Introduction
condicionado piscar de olhos é uma forma de condicionamento pavloviano e um sistema modelo para investigar os mecanismos neurais de aprendizagem associativa e memória. Tem sido investigada em várias espécies, incluindo humanos, coelhos, gatos, ratos e ratinhos. O paradigma envolve a apresentação de dois estímulos emparelhados: um estímulo neutro condicionado (CS; por exemplo, um tom, um flash de luz, ou a estimulação whisker), e um estímulo incondicionado saliente (US; por exemplo, um sopro de ar para o olho, ou choque periorbital). Os EUA provoca uma incondicionada, a resposta eyeblink reflexiva (ou seja, UR). Eventualmente, após várias apresentações do emparelhado CS-US, o sujeito aprende a associar o CS com os EUA. Essa aprendizagem se manifesta sob a forma de uma resposta condicionada (CR), um piscar de olhos provocada pelo CS sozinho que precede a apresentação de os EUA.
condicionado piscar de olhos, sob a forma de rastreamento inclui um intervalo livre de estímulo de poucos hmilissegundos undred que separa o CS e os EUA (Figura 1). Traço condicionado é uma forma de aprendizado declarativo, uma vez que requer consciência das contingências de estímulo 1. O intervalo temporal que requer o animal a manter um neural 'trace' do CS em regiões frontais do cérebro, como o hipocampo para que os EUA e a CS a associar-se 1-6. Juntamente com as regiões do cérebro anterior, o condicionamento é também dependente do cerebelo 7.
condicionado Eyeblink é, portanto, um paradigma útil para a investigação das múltiplas facetas da memória, incluindo a aquisição, consolidação e recuperação. Durante o condicionamento piscar de olhos, um grupo de animais de controlo é apresentada com estímulos desemparelhados por ordem aleatória para testar pseudoconditioning ou sensibilizados respostas ao CS que podem ser causadas por apresentação só nos EUA, em vez de uma associação aprendido CS-US.
Um appara utilizadatus para a investigação de condicionamento de piscar de roedores é uma câmara em que os roedores estão autorizados a circular livremente durante o processo de formação 8-10. Com este tipo de dispositivo, um cabo é normalmente ligado a um capacete que está afixado ao crânio do roedor. A corda permite a entrega de os EUA (e por vezes, a CS) e para transmitir a resposta do animal aos estímulos (ou seja, a resposta de piscar) 10. O cabo pode ele próprio ser modificado com base no tipo de estímulos entregues e como a resposta eyeblink é gravado.
A razão para usar "livremente em movimento" ratos amarrados para o condicionamento eyeblink é que os ratos lutar contra contenção. Apesar de outras espécies podem ser mais receptivos a contenção, a grande vantagem de usar ratinhos em experimentos de condicionamento eyeblink é que a maioria das estirpes mutantes geneticamente modificados estão disponíveis estirpes de ratinho. Além lutam, res completostraint de ratos resulta em sofrimento agudo. Uma preparação rato fixo-cabeça que minimiza o stress aumentaria a informação fisiológica que pode ser obtida durante o condicionamento piscar de olhos. Por exemplo, este sistema permitiria imagens de neurônios corticais com microscopia de dois fótons de 11.
Preparações fixo de cabeça têm sido usados em experiências anteriores para imagiologia óptica do córtex através de implantes cranianos removíveis, in vivo registos electrofisiolicos do cérebro de roedores com matrizes tetrode, imagem de cálcio de dois fotões, e também como uma plataforma para o condicionamento de piscar de ratinhos 11 -16.
No sistema fixo-cabeça, estimulação e gravações de confiança são assegurados sem restrição completa do mouse (Figura 2). Um capacete como o usado no sistema movendo-se livremente é afixada ao crânio do mouse. Durante o treinamento, o capacete é afixada a um conector que está ligado a bares maisuma esteira cilíndrica, a fim de estabilizar a cabeça do roedor (Figura 2A). A esteira cilíndrica permite que o mouse para descansar confortavelmente, mas se o mouse assim o desejar, também permite que ele seja executado ou a andar. Com a utilização deste sistema, os ratos podem ser formados com uma vibração suiça como o CS e um choque eléctrico suave periorbital como os EUA (Figura 1). Os EUA é entregue através de fios cirurgicamente colocado debaixo da pele lateral, para o olho. O CS é entregue através de um pente que é ligado a um actuador 2-camada flexão rectangular (Figura 2B). O pente e flexão do actuador são, então, ligado a uma base magnética que é movido para a posição adequada durante o treino, e é ajustada para entrega ideal para cada animal individual. O pente está posicionada para escarranchar os bigodes selecionados. Durante a entrega do CS, é enviado um sinal para o actuador de flexão que desloca o pente e leva a vibração dos bigodes 17.
