Introduction
瞬目のコンディショニングは、パブロフの条件付けと連想学習と記憶の神経機構を調査するためのモデルシステムの一形態です。それは、ヒト、ウサギ、ネコ、ラット、およびマウスを含む様々な種において研究されています。パラダイムは、2つの対になった刺激の提示を含む：ニュートラル条件刺激（CS; 例えば 、音、光のフラッシュ、またはウィスカ刺激）、および顕著な無条件刺激（米国; 例えば 、目への空気パフを、または眼窩周囲ショック）。米国は無条件、反射的瞬目反応（ すなわち 、UR）を誘発します。最終的には、対になったCS-USのいくつかのプレゼンテーションの後、被験者は、米国でCSを関連付けることを学びます。この学習は条件反応（CR）、米国のプレゼンテーションの前にCS単独によって誘発された瞬目の形で現れます。
トレース形式で瞬目のコンディショニングは、数時間の刺激のない間隔を含み、CSと米国（ 図1）を分離undredミリ秒。それは刺激の偶発1の認識を必要とするので、トレースコンディショニングは、宣言的な学習の一形態です。時間的なギャップは、関連1-6になるために米国とCS用のために、このような海馬のような前脳領域ではCSの神経「トレース」を維持するために動物を必要とします。前脳領域に加えて、痕跡条件はまた、小脳7に依存しています。
瞬目のコンディショニングは、したがって、買収、統合、および検索を含むメモリの複数のファセットの調査のための有用なパラダイムです。瞬目条件付けの間、動物の対照群は、米国のプレゼンテーションだけではなく、学習したCS-US協会によって引き起こされる可能性がCSにpseudoconditioningまたは感作された応答をテストするランダムな順序で不対刺激が提示されます。
一般的に使用されるapparaTUSげっ歯類における瞬目のコンディショニングの調査のために齧歯類が訓練プロセス8-10の間、約自由に移動することが許可されているチャンバです。この種の装置では、テザーは、通常、げっ歯類の頭蓋骨に固定されているヘッドピースに取り付けられています。テザーは、米国（そして時にはCS）の送達のために、それらの刺激に対する動物の反応（ すなわち、瞬目反応）10を送信することができます。テザー自体は配信刺激のタイプに基づいて修正されてもよいし、瞬目の応答を記録する方法。
瞬目のコンディショニングのために「自由に動く」係留マウスを使用する理由は、マウスが拘束闘いということです。他の種の拘束により適してもよいが、瞬目条件付け実験において、マウスを使用することの主な利点は、利用可能な遺伝的に改変された変異株の大部分はマウス系統であることです。苦労に加えて、完全な解像度マウスのtraintは、急性苦痛になります。応力を最小限にヘッド固定マウスの調製は、瞬目のコンディショニング中に得られる生体情報を増加させます。例えば、このシステムは、2光子顕微鏡11と皮質ニューロンの画像化を可能にします。
頭部固定製剤は、また、マウス11における瞬目のコンディショニングのためのプラットフォームとして、四極アレイ、二光子カルシウムイメージングで齧歯類の脳の生体内電気生理学的記録に 、取り外し可能な頭蓋インプラントを介して皮質の光学的画像化のために、前の実験で使用されています-16。
頭部固定システムでは、信頼性の刺激と記録は、マウス（ 図2）を完全に拘束することなく確保されています。自在移動系で使用されるようなヘッドピースは、マウスの頭蓋骨に固定されています。トレーニング中に、ヘッドピースは、上バーに取り付けられているコネクタに取り付けられていますげっ歯類の頭（ 図2A）を安定化するために、円筒状のトレッドミル。円筒状のトレッドミルは、マウスを快適に休息することができますが、マウスがそう望む場合、また、それを実行するか、歩くことができます。このシステムを使用することで、マウスはCSや米国のような穏やかな眼窩周囲の電気ショックなどのウィスカー振動（ 図1）を用いて訓練することができます。米国は、外科的に目には横方向の皮膚の下に配置配線を介して配信されます。 CSは、2層の矩形曲げアクチュエータ（ 図2B）に接続されている櫛を介して配信されます。櫛曲げアクチュエータは次いで、トレーニング中に適切な位置に移動させ、それぞれの個々の動物のための最適な送達のために調整されている磁気ベースに取り付けられています。櫛は、選択したウィスカーを跨ぐように配置されています。 CSの配信中に、信号が櫛を置換し、ウィスカ17の振動につながる曲げアクチュエータに送信されます。
16,18,19のマウスで効果的な条件刺激として使用されています。ウィスカの刺激は、この実験パラダイムでCSのために選択される理由は、探査中の体性感覚情報入力のための彼らの鼻毛上のマウスの動物の依存性です。ウィスカ刺激は、信頼性と効果的なCS 20であることが示されています。 CSは瞬目コンディショニング20,21の学習に関連した皮質の変化と可塑性をマッピングするためのエレガントなツールを提供するようさらに、鼻毛システム（ すなわち 、バレル皮質）の十分に確立し、組織化皮質基板、ウィスカ刺激を与えられました。頭部固定システムは、刺激ニューロンおよび非刺激ウィスカーからの入力を受けるニューロン間の応答を比較するために選択したウィスカーの正確な刺激を可能にします。最後に、マウスの多くの株は、年齢関連難聴などの比較的若年成人を示します
ここで提示CSと米国の送達のための方法、および瞬目レスポンスの取得など、瞬目のコンディショニングのために他のヘッド固定製剤、時のユニークで重要な変更があります。この装置と瞬目コンディショニングの訓練パラダイムの信頼性は、エアコン、マウスとpseudoconditioned対照動物（ 図7A）から比較的平坦な学習曲線から曲線を学習することによって実証されています。
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Protocol
マウスを含むすべての手順は、国立衛生研究所によって発行されたガイドラインに基づいて、ノースウェスタン大学の施設内動物管理使用委員会によって承認されたプロトコルに従って行われました。
1.シリンダー（図2A）
- Chettih らとHeiney らによって記載されているようにシリンダーを構築します。長い泡シリンダー14-15から。 12.7ミリメートル金属棒、シリンダの10cmの長さをカットし、車軸に合わせて中央に穴をあけ（0.5インチ）の直径で。 Heiney らによって記載されているように、金属の光学ブレッドボード上にその軸を有する円筒をマウントします。または、別の支持体（ 例えば、プレキシグラス）15。
