Not: Bu protokol Araştırma Sorumlu Davranış Arizona Ofisi Üniversitesi kuralları takip ve Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından onaylanmıştır
1. Zebra balığı Islahı ve Embriyo Bakım
- E3 embriyo orta 8 hazırlayın. 60x stok solüsyon To Make, 1.95 L ddiH 2 O. içinde 34.8 g NaCl, 1.6 gr KCI, 5.8 g CaCl2 ● 2H 2 O ve 9.78 g MgCl2 ● 6H 2 O çözülür DdiH 2 O. kullanarak 2 L ses seviyesini ayarlama NaOH ve HCI kullanılarak 7.2 pH ayarlayın
- 1 L ddiH20 16,5 ml 60x stok sulandırmak, 1x E3 embriyo orta hazırlamak. 100 ul%....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Deney çözeltisi embriyonik balık (Şekil 1) yokluğunda floresansında bir artış meydana gelmez. Ancak, tahlil kuyunun içinde metabolizma hızı küçük değişikliklere karşı çok duyarlıdır. Bir kuyunun içinde bir tek balık 1 saat (p <0.0001) içinde boş kuyulardan önemli ölçüde farklı bir sinyal oluşturur. 2 kuluçkadan 24 saat sonra embriyonik balıklar tarafından üretilen sinyallerin görsel temsilini sağlar Şekil. Bu resmin amacı için açık yüzlü kuyular kullanıldı. Bununla b.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Bakteri veya mantar ile kontaminasyon büyük ölçüde bu testin uygulanmasını sınırlayacaktır. E3 embriyo orta metilen mavisi fungal bulaşma olasılığını sınırlandırır. Embriyo boyunca bu bakım iki kez her gün ölü embriyolar kaldırmak için alınması çok önemlidir yetiştirme. Buna ek olarak, iyice deney başlatma gün steril E3 embriyo ortamı ile embriyolar durulanması gereklidir. Bu 2 adım embriyoların bakteriyel kontaminasyon potansiyelini sınırlar. Aşama 3.2 'de tarif edilen Boş oyukların dahil herhangi bir bakteriyel ko.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların açıklayacak rakip mali çıkarları yoktur.
Teşekkürler
Yazarlar, Dr. Roger Cone ve Chao Zhang'a daha önce yayınlanmış olan bu testin uygulanmasını doğrulamaya yaptıkları katkılardan dolayı teşekkür eder. Bu çalışma NIH 1F32DK082167-01 (BJR) tarafından desteklenmiştir.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| AlamarBlue | Fisher Scientific | 10-230-103 | Thermo Scientific tarafından üretilmiştir |
| İnce Uçlu Tek Kullanımlık Transfer Pipeti | Fisher Scientific | 13-711-26 | Thermo Scientific |
| Fisherbrand tarafından üretilmiştir Dereceli Tek Kullanımlık Transfer Pipeti | Fisher Scientific | 13-771-9AM | Thermo Scientific tarafından üretilmiştir |
| Siyah taraflı şeffaf tabanlı 96 kuyulu plakalar | Fisher Scientific | 50-320-785 | E & tarafından üretilmiştir K Bilimsel Ürünler A.Ş. |
Kaynaklar
- Jao, L. E., Wente, S. R., Chen, W. Efficient multiplex biallelic zebrafish genome editing using a CRISPR nuclease system. PNAS. 110, 13904-13909 (2013).
- Kimura, Y., Hisano, Y., Kawahara, A., Higashijima, S. Effici....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