16,18,19. A estimulação suiça razão é escolhida para o CS neste paradigma experimental, é a dependência de animais de murino na sua vibrissas para a entrada de informação somatossensorial durante a exploração. Estimulação suiça foi demonstrado ser um fiável e eficaz CS 20. Além disso, dado o substrato cortical bem estabelecida e organizada do sistema vibrissae (ou seja, o córtex barril), a estimulação suiça como o CS fornece uma ferramenta elegante para mapear alterações corticais e plasticidade associados com a aprendizagem eyeblink condicionado 20,21. Um sistema fixo-cabeça permite a estimulação precisa de bigodes selecionados para comparar as respostas entre os neurônios e neurônios que recebem entradas de bigodes não estimuladas estimuladas. Finalmente, muitas linhagens de camundongos apresentam perda auditiva relacionada à idade como adultos relativamente jovens
Aqui apresentados são modificações únicas e importantes sobre outras preparações fixo-cabeça para o condicionamento piscar de olhos, incluindo métodos de entrega CS e US, bem como a aquisição da resposta eyeblink. A confiabilidade deste aparelho eo paradigma de formação no condicionamento eyeblink é demonstrado pelas curvas de ratos condicionados e uma curva de aprendizagem relativamente plana de animais de controle pseudoconditioned (Figura 7A) de aprendizagem.
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Protocol
Todos os procedimentos envolvendo ratos foram realizados de acordo com os protocolos aprovados pelo Animal Care Institucional da Universidade Northwestern e do Comitê Use com base nas diretrizes emitidas pelo Instituto Nacional de Saúde.
1. O cilindro (Figura 2A)
- Construir o cilindro, como descrito por Chettih et ai. E Heiney et al., A partir de um cilindro de espuma de longa 14-15. Cortar um comprimento de 10 cm de cilindro e perfurar um furo através do centro para encaixar o eixo, um metal haste de 12,7 mm (0,5 pol.) De diâmetro. Montar o cilindro com o seu eixo para uma placa de ensaio óptico de metal tal como descrito por Heiney et al., Ou outro suporte (por exemplo, Plexiglas) 15.
- Erigir duas hastes metálicas verticais de 12,7 mm de diâmetro em cada lado do cilindro.
- Anexar duas montagens de ângulo à direita para as hastes de metal.
- Garantir mais duas hastes (5 cm de comprimento, 12,7 mm de diâmetro) através dos suportes em ângulo reto. Bevel the extremidades destas hastes e nivelar as suas extremidades acima do centro do cilindro (Figura 2G).
- Perfurar e bater um buraco através das extremidades niveladas das hastes para caber dois 4-40 parafusos de máquina que irá realizar as asas do conector no lugar (Figura 2G).
2. Montagem do sistema de estimulação Bigode (Figura 2B)
- Cortar um segmento de 10 dente de pente de uma pente de cabelo normal.
- Cortar uma fenda de cerca de 2-3 mm de largura e cerca de 5 mm de profundidade na parte superior do pente para aceitar um actuador 2-camada flexão rectangular.
- Soldar um fio de cada uma das superfícies do actuador de flexão. Utilize a solda e fluxo fornecidos pelo fabricante. Cubra o atuador e solda com fita isolante para proteger o mouse eo usuário da corrente elétrica.
- Deslizamento da tira de actuador na fenda cortada no pente de modo que a tira de actuador de flexão fica perpendicular ao plano do pente. Ângulo o pente para que ele está inclinado a 45 ° e mais naturalmente segue a curva do rosto do mouse.
- Prender a extremidade da tira de actuador ao topo do pente com epoxi de secagem rápida.