- シリンダの両側に、直径12.7ミリの2つの垂直な金属棒を立てます。
- 金属棒の上に2の直角マウントを取り付けます。
- 直角マウントで（長さ5cm、直径12.7ミリメートル）2以上のロッドを固定します。ベベル番目eは、これらのロッドの端部とシリンダ（ 図2G）の中央の上に、その端部を平ら。
- （ 図2G）場所でコネクタの翼を保持する2 4-40機械ねじに合うようにロッドの平ら両端に穴をドリルとタップします。
2.組み立てウィスカ刺激システム（図2B）
- 定期的な毛の櫛からコームの10歯のセグメントをカットします。
- スリットをカット2〜3mm程度、幅約5mm 2層長方形の曲げアクチュエータを受け入れるようにコームの上部に深いです。
- 曲げアクチュエータの各表面に1線をハンダ付けします。メーカーが提供するはんだとフラックスを使用してください。電流からのマウスとユーザーを保護するために電気テープとアクチュエータとはんだをカバーしています。
- 曲げアクチュエータストリップは、コームの平面に対して垂直に座っているように、櫛にカットスリットにアクチュエータストリップをスリップ。角それは4で傾斜するように櫛5°、より自然には、マウスの顔の曲線に従います。
- 急エポキシとコームの上部にアクチュエータストリップの端部を固定します。
注：曲げアクチュエータストリップに半田付けワイヤはアクチュエータに40ボルトを提供するレオスタットに接続する必要があります。以前の実験は、40ボルトのコンディショニングのために有効であるが、任意の驚愕応答を誘発しないことを示しています。 - 可動マウント上の曲げアクチュエータとコームを置きます。通常のin vitro電気生理学リグのために使用される磁気ベースに装着されたピペットホルダーはうまく動作します。
3.シリンダー（図2C、2E）上記ロッドにマウントコネクタの組立
注：コネクターは、3-DはワイスとDisterhoftとガルベスらによりテザーに使用アンフェノール221シリーズのナイロンストリップからモデル化された7穴ストリップを印刷している10,17。
- 0-80 X-1のためにストリップの最初の穴をタップします「小ねじ。これは、コネクタにヘッドピースを固定する固定ネジとして機能します。手でネジを回し容易にするために、シアノアクリル接着剤で固定ネジの頭に0-80ナットを貼付。
- （0-80マシンナットのスペースを確保するために、）タップ穴の後に空の穴を残し、残りの5つの穴を通って5金メッキrelia-TACソケットを押してください。
- ソケットの両端に5長い配線（イーサネットケーブルから得られた線材）とはんだオフコーティングをはがし。
注：最初の2本のワイヤは、アンプからの信号のフィルタリングと増幅後の瞬目の応答を検出する筋電（EMG）信号を記録するために使用されます。第2は、刺激アイソレータからの衝撃信号を提供します。最後の線はグランド接続として機能します。これらのワイヤは、時限CS-USの送達のために使用されるシステムに接続されます。 - MULTと線とソケットとの間の電気的接続性を確保imeter。継続設定にマルチメータを入れて、ピンと電線の被覆の末端に他のプローブにプローブの1つを保持します。抵抗が低く、マルチメータは、音を出すときにピンと配線が電気的に接続されています。
- マルチメータは、連続設定がない場合は別の方法として、ピンと線間の抵抗を測定します。測定はほとんど抵抗がある場合、電気的導通があります。
- 2 TO-220スタイルのトランジスタからコネクタの翼を準備します。トランジスタのエミッタ、ベース、コレクタリードを遮断し、それがコネクタに固定することができるように、表面を平ら。
- タブは、ねじの頭の下に滑ることができるように穴を突破するために取り付けタブの端をカットします。
- コネクタにトランジスタをエポキシ。取り付けタブの穴は、シリンダ、上記ロッドにコネクタを固定するために使用されます。
- PRワイヤーのベースにエポキシ樹脂を適用しますソケットからotrudingとエポキシを乾燥させます。エポキシは、接続を絶縁し、保護します。
4.ヘッドピースを準備する（図2D、2E）
注：ヘッドピースストリップ3-Dは、ワイスとDisterhoftとガルベスらによりヘッドピースに使用アンフェノール221シリーズのナイロンストリップからモデル化された7穴ストリップを印刷されている10,17。この作品は、もはや商業的に製造されていません。プリンタファイルは、この雑誌のウェブサイトからダウンロードすることができます。
- 0-80×1 "小ねじ用のストリップの最初の穴をタップして、最初の穴の後に空の穴を残します。
- （狭い端部を介して）残りの5つの穴の底部を通って5金メッキピンを押してください。均等にストリップにピンを押し込む容易にするために、万力を使用してください。
- 熱ストリッパーを使用して、ワットのむき出し部分をはんだ付けし、ステンレス鋼線（直径0.005）の末尾からポリイミドコーティングの約0.5cmを削除ピンの1つの開口部への怒りとは0.6〜0.7センチメートルにワイヤーをカット。
- 現在は動物に渡すことができるように、ワイヤの端から約0.2センチはがし。
- 繰り返して、残りの3本のワイヤのための4.3から4.4を繰り返します。
注：第2は、動物にショックを与えるのに役立つだろうしながら最初の2本のワイヤは、EMGの応答を記録します。 - 最後（五）ワイヤはアース線として機能するように、（0.005インチ径）コーティングされていないステンレス鋼線の約5センチカットし、残りのピンにハンダ。
- ワイヤとマルチメータとピン間の連続性を確保。 （コーティングされていないアース線の場合には、マルチメータのプローブは、ワイヤに沿って任意の場所に配置することができます。）
5.外科的準備（図2F）
- ヘッドピースを含め、すべての手術器具を滅菌します。アルコールに浸漬した後、滅菌生理食塩水ですすぐことによりヘッドピースを滅菌します。
- 三から四パーセントvで誘導室でマウスを麻酔毎分酸素の1-2 Lの流量と混合イソフルランaporized。
- 動物はつま先のピンチと完全に麻酔をかけていることを確かめます。それはつま先のピンチに反射的に応答しないときにマウスが完全に麻酔をかけています。