Nota: Os fios soldados à tira de dobra actuador deve ser ligada a um reóstato que liberta 40 volts para o actuador. As experiências anteriores demonstraram que a 40 volts é eficaz para o condicionamento mas não evoca qualquer resposta de sobressalto. - Coloque o actuador de flexão e o pente em uma montagem móvel. Um suporte de pipeta ligado a uma base magnética, como normalmente utilizado in vitro para electrofisiologia plataformas funciona bem.
3. Montagem do conector que monta para Rods acima do cilindro (Figura 2C, 2E)
Nota: O conector é um 3-D impressa tira 7 buracos modelada a partir da faixa de nylon 221 séries Amphenol utilizado para a corda por Weiss e Disterhoft e Galvez et al 10,17.
- Toque no primeiro buraco na faixa para um 0-80 x-1"Parafuso de máquina. Isto servirá como um parafuso de fixação para fixar a peça de cabeça para o conector. Juntar uma porca 0-80 para a cabeça do parafuso de fixação com cola cianoacrílico com o fim de facilitar a rodar o parafuso à mão.
- Deixar um buraco vazio após o furo roscado (para permitir espaço para a porca 0-80 máquina) e empurre cinco bases relia-tac banhados a ouro através dos restantes cinco buracos.
- Tira o revestimento fora cinco fios longos (fios obtidos a partir de um cabo Ethernet) e solda para as extremidades dos soquetes.
Nota: Os dois primeiros fios irá ser utilizado para gravar os sinais de eletromiográficas (EMG) que irá detectar uma resposta eyeblink seguinte filtragem do sinal e amplificação a partir de um amplificador. O segundo dois vai entregar o sinal de choque de um isolador de estímulo. O último fio servirá como uma ligação à terra. Estes fios serão conectados aos sistemas utilizados para a entrega cronometrado CS-US. - Garantir a conectividade elétrica entre os fios e os sockets com um multiMeter. Coloque o multímetro na configuração da continuidade e segure uma das sondas para o pino e a outra sonda para as extremidades descarnadas do fio. Os pinos e os fios estão ligados electricamente quando a resistência é baixa e o multímetro emite um tom.
- Alternativamente, se o multímetro não tem uma configuração de continuidade, medir a resistência entre os pinos e os fios. Não há continuidade eléctrica se há muito pouca resistência medida.
- Prepare as asas do conector de dois para-220 transistores de estilo. Cortar os fios emissor, base e coletor do transistor e nivelar a superfície para que ele possa ser aposta no conector.
- Cortar a borda da guia de montagem para violar o buraco para que o guia pode deslizar por baixo da cabeça do parafuso.
- Epoxy os transistores ao conector. O furo na guia de montagem vai ser utilizado para fixar o conector para as hastes de cima do cilindro.
- Aplicar epoxi à base de fios protruding a partir das tomadas e permitir que a epoxi seque. O epoxi vai isolar e proteger as ligações.
4. Preparar o capacete (Figura 2D, 2E)
Nota: A tira capacete é um 3-D impressa tira 7 buracos modelada a partir da faixa de séries de nylon Amphenol 221 usado para o capacete por Weiss e Disterhoft e Galvez et al 10,17.. Esta parte não é mais fabricado comercialmente. O arquivo de impressora pode ser baixado do website do jornal.
- Toque no primeiro buraco na faixa para um parafuso de máquina 0-80 x 1 "e deixar um buraco vazio após o primeiro buraco.
- Empurrar cinco pinos banhados a ouro através da parte inferior dos restantes cinco furos (através das extremidades mais estreitas). Use um torno para facilitar empurrar os pinos para a faixa uniformemente.
- Usando uma stripper térmica, remover cerca de 0,5 cm de poliimida revestimento fora da extremidade de um fio de aço inoxidável (0,005 pol. De diâmetro), soldar a extremidade descarnada do Wira para a abertura de um dos pinos e de cortar o fio para 0,6-0,7 cm.
- Tira cerca de 0,2 cm a partir da extremidade do fio para permitir que a corrente passe para o animal.
- Repita os passos de 4,3-4,4 para os restantes três fios.
Nota: Os dois primeiros fios irá gravar as respostas EMG, enquanto os outros dois servirão para entregar um choque para o animal. - Como o último (quinto) do fio vai servir como um fio de terra, cortar cerca de 5 cm de arame de aço inoxidável não revestido (0,005 pol. De diâmetro), e solda para o pino restante.
- Assegurar a continuidade entre os fios e os pinos com um multímetro. (No caso do fio de terra, que é não revestido, a sonda multímetro pode ser colocado em qualquer lugar ao longo do fio).
5. Preparação cirúrgica (Figura 2F)
- Esterilizar todos os instrumentos cirúrgicos, incluindo o capacete. Esteriliza-se o capacete por imersão em álcool e, em seguida, a lavagem com solução salina estéril.
- Anestesiar o mouse em uma câmara de indução com 3-4% vaporized isoflurano misturado com um caudal de 1-2 L de oxigénio por minuto.
- Verificar que o animal é completamente anestesiado com uma pitada do dedo do pé. O mouse é totalmente anestesiado quando ele não responder reflexivamente a pitada dedo do pé.
- Uma vez que o animal tenha sido completamente anestesiado, injectar uma dose de cloridrato de buprenorfina como um analgésico (0,05-2 mg / kg, sc), raspar o topo da cabeça do animal, colocar sobre uma almofada de aquecimento coberto na base da armação estereotáxica , verificar que o animal está completamente anestesiado, e proteger a cabeça para o quadro. Manter o fluxo de isoflurano vaporizado ao animal, alternando a 2% com um caudal de 1-2 L de oxigénio por minuto. Aplique uma pequena quantidade de pomada oftálmica para as córneas.
- Desinfectar o couro cabeludo com povidona-iodo e álcool três vezes cada, alternando entre os dois.
- Com uma lâmina de número 10 ou 15 bisturi, fazer uma incisão ao longo da linha média do couro cabeludo, expondo o crânio a partir da parte dianteira do tele os olhos para além do osso do interparietal (~ 1,5-2 cm).
- Segurar as abas de pele com micro clips. Coloque um grampo acima do olho, um ao longo do meio do eixo rostral-caudal, e um na parte posterior do crânio bilateralmente (isto é, seis usar grampos em tudo). A fim de evitar headpiece avulsão, expor tanto do crânio quanto possível, incluindo os lados e para trás. Isto irá aumentar a área de superfície para a aplicação da película de cimentação adesiva.
- Usando o bisturi, raspagem ao longo da parte superior do crânio para remover o periósteo e assegurar uma superfície de trabalho limpo e seco. Limpar o topo do crânio com 3% de peróxido de hidrogénio três vezes.
- Faça dois furos no crânio com um tamanho 34 burr cone invertido ou 1,6 milímetros fresa de gravar broca para aceitar 00-90 parafusos (0,0625 in. De comprimento). Os parafusos irá fornecer a ligação à terra. Coloque um orifício na frente de bregma, e o outro em frente da Lambda, à esquerda da linha média, quando o condicionamento do Right olho. Coloque um parafuso em cada buraco. Abaixe o parafuso de 0,28 mm no crânio para cada volta completa; duas voltas completas é suficiente.
- Criar vários pequenos torrões de aproximadamente 0,75 mm de diâmetro sobre o crânio, a fim de aumentar a área da superfície e da força de preensão para o cimento.
- Tome o capacete concluído e enrolar o fio terra em uma configuração em forma de oito em torno dos dois parafusos. Permitir alguma folga (~ 1,5 cm entre o capacete eo parafuso) no fio terra assim que o capacete pode ser posicionado corretamente mais tarde.
Nota: O número oito geralmente garante uma boa conexão elétrica entre o fio e os parafusos de terra. O fio pode também ser soldado ao parafuso para garantir uma ligação eléctrica. - Aplicar o cimento cimentação adesiva. Siga as instruções do fabricante para a mistura do cimentação cimento cola ou misture 4 colheres de mix L-Pó, 8 gotas de base, e 2 gotas de catalisador em um prato de mistura de cerâmica fria (garantir a faixa de temperatura on o prato de mistura é completamente preto.) A temperatura fria estende o tempo de trabalho do cimento.
- Brasão do crânio e os parafusos liberalmente com o cimento resinoso e permitir que o cimento secar. Isto deve levar apenas alguns minutos.