- 動物が完全に麻酔された後、動物の頭の上を剃る、鎮痛剤（0.05から2ミリグラム/ kg、皮下）としてブプレノルフィン塩酸塩の投与量を注入定位フレームのベースに覆われた加熱パッドの上に置きます、動物が完全に麻酔されていることを確認し、フレームに頭部を固定します。毎分酸素の1-2 Lの流量で2％への切り替え、動物に気化イソフルランの流れを維持します。角膜に眼軟膏の少量を適用します。
- 両者の間に交互に、ポビドンヨードとアルコール3時間ごとに頭皮を消毒します。
- 番号10または15手術用メスの刃で、トンの正面から頭蓋骨を露出させ、頭皮の正中線に沿って切開を作ります頭頂間骨（〜1.5〜2センチメートル）過去に、彼の目を。
- マイクロクリップで皮膚のフラップを控えます。目の上1つのクリップ、吻側-尾側軸の中央に沿って、そして両側性頭蓋骨の背面に1つずつ（ すなわち、すべての6つのクリップを使用）を配置します。かぶと裂離を防止するために、側面と背面を含め、可能な限り頭蓋骨の多くを公開します。これは、接着剤合着セメントの適用のための表面積を増加させます。
- メスを用いて、骨膜を除去し、清潔で乾燥した作業面を確保するために頭蓋骨の上部に沿ってこすり。 3％過酸化水素3回頭蓋骨の上部を清掃してください。
- 00から90本のネジを受け入れるようにサイズ34逆円錐バリまたは1.6ミリメートル彫刻カッタードリルビットで（で0.0625を。長い）頭蓋骨に二つの穴を開けます。ネジは、電気的接地接続を提供します。時RIGHコンディショニング1ブレグマの前方の穴、およびラムダの前で他を置き、正中線の左トンの目。各穴にネジを1本置きます。各フルターンのための頭蓋骨にネジ0.28ミリメートルを下げ、 2つの完全なターンで十分です。
- セメント表面積および握力を高めるために頭蓋骨に直径が0.75程度ミリの複数の小さなくぼみを作ります。
- 完成したヘッドピースを取ると2本のネジの周りに八の字構成でアース線を巻きます。ヘッドピースは、後に適切に配置することができるように、アース線にいくらかのたるみ（ヘッドピースとネジの間~1.5センチ）を許可します。
注：図8は、通常のワイヤとグランドスクリュー間の良好な電気的接続を確実にします。ワイヤはまた、電気的接続を確実にするために、スクリューに半田付けすることができます。 - 接着剤合着セメントを適用します。接着剤合着セメントを混合するための製造元の指示に従ってくださいまたはL-パウダーミックスの4スクープ、ベースの8滴、冷セラミック混合皿中の触媒の2滴を混ぜて（温度ストリップOを確保nは混合料理は完全に黒です。）冷たい温度はセメントの作業時間を延長します。
- コート頭蓋骨とネジ自由に合着セメントと、セメントを乾燥させます。これは、わずか数分かかります。
- セメントが乾燥した後、ピンは頭蓋骨の上に、立って、垂直方向にヘッドピースを置きます。コネクタに似ホルダーを所定の位置にヘッドピースを保持します
注：「3.コネクタのアセンブル」を参照してください-Theホルダーはヘッドピースのピンを受けるために、金メッキソケット付き5ホールのストリップである必要があります。ホルダは、定位フレームのアームに取り付けられています。ホルダーとアームの使用は、ヘッドピースとワイヤの配置を容易にします。 - ヘッドピースが配置された後、眼窩周囲の周りの皮膚をバック剥離し、エンドを剥奪0.2センチメートルがEYに直接尾を皮膚の下に休み、約2〜4 mmまで可能にするために2ショックワイヤを配置電子。 2本のワイヤの端部が互いに接触しないようにしてください。眼窩の上に筋眼輪筋上の2つのEMGワイヤを配置します。
- 必要であれば、彼らが長すぎると思われる場合、彼らは直接軌道を傷つけ、感染をもたらす可能性があるかのように、ワイヤの端を切り落としました。ワイヤーの両端を切断した場合、露出した十分な裸線があることを確認してください。また、ワイヤが長すぎるように見える場合は、バック彼らはヘッドピースの外に拡張するベース、でワイヤーを曲げます。
- 接着剤合着セメントの小さな広がりと頭蓋骨上の場所でのワイヤのベース（ヘッドピースに近いすなわち 、end）をセメントと、（先に説明した部分の半分を使用）乾燥させます。
- マイクロクリップを外し、そっと背中セメント上の皮膚のフラップを折ります。皮膚が瞬目反応のまぶた、予防の歪みを回避するために、皮膚の任意の部分に張力を防止するために、 自然に沈ませ、そして動物に苦痛。
- セメントとヘッドピースの上部の縁に切開皮膚からのすべてをカバーする、歯科用セメントで露出面積をシール。目やヘッドピースのピン上にセメントを滴下避けるために細心の注意を払ってください。部分的に硬化したセメントは、平滑化し、歯科用セメントの溶剤を浸した綿棒で操作することができます。セメントは、ヘッドピースホルダーを取り外す前に完全に乾燥することができます。
- 動物がケージに戻って動物を交換する前に、温め表面に麻酔から回復することを可能にします。メタカム（1ミリグラム/キログラム、SQ）を管理し、再びそのケージに動物を配置します。
- 回復の動物5-7日は、テストやトレーニングの前に許可します。あなたの機関のガイドラインに従って動物に標準的な術後ケアを維持します。それは手術から回復した後の動物は、1日あたり少なくとも1回チェックする必要があります。貧しい食および/または飲酒と物憂げな行動の兆候を監視します。痛みの場合緩和まで疑われ、メタカム24時間ごと（術後の終了時と同じ用量）を提供します。リドカインは、局所的に動物が傷または不快の徴候を示している場合、創傷に適用することができます。
6.シリンダーとトレーニング（図2G）にマウスを置きます
- シリンダーの上にマウスを配置するには、片手で尾によって、それを保持し、その後、他と人差し指と親指で肩の後ろにマウスをつかんで簡単に手でマウスを拘束。マウスの腹部と胴体の周りに残りの指を包みます。
- 手がマウスを拘束されないと、マウスの頭部にヘッドピースにコネクタを取り付け、ネジを回します。
- シリンダーに静かにマウスを置き、フレームにコネクタを装着しながら、所定の位置に保持します。シリンダー上記バーにコネクタを固定する2本のネジを使用してください。
- コネクタは、シリンダフレームに固定された後、RELEマウスのホールドアーゼ。シリンダーにマウスを馴化の二つのセッションの1日を与えます。各馴化セッションを各コンディショニングセッションと同じ時間を許可します。
- レコードの自発的なまばたきの馴化中レートとプレ公開驚愕応答の発生を最小限にするために、ウィスカー振動CSにマウスを。しかし、電気ショック米国せず、実際のコンディショニングセッション中としてCSを適用します。