- Depois que o cimento secar, coloque o capacete na vertical, com os pinos de pé, acima do crânio. Segurar o capacete no lugar com um suporte semelhante ao conector
Nota: Consulte "3. Montagem do conector" O titular só precisa de ser uma faixa de cinco buraco com soquetes banhados a ouro, a fim de receber os pinos do capacete. O titular é anexado a um braço sobre o quadro estereotáxico. O uso do suporte e o braço facilita o posicionamento da peça de cabeça e os fios. - Após o capacete foi posicionado, descascar a pele ao redor da área periorbital e posicionar os dois fios de choque para permitir que os 0,2 cm extremidade descarnada para descansar debaixo da pele e cerca de 2-4 mm diretamente caudal ao eye. Não permita que as extremidades dos dois fios se toquem. Posicione os dois fios da EMG na muscularis orbicular dos olhos acima da órbita do olho.
- Se necessário, cortar as pontas dos fios se eles são demasiado longos e parece que eles podem arranhar diretamente a órbita e resultar em infecção. Se cortar as pontas do fio, certifique-se de que não é o suficiente fio desencapado exposto. Em alternativa, se os fios parecem muito tempo, dobrar o fio de volta para a base, onde elas se estendem para fora da peça de cabeça.
- Cimento a base dos fios (ou seja, a extremidade mais próxima da peça de cabeça) no lugar sobre o crânio com um pequeno propagação do cimento cimentação adesiva e deixar secar (utilização metade da porção descrito anteriormente).
- Retire as micro grampos e gentilmente dobre as abas de pele para trás sobre o cimento. Permitir que a pele para resolver naturalmente para evitar a tensão em qualquer parte da pele, a fim de evitar distorções da pálpebra, a prevenção da resposta eyeblink,e sofrimento para o animal.
- Selar a área exposta com cimento dental, abrangendo desde a incisão da pele para a borda de topo da peça de cabeça com cimento. Tome cuidado extra para evitar gotejamento de cimento sobre os olhos ou os pinos do capacete. Parcialmente cimento curado podem ser suavizadas e manipulados com um pedaço de algodão umedecido com solvente de cimento dental. Permitir que o cimento secar completamente antes de remover o suporte do capacete.
- Permitir ao animal recuperar da anestesia em uma superfície aquecida antes de substituir o animal de volta em sua gaiola. Administrar Metacam (1 mg / kg, SQ) e, em seguida, colocar o animal de volta em sua gaiola.
- Permitir que o animal 5-7 dias de recuperação antes do teste ou treinamento. Manter cuidados pós-operatórios padrão para o animal de acordo com as diretrizes da sua instituição. O animal deve ser verificado pelo menos uma vez por dia depois de ter recuperado de uma cirurgia. Atenção aos sinais de má alimentação e / ou beber e comportamento apático. Se a doré suspeita, fornecer Metacam cada 24 horas (mesma dose que no final de pós-cirurgia) até aliviado. A lidocaína pode ser aplicado localmente na ferida se o animal está se coçando ou apresenta sinais de desconforto.
6. Colocar o mouse sobre o cilindro e Formação (Figura 2G)
- Para colocar o mouse sobre o cilindro, conter o mouse com a mão brevemente, segurando-o pelo rabo com uma mão e, em seguida, segurando o mouse por trás dos ombros com o indicador e polegar com o outro. Enrole os dedos restantes ao redor do abdômen e tronco do mouse.
- Com a mão não restringindo o mouse, conecte o conector para o capacete na cabeça do mouse e girar o parafuso de bloqueio.
- Posicione o mouse suavemente no cilindro e segurá-la no lugar enquanto anexando o conector para o quadro. Use os dois parafusos para fixar o conector para as barras de cima do cilindro.
- Uma vez que o conector tenha sido fixadas à estrutura do cilindro, release o domínio sobre o mouse. Dê o mouse de um dia duas sessões de habituação ao cilindro. Permitir que cada sessão de habituação a mesma duração que cada sessão condicionado.
- Ficha taxa de intermitência espontânea durante habituação e pré-expor os ratos para a vibração suiça CS, a fim de minimizar a ocorrência de respostas de alarme. Aplique o CS como durante uma sessão real condicionado, mas sem o choque eléctrico US.
- Aplicar a estimulação whisker CS, colocando o sistema Piezo próximo (cerca de 0,5 cm) para o lado ar (do lado direito) do mouse, enquanto deslizando os dentes do pente sobre bigodes individuais. Certifique-se de que os mesmos bigodes são estimulados dia a dia, colocando o sistema Piezo na mesma posição de dia para dia.
- Começar a treinar o mouse sobre o condicionamento clássico. Entregar duas sessões de treinamento por dia durante cinco dias. Deixar cerca de duas horas entre cada sessão de treinamento.
- Para o grupo condicionado, deliver trinta ensaios por sessão de 250 ms de comprimento suiça vibração CS (60 Hz) emparelhado com um pulso elétrico 100 ms de comprimento EUA (0,3 mA - 3 mA, entregues a partir de um WPI A385R estímulo isolador). Separe o CS e os EUA com um ms longo intervalo de rastreamento 250 livre de estímulo para tornar a tarefa dependente do hipocampo (Figura 1) 23.
- Ajustar a intensidade do choque eléctrico para cada animal, de modo que um piscar é evocado. ensaios separados com um intervalo inter aleatória de 30-60 segundos (média de 45 segundos, a duração total de 30 minutos por sessão.)
- Deliver trinta CS desemparelhado isoladamente e nos sozinhos ensaios cada (para um total de sessenta ensaios) para o grupo pseudoconditioned, utilizando os mesmos parâmetros de estímulo como indicado para o grupo condicionado. Certifique-se de que o CS sozinho e US ensaios só são pseudorandomized tal que nenhum estímulo é apresentado mais de duas vezes consecutivas. Separe cada ensaio com um intervalo inter média de 22,5 seg.
- defígado ruído de fundo em 65 dB em toda a habituação e da formação, a fim de mascarar qualquer barulho da vibração gerada pelo estimulador triz.
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Representative Results
8-10 semana do sexo masculino de idade ratinhos C57BL6 / J foram treinados sobre trace eyeblink condicionado no aparelho esteira cilíndrico fixo-cabeça. 8 ratos foram treinados com apresentações emparelhadas CS-americanos (grupo condicionado) e 9 ratos foram treinados com apresentações CS e US desemparelhados (grupo pseudoconditioned).
Exemplo EMG gravações de uma resposta condicionada de um ratinho condicionados são apresentados nas Figuras 3 e 4. Registos EMG para cada ensaio foram rectificadas e integrado com uma constante de tempo mseg 10. A Figura 5 mostra o rectificado e integrado vestígios de resposta EMG média de todos os ensaios para cada uma das 10 sessões para tanto um condicionado (A) e A (B) ratinho pseudoconditioned. A evolução das respostas condicionadas pode ser visto na figura 5A, com respostas cada vez maiores mais perto do início de os EUA. Esta evolução não é visto in as respostas na Figura 5B pseudoconditioned.
A evolução do bem-cronometrada, e respostas condicionadas assim, bem aprendida também pode ser visto na Figura 6. A Figura 6 mostra os histogramas do tempo para o pico da resposta após início CS. Há um pico inicial no gráfico entre 0 - 150 mseg após início CS. Este pico inicial pode ser visto como o mais cedo na sessão 1. Com mais sessões de treino, há o desenvolvimento de um segundo pico no gráfico entre 400-500 ms entre os animais condicionados, indicando o desenvolvimento de respostas condicionadas melhor-cronometrada.
A Figura 7A mostra as respostas adaptativas condicionado por cento em média gravados a partir de ratos condicionados e pseudoconditioned. respostas adaptativas condicionado são considerados como tendo actividade significativa que está presente, pelo menos, 20 ms BEFminério de aparecimento dos Estados Unidos (ou seja, pelo menos 4 SD maiores do que a actividade média presentes 250 ms antes do aparecimento CS). Durante os treinamentos, os ratos condicionados mostrou aprendizagem gradual do paradigma de condicionamento exibindo respostas adaptativas mais condicionados com cada sessão de treinamento para que os ratos condicionados apresentaram significativamente mais respostas adaptativas condicionado do que os camundongos pseudoconditioned (grupos, F (1,15) = 20,62, p <.0005; sessões, F (1,9) = 9,987, p <0,0001; grupos * sessões, F (1,9) = 5,977, p <0,0001). Note-se que o grupo pseudoconditioned tipicamente exibida RCs pseudo em menos do que 20% dos ensaios.