- ウィスカ刺激CSは、個々のウィスカー以上の櫛の歯を滑りながら、マウスの馴化側（右側）にピエゾ方式の近く（約0.5cm）を配置することによって適用されます。同じウィスカが日ごとに同じ位置にピエゾシステムを配置することによって、日々刺激されることを確認してください。
- 古典的条件の上でマウスを訓練し始めます。 5日間、1日あたりのトレーニングの二つのセッションを提供します。各トレーニングセッションの間に約2時間を残します。
- エアコングループ、デリへ（ - WPIのA385R刺激アイソレータから配信3ミリアンペア、0.3ミリアンペア）100ミリ秒の長い電気パルス米国と対に250ミリ秒の長いウィスカの振動CS（60ヘルツ）のセッションごとに30トライアル版。海馬（ 図1）23上のタスクに依存するために250ミリ秒長く刺激のないトレース間隔でCSと、私たちを引き離します。
- まばたきが誘発されるように、それぞれの動物のための電気ショックの強さを調整します。 30-60秒のランダムな試行間間隔で区切り試験（45秒、セッションごとに30分の合計時間の平均値。）
- エアコングループについて述べたのと同じ刺激パラメータを使用して、pseudoconditionedグループに一人で30不対CSを提供し、米国（60試行の合計）は、単独での試験それぞれ。 CS単独および米国単独試験は全く刺激が複数回行で提示されていないようpseudorandomizedされていることを確認してください。 22.5秒の平均試行間間隔で各試験を区切ります。
- デウィスカの刺激によって発生する振動の任意のノイズをマスクするために、慣れや訓練を通じて65デシベルで肝臓バックグラウンドノイズ。
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Representative Results
8-10週齢の雄のC57Bl6 / Jマウスは、ヘッド固定された円筒状のトレッドミル装置上のトレース瞬目コンディショニングに訓練しました。 8匹のマウスがペアCS-USのプレゼンテーション（エアコングループ）と9マウスと訓練したが、不対CSおよび米国プレゼンテーション（pseudoconditioned基）で訓練しました。
馴化マウス由来の馴化応答の例EMG記録は、 図3及び4に示されています。各試験のための筋電図記録を整流し、10ミリ秒の時定数と統合された。 図5を整流し、統合されたEMG応答トレースは（A）の馴化とpseudoconditioned（B）マウスの両方のための10のセッションごとに、すべての試験にわたって平均を示しています。馴化応答の進化は、応答が近い米国の発症に大きくなって、 図5（a）に見られます。この進化は、私を見ていませんnは、図5（b）の応答をpseudoconditioned。
よくタイミングの発生、ひいては、十分に学習された馴化応答はまた、図6に見ることができる。 図6は、CSの発症後の応答のピークまでの時間のヒストグラムを示します。 CSの発症後150ミリ秒 - 0の間のグラフ内の最初のピークがあります。この初期ピークは早ければ、よりトレーニングセッションでは、セッション1のように見ることができ、より良いタイミングエアコン応答の発生を示す、エアコンの動物の間でミリ秒400〜500の間のグラフ内の第二のピークの開発があります。
図7Aは 、馴化とpseudoconditionedマウスから記録された平均パーセントの適応条件付け応答を示しています。適応馴化応答は、少なくとも20ミリ秒BEF存在する有意な活性を有すると考えられます鉱石米国の発症（ すなわち 、CSの発症前の平均活性よりも少なくとも4 SD大きな存在250ミリ秒）。トレーニングセッションにわたり、エアコンマウスは、馴化マウスはpseudoconditionedマウス（グループ、F（1,15）= 20.62、pよりはるかに多くの適応エアコンの応答を示したように、各トレーニングセッションでより多くの馴化適応応答を示すことによりコンディショニングパラダイムの段階的な学習を示しました<0.0005;セッション、F（1,9）= 9.987、P <0.0001;グループ*セッション、F（1,9）= 5.977、P <0.0001）。 pseudoconditionedグループは、通常、試験の20％未満に擬似CRを示したことに注意してください。
図7Bは、10のトレーニングセッションの両方で、エアコン、pseudoconditionedマウスを平均条件反応エリア（整流および統合されたEMG応答の曲線下面積）を示しています。ラス以上の反復測定ANOVAと計画の比較トン4つのセッション（ すなわち、セッション7-10、エアコングループは60％のCRの学習基準に達した後に）CR領域はpseudoconditionedグループポスト学習におけるよりもエアコンのグループで大きかったことを示す、グループの有意な主効果を示します基準（グループ、F（1,14）= 5.733、P <0.05;セッション、F（1,3）= 0.486、nsの 、グループ*セッション、F（1,3）= 0.432、ns）で 。
図7Cは、エアコンとpseudoconditionedマウスから記録された平均パーセントアルファ（驚愕）応答を示します。アルファ応答は、平均ベースラインアクティビティの上に少なくとも4SDたCSの発症の50ミリ秒以内に活動しています。トレーニングセッションにわたり、エアコン、pseudoconditionedマウスは、通常、馴化とpseudoconditionedマウスの間に有意差（グループ、F（1,15）= 2.502、nsの ）で、試験の25％未満にアルファ応答を示しました。目電子反復測定ANOVAは、しかし、原因pseudoconditionedレスポンスの低下や空調マウスでは約25％で、アルファ応答のメンテナンス（グループ*セッション、F（1,9）= 2.074にグループやセッションの有意な相互作用を明らかにしませんでしたP <0.05）。セッション10時のアルファ応答の増加は、よく発達したCRの短い発症の遅延の可能性が高いです。