A Figura 7B mostra a área média de resposta condicionada (a área sob a curva da resposta EMG rectificado e integrada) para ambos os ratinhos condicionados e pseudoconditioned mais de dez as sessões de treino. comparações planejadas com um ANOVA de medidas repetidas ao longo do last quatro sessões (isto é, 7-10 sessões, uma vez que o grupo condicionado tinha atingido um critério de aprendizagem de 60% CR) mostram um efeito principal significativo do grupo, o que indica que a área de CR foi maior no grupo do que no ar pseudoconditioned aprendizagem pós grupo critério (grupos, F (1,14) = 5,733, p <0,05; sessão, F (1,3) = 0,486, ns, grupos * sessão, F (1,3) = 0,432, ns).
Figura 7C mostra as respostas de média cento alfa (sobressalto) registadas a partir dos ratos condicionados e pseudoconditioned. respostas alfa são a atividade dentro de 50 ms de CS início que eram pelo menos 4SD acima da atividade basal médio. Durante os treinos, condicionado e pseudoconditioned ratos normalmente expostos respostas alfa com menos de 25% dos ensaios, sem diferenças significativas entre os ratos condicionados e pseudoconditioned (grupos, F (1,15) = 2,502, NS). ºANOVA de medidas repetidas e, no entanto, revelar uma interacção significativa de grupos e sessões devido à diminuição em respostas pseudoconditioned e a manutenção de respostas alfa a cerca de 25% para ratinhos condicionados (grupos de sessões *, F (1,9) = 2,074, p <0,05). O aumento nas respostas alfa durante a sessão 10 é provavelmente devido à latência do início do curto do CR bem desenvolvida.
A Figura 7D mostra a percentagem média de resposta de latência curta gravado a partir de ambos os grupos de ratinhos. respostas de latência curta reflecte a actividade entre 50-70 ms seguinte CS início que era 4SD acima da atividade basal médio. A medidas repetidas ANOVA revelou que os animais condicionados apresentaram respostas de latência mais curtos do que os animais pseudoconditioned sobre as sessões de dez treinamento (grupos, F (1,15) = 5,377, p <0,05; sessão, F (1,9) = 3.920, p <.0005, grupos * sessão, F (1,9) = 3.158, p <0,005). Tseu pode refletir um tempo de início anterior do CR, como o grupo condicionado exibiu CRs maiores, com cada sessão de treinamento.
Figura 1:. O traço Eyeblink Condicionado paradigma no traço eyeblink condicionado, um estímulo condicionado inócua (CS) está emparelhado com um estímulo incondicionado levemente nocivo (US) destinado a induzir uma resposta eyeblink. O CS e US são separados por um espaço temporal sem estímulo, tornando o paradigma hipocampo-dependente 23. No paradigma descrito aqui, um 250 ms de comprimento suiça vibração CS está emparelhado com um 100 ms de comprimento periorbital nos chocar. O CS e US são separados por um espaço temporal de 250 ms de comprimento. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2:. O fixo-Head Preparação A, o set-up de cabeça fixa para o condicionamento piscar de olhos com o cilindro, o estimulador suiça, eo conector indicado B, O estimulador suiça com o actuador de flexão de duas camadas e comb indicado.. C, o conector com as partes individuais indicados: o parafuso de bloqueio, a tira 7 buracos, os fios soldados às tomadas e epoxy para preservar os fios, as asas convertido a partir de um TO-220 transistor estilo D, o capacete com o indivíduo. peças indicados: a tira 7 buracos, os pinos e os fios soldados nos pinos, incluindo o fio terra em aço inoxidável não revestido, eo choque individual e fios de aço inoxidável EMG, com 0,2 cm de revestimento de poliimida apagam a fim e. , a configuração para cada buraco na faixa de 7 buracos tanto para o conector eoheadpiece. F, Um rato com um capacete implantado cirurgicamente. G, Um rato é colocado no cilindro, pronto para ser treinado. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3:. Exemplo EMG gravação As linhas azuis delinear a apresentação CS (250 ms de comprimento). As linhas vermelhas delinear a apresentação dos EUA, que mostra o artefacto que vem do choque eléctrico (100 ms). O CS e US são separados por um intervalo livre de estímulo de 250 ms. Dentro deste intervalo livre de estímulo é a atividade EMG maior amplitude (em relação à linha de base), que delineia um CR. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura. </ A>