図7Dは、マウスの両方のグループから記録された平均パーセント待ち時間の短い応答を示しています。待ち時間の短い応答が平均ベースラインアクティビティの上4SDたCSの発症後50〜70ミリ秒の間に活動を反映しています。 ANOVAは、馴化動物は10のトレーニングセッション（グループ、F（1,15）= 5.377、P <0.05にわたってpseudoconditioned動物よりも短い待ち時間の応答を示したことを明らかにした反復測定;セッション、F（1,9）= 3.920、P <0.0005;グループ*セッション、F（1,9）= 3.158、P <0.005）。 Tエアコングループは各トレーニングセッションに大きいCRを呈したとして彼は、CRの早い開始時間を反映することができます。
図1：トレース瞬目コンディショニングパラダイムトレース瞬目コンディショニングでは、無害な条件刺激（CS）は穏やかに有害無条件刺激（米国）と対になっているが瞬目の応答を誘導するためのもの。 CSと米国は、パラダイム海馬依存の23を作り、刺激のない時間的ギャップによって分離されています。ここで説明したパラダイムでは、250ミリ秒の長いウィスカ振動CSは長い眼窩周囲米国に衝撃を100ミリ秒とペアになっています。 CSと米国が250ミリ秒の長い時間的なギャップによって分離されている。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2：頭部固定調製物 A、シリンダー、ウィスカの刺激、およびコネクタ示さB、示された二層の曲げアクチュエータとコームでウィスカの刺激と瞬目を調整するためのヘッド固定セットアップ。。 C、個々の部品とコネクタが示されている：スクリューロック、7ホールのストリップ、ワイヤを保持するためのソケットおよびエポキシに半田付け、ワイヤ、TO-220スタイルのトランジスタDから変換翼、個人とヘッドピース。部品が示された：7ホールストリップ、ピン、およびコーティングされていないステンレス製のアース線を含む端子へハンダ付けワイヤ、および個々の衝撃とEMGのステンレス鋼線を、端から剥離ポリイミドコーティングの0.2センチメートルでE。コネクタとの両方のための7穴ストリップ内の各ホールのために、コンフィギュレーションヘッドピース。F、外科的に移植ヘッドピースとマウス。G、マウスが訓練する準備ができて、シリンダー上に置かれている。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図3：例EMG記録青い線は（250ミリ秒長い）CSプレゼンテーションを描きます。赤い線は、電気ショック（100ミリ秒）から来ているアーティファクトを示している米国のプレゼンテーションを、描きます。 CSと米国は250ミリ秒の刺激のない間隔で分離されています。この刺激フリー区間内にCRを描く（ベースラインと比較して）より高い振幅EMG活動である。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</ A>
図4：例EMGおよび対応する光学赤外線反射録音 EMG記録は、光学赤外線応答のピーク（赤線）に馴化応答の発症（青線）、待ち時間を検出する反射型センサ、および無条件瞬目反応発症（と同じくらい正確ですピンクの線）。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図5：平均化瞬目のトレースは、整流され、1エアコンマウス（A）と1 pseudoconditionedマウス（B）のための瞬目反応の統合された微量の平均します。各トレースは平均を表します単一のセッションですべての試験のためのマウスの応答。青色のセクションでは、ウィスカの振動CSプレゼンテーション中に応答を表します。赤い部分は、刺激のないトレース期間中の応答を表します。 Aでは、ショック米国は、トレース期間の後に濃い灰色の領域中に存在するアーティファクトを誘発した。Bは、ウィスカーの振動のみCSに応答を示します。 CS単独のプレゼンテーションと米国単独で試験がpseudoconditioningでpseudorandomizedた。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図6：すべてのエアコン（N = 8;青いバー）の応答のピークまでの時間の応答ピーク時間ヒストグラムのヒストグラムすべてのtrおよび8 pseudoconditioned（赤いバー）動物。すべてのセッションにわたってIALSは、（1 pseudoconditionedマウスからのデータは、グループ間の回答数の直接比較を可能にするために除外しました）。エアコン、pseudoconditioned動物が重なる場所パープルバーが示しています。レスポンスのピーク時は、CSと米国の発症との間に整流され、統合されたEMG記録の最大ピークの時間として計算されている。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図7：馴化動物の反応曲線（N = 8;青の曲線）とpseudoconditioned動物（N = 9;赤の曲線）。 、パーセントは10のトレーニングセッションを介して空調やpseudoconditioned動物のための適応馴化応答（±SEM）を平均した。B、平均化領域（±SEM）CRの馴化のためにそして、10のトレーニングセッションで動物をpseudoconditioned。C、パーセントは10のトレーニングセッションを介して空調やpseudoconditioned動物のためのアルファレスポンス（±SEM）を平均した。D、パーセントは。馴化および10セッションでpseudoconditionedのための待ち時間の短い応答（±SEM）を平均化こちらをクリックしてくださいこの図の拡大版を表示します。
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Discussion
古典的な瞬目のコンディショニングは、学習と記憶の基礎となる神経基盤を理解するために有用なツールである連想学習の一形態です。マウスなどのげっ歯類の瞬目のコンディショニングのために使用前の方法は、動物が約自由に移動するのを許可されたチャンバーを関与します。シーゲルらに光誘発トレース瞬目コンディショニングにChettih らとHeiney ら。そして最近で利用することにより記載された装置を使用して、マウスにおける瞬目のコンディショニングのためのヘッド固定準備は、このような特定を可能にするなど、いくつかの利点を提供していますことができなかったのか、14-16（ 生体内二光子カルシウムイメージングでは 、例えば ）過去に制限されていた瞬目コンディショニング中に実行する手順と実験。調製のこのタイプはまた、四極アレイとのin vivo電気生理学のような他の技術の使用を容易にします。マウスはdistreになるように見えるように拘束からssed、この頭部固定準備が必要な拘束の量を削減しながら、安全なヘッドを維持するために開発されました。この準備は、マウスは、円筒状のトレッドミル上で歩行することを可能にする一方で、他の人にも成功した安定したプラットフォーム24上にヘッド固定したマウスからの行動データを収集しました。
頭部固定シリンダーシステムを使用して発生する特定の問題は、しかし、存在します。一つの懸念は、1が最初にシリンダーに訓練を受けていないマウスを置くと、それは、残りの部分に学ぶ歩く、または新規な装置上で実行するいくつかの時間を必要とするかもしれないということです。ほとんどのマウスは、残りの部分に迅速に学ぶ歩く、または快適シリンダー上で実行されます。二つの馴化セッションはシリンダーにマウスを慣らすのに役立つと第二セッションの途中によって、ほとんどのマウスは、シリンダに快適です。発生するもう一つの懸念は、ヘッドピースの剥離です。マルチ日間のトレーニングセッション中に、過去にこれにいくつかの問題が、接着剤合着cの使用がありましたementは、ヘッドピースの剥離の問題を改善しました。接着剤合着セメントの使用は、この技術を用いているので、50以上の手術から0％のヘッドピースのavulsionsをもたらしました。正しい使用と頭蓋上のセメントの十分な普及に伴い、研究者は、ヘッドピースの裂離との問題が発生しないはずです。最後に、馴化セッション中にCSを提示することによって、潜在的阻害に関するいくつかの懸念があるかもしれません。これは、マウスが正常に調整したことが明らかである（ 図7参照します ）。ウィスカーの振動の強度が加減抵抗器によって通過される電圧の大きさを変えることによって変更することができることに留意されたいです。マウスは、学習することができない場合、電圧も驚愕反応を最小限に抑えながら、成功したコンディショニングをサポートするように増大させることができます。研究者はまた、動物に送達される電気ショック米国の種類を変更することができます。ここで報告されるように電気ショック米国では100ミリ秒持続する単一の電気パルスすることができます。また、目のようこのプロトコルで利用される電子刺激アイソレータは、研究者も同様に効果的な電気ショックUS 120ヘルツをパルス当たり1ミリ秒で6二相パルスの対を使用することができる二相パルスを送信することができます。
Boele らは 、特定の「馴化応答が「驚愕（α）から、CSまたは短い待ち時間の応答（SLR）25への応答を生じ得る可能性を示しました。アルファ応答はCSの発症後50ミリ秒の待ち時間内での迅速なまぶたの閉鎖であると考えられています。マウスは、多くの場合、彼らの目は、このアルファ応答以下、裁判の期間のため閉鎖続けます。一眼レフカメラは、他の一方で、CSの発症50から70ミリ秒の遅延を有し、典型的ほんの数CS-USのペア後に発生しました。アルファと一眼レフと一眼レフカメラは、わずか数CS-USのペアの後に発生する可能性があるという事実の両方の発症に短い待ち時間は、彼らはおそらく、海馬、小脳回路によって駆動されないことを示しています。これらの観察は、Boele らによって再検討。トンhereforeここに記録CRSは応答を学習されるかどうかの質問を請います。 図7Cおよび7Dのショーとしては、どちらのアルファ応答も一眼レフカメラは、適応のCRは前脳と小脳によって媒介されることを示唆し、記録のCRの大部分を占めます。 CSの発症次の瞬目の応答のピークに待ち時間を示す図6のヒストグラムはまた、特定の試験はより多くの訓練試行と早期発症アルファまたは短い待ち時間の応答を含むことができる一方で、瞬目の応答のピークが実際に後で発生することを示し、時宜を得た馴化応答の発生を示す、米国の発症に近いです。前述したように、ウィスカ刺激と衝撃強度は驚くべきまたは過度に嫌悪はありませんでしたが、適応エアコンの応答をもたらすのに有効なままであったレベルまで減衰しました。最後に、 図7Bに示すように、CR（の大きさは下の面積として測定しますエアコングループは一眼レフとアルファとは異なり、これらの応答は学ぶためにいくつかのセッションを必要とすることを意味する、60％の学習基準に達すると、図5のように整流され、統合された応答の曲線は、）pseudoconditioned群よりもエアコンのグループの方が大きいです反応。
Boele らはまた、EMG測定は、例えばウサギなどの大型動物での瞬き検出の正確な方法ながら、マウス25などの小型げっ歯類のように実用的ではないこと。指摘しました彼らは、EMG記録を示している可能性があり、偽陽性シグナルの検出を回避するために、磁気距離測定技術（MDMT）の使用をお勧めします。 MDMT技術は、瞬き検出の感度と品質で印象的ながら、また、チップ26を取り付けるために動物を訓練の毎日を麻酔することの欠点を提示します。これは、それ自体が学習率を混乱させてもよいです。私たちは、その筋電信号を見つけますここで説明する手順は簡単、高時間分解能で、得られた信頼性の高い測定・解析することが比較的容易であると記録しました。
図4は 、トレーニング中にマウスの目の近くに配置された赤外線反射型光学センサからの対応する信号との点滅を検出する代表的なEMG信号を示しています。 、EMG信号と光センサとの間に検出を点滅EMG記録を使用して、瞬き検出の精度を表すに明確な相関があります。 EMG記録の利点は、それが最大の時間分解能を可能にすることです。分解能は10ミリ秒の時定数を積分することによって分解されるが、1はまた、まばたき活性を検出するために、生のEMGデータを分析することができます。スパイク数が18のCR を検出するために使用され得る1つのパラメータです。 EMGの記録を持つ一つの欠点は、信号が間違いなく（参照感電米国から来た電気アーチファクトによって汚染されるということです
ここで説明するヘッド固定準備がHeiney らによって提示されたものと同様である。15彼らのエレガントなシステムからの特定の顕著な違いは、しかし、があります。例えば、本方法は、瞬目の応答であるEMG活動を記録するために、眼の上に皮下配置配線を記録するために、ここで説明しました。この技術は、まぶたの活動のため、瞬目反応の信頼性と安定した録画を可能にします。これらのワイヤの適切な配置及び固定は、少なくとも2週間、実験の期間続く品質の録音を実現します。ハイではなくEMGワイヤを使用する利点Heiney らによって使用されるよう-speedカメラはEMGの記録は非常に高い時間分解能を持ち、カメラが15を必要とする日常の位置決め及びキャリブレーションを必要としないことです。カメラは、しかし、まぶた閉鎖の直接的な視覚的な決意を提供していません。
2つのシステム間の他の違いは、CSの送達のための方法です。この特定のヘッド固定マウスの調製は、条件刺激としてウィスカ刺激を利用しています。結果は、マウスが頭部固定ウサギはウィスカの振動27で調整することができるのと同様に、CSなどのウィスカ刺激に効果的に調整することができることを示します。 Heiney らは 、ウィスカーパッド15への空気の弱いパフを向けることによって、効果的なCSなどのウィスカーパッドの刺激を実証しました。両方の技術は、効果的なコンディショニングを実証しているが、選択されたウィスカーの上に櫛を配置し、コームを振動させることは、個々のwhiskeを刺激する能力を可能にしますr行または個々のウィスカー。この技術は、20（ すなわち、刺激されたウィスカーの行が刺激されていないウィスカーの行と比較した）自分自身のコントロールとして機能する動物を可能にするために、以前の研究で使用されてきました。
要約すると、ウィスカー合図瞬目コンディショナーヘッド固定製剤は、以前に実行することが不可能または困難であった高度な技術と実験を行うためのセキュアな頭蓋プラットフォームを可能にします。軽度のウィスカ刺激を条件刺激として使用し、軽度の電気ショックは無条件刺激として使用しました。瞬目の応答は、まぶたの後ろに皮下に配置され、ワイヤを用いて記録しました。信頼性の高い学習は、米国のように、CSと眼窩周囲の電気ショックのような選択されたウィスカーの直接刺激とマウスで実証された、と何の学習は、CSと米国のランダムなプレゼンテーションを与えられたマウスでは明らかではなかったです。 EMG記録は信頼できるとRELを提供しました瞬目の応答を記録し、応答がトレーニングセッション間でどのように変化するかを観察するためのatively簡単な方法。
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Disclosures
著者は、彼らが競合する金融利害関係を持たないことを宣言します。
Acknowledgments
この作品は、国防総省（W81XWH-13-01-0243）と国立衛生研究所（R37 AG008796）によって賄われていました。我々は、ヘッド固定シリンダ装置を構築するためのノースウェスタン大学の機械工場でアラン・ベイカーに感謝します。私たちは、MATLABとSolidWorksで彼の指導のために博士Shoai服部に感謝します。我々は実験を制御LabVIEWソフトウェアのためのドクター・ジョンの電源を感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Exervo TeraNova Foam Roller 36" x 6" | Amazon | B002ONUM0E | For cylinder |
| Plexiglas | Custom-made; 1 cm thick | ||
| Metal Rods (12.7 mm diameter) | Custom-made | ||
| 4-40 machine screw (.25 in. long) | Amazon Supply | B00F33Q8QO | For cylinder |
| Classic Design Hair Comb | Conair | 93505WG-320 | For whisker stimulation |
| 2-Layer Rectangular Bending Actuator | Piezo Systems | T220-A4-303X | For whisker stimulation |
| Solder and Flux Kit | Piezo Systems | MSF-003-NI | For whisker stimulation |
| Magnetic Base | Thor Labs | MB175 | For whisker stimulation |
| Threaded rod for magnetic base | Custom-made | ||
| Strips based on 221 series nylon strip connectors from Electronic Connector Corp. | Custom-made, based on Weiss and Disterhoft, 2008 | ||
| TO-220 Style Transistor | Amazon Supply | B0002ZPZYO | For connector; for the wings |
| Relia-Tac Sockets | Electronic Connector Corp. | 220-S02 | For connector |
| Relia-Tac Pins | Electronic Connector Corp. | 220-P02 | For headpiece |
| 0-80 stainless steel machine screw (1 in. long) | Amazon Supply | B000FN68EE | Locking Screw |
| 0-80 stainless steel machine screw hex nut (5/32 in. thick) | Amazon Supply | B000N2TK7Y | Locking Screw Head |
| Loctite Super Glue-Liquid | Loctite | 1365896 | Cyanoacrylic glue; for the locking screw |
| Quick Setting Epoxy | Ace Hardware | 18613 | For connector and whisker stimulation system |
| Ethernet Cable Wires | Ethernet cable can be taken apart to use the individual wires for the connector | ||
| Polyimide coated stainless steel wires (2 in. long, .005 in. diameter) | PlasticsOne | 005sw/2.0 37365 S-S | For headpiece, EMG and shock wires |
| Stainless steel uncoated wire (.005 in. diameter) | AM Systems | 792800 | For headpiece, ground wires |
| Tenma Variable Autotransformer | Tenma | 72-110 | For the whisker stimulation; rheostat to adjust current to the bending actuator |
| Amplifier | A-M Systems | 1700 | Amplifier for filtering and amplifying EMG signals |
| WPI A385R stimulus isolator | World Precision Instruments | 31405 | For the electrical shock |
| Isothesia (Isoflurane) | Henry Schein: Animal Health | 50031 | For surgery; anesthesia |
| Buprenex Injectable CIII | Reckett Benckiser Pharmaceuticals Inc | NDC 12496-0757-1 | For surgery; analgesic |
| Akwa Tears: Lubricant Ophthalmic Ointment | Akorn | NDC 17478-062-35 | Artificial tear ointment to prevent dry eyes while under anesthesia |
| Povidine-Iodine Prep Pads | PDI | NDC 10819-3883-1 | For surgery; antiseptic |
| Alcohol Prep Pads | May be purchased from any standard pharmacy | ||
| Stainless steel surgical scalpel handles (no.3) | Integra Miltex | 4-7. | For surgery |
| Stainless steel surgical scalpel blades | Integra Miltex | 4-310 or 4-315 | For surgery; number 10 or 15 scalpel blade |
| 3% Hydrogen Peroxide | May be purchased from any standard pharmacy | ||
| Micro Clip | Roboz | RS-5459 | For surgery, to hold back skin |
| 00-90 stainless steel machine screw (0.0625 in. long) | Amazon Supply | B002SG89X4 | For surgery, to wrap ground wire around |
| Professional Rotary Tool | Walnut Hollow | 29637 | Hand drill for surgery, to drill holes in skull |
| Inverted Cone Burr | Roboz | RS-6282C-34 | Inverted cone burr size 34; for surgery, to drill holes in skull |
| Engraving Cutter Drill Bit | Dremel | 106 | Engraving cutter; 1.6 mm bit; for surgery, to drill holes in skull |
| C&B Metabond-Quick! Cement System "B" Quick Base | Parkell | S398 | For surgery; adhesive luting cement system; important to prevent headpiece avulsion |
| C&B Metabond-Quick! Cement System Clear L-Powder | Parkell | S399 | For surgery; adhesive luting cement system; important to prevent headpiece avulsion |
| C&B Metabond-Quick! Cement System "C" Universal TBB Catalyst 0.7 ml | Parkell | S371 | For surgery; adhesive luting cement system; important to prevent headpiece avulsion |
| C&B Metabond-Quick! Cement System Ceramic Mixing Dish with temperature strip | Parkell | S387 | For surgery; adhesive luting cement system; important to prevent headpiece avulsion |
| Swiss Tweezers, style #5 | World Precision Instruments | 504506 | For surgery |
| Puritan Cotton-Tipped Applicators | VWR International | 10806-005 | For surgery |
| Dental Caulk Grip Cement Kit | Dentsply | 675570 | For surgery; dental cement |
References
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