Figura 4:. Exemplo EMG e correspondentes gravações reflexão de infravermelho ópticos A gravação EMG é tão preciso quanto o sensor óptico infravermelho reflexão na detecção de início condicionado de resposta (linha azul), a latência a pico de resposta (linha vermelha), e eyeblink incondicionado início de resposta ( linha rosa). por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5:. Averaged Traços eyeblink média corrigida e vestígios integrados da resposta eyeblink por um rato condicionado (A) e um rato pseudoconditioned (B). Cada traço representa a médiaresposta do mouse para todos os ensaios sobre uma única sessão. A secção de azul representa a resposta durante a apresentação CS suiça vibração. A parte vermelha representa a resposta durante o intervalo do traço livre de estímulo. Em A, o choque US induziu um artefato que está presente durante o escuro área cinzenta após o intervalo do traço. B mostra as respostas à vibração suiça CS somente. Apresentação de CS sozinho e US ensaios só foi pseudorandomized em pseudoconditioning. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
. Figura 6: Os histogramas do Pico Tempos de Resposta histogramas do tempo para o pico de resposta para todos condicionados (n = 8; barras azuis) e 8 pseudoconditioned (barras vermelhas) animais para todos os trIALS em todas as sessões (dados de um rato pseudoconditioned foi excluída para permitir uma comparação directa entre o número de respostas entre os grupos). bares roxas indicam onde os animais condicionado e pseudoconditioned sobrepõem. Horários de pico de resposta são calculados como o tempo do maior pico da gravação EMG retificado e integrada entre CS e US início. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 7: Curvas de resposta dos animais condicionados (n = 8; curvas azul) e os animais pseudoconditioned (n = 9; curvas vermelhas). Um, Percentagem Média de respostas adaptativas condicionado (± SEM) para os animais condicionados e pseudoconditioned mais de 10 sessões de treinamento. B, área de médio (± SEM) do CR para condicionadoe C, Percentagem Média Alpha Response (± SEM) para os animais condicionados e pseudoconditioned mais de 10 sessões de treinamento animais pseudoconditioned mais de 10 sessões de treinamento.. D, Percentagem Média de respostas curta latência (± SEM) para condicionado e pseudoconditioned ao longo de 10 sessões. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Classical eyeblink condicionado é uma forma de aprendizagem associativa que é uma ferramenta útil para a compreensão das bases neurais subjacentes à aprendizagem e memória. Os métodos anteriores empregues para o condicionamento de piscar de roedores, tais como ratinhos envolveu uma câmara que permitiu que o animal se mover livremente. A preparação fixa-cabeça para o condicionamento de piscar de ratinhos, usando o aparelho descrito por Chettih et ai. E Heiney et ai., E utilizados mais recentemente, em luz evocadas traço eyeblink condicionado em Siegel et al., Oferece várias vantagens, tais como permitir que certa procedimentos e experiências para ser executada durante o condicionamento piscar de olhos, que não tinha sido possível, ou tinha sido limitada no passado (por exemplo, imagiologia in vivo de cálcio de dois fotões) 14-16. Este tipo de preparação também facilita a utilização de outras técnicas, tais como electrofisiologia in vivo com matrizes tetrode. Como os ratos parecem tornar-se Distressed de contenção, esta preparação fixo-cabeça foi desenvolvida para manter a cabeça segura, reduzindo a quantidade de contenção necessário. Enquanto esta preparação permite ratos para deambular em uma esteira cilíndrica, outros também foram coletados com sucesso dados comportamentais de ratos fixo-cabeça em uma plataforma estável 24.
Existem, no entanto, certos problemas que surgem com a utilização do sistema de cilindro fixo-cabeça. Uma preocupação é que quando se coloca inicialmente um mouse sem treinamento no cilindro, ele pode precisar de algum tempo para aprender a descansar, caminhar ou correr no novo aparelho. A maioria dos ratos aprendem rapidamente para descansar, caminhar ou correr no cilindro confortavelmente. Duas sessões de habituação ajudar a acostumar os ratos para o cilindro e por meio da segunda sessão, a maioria dos ratos são confortáveis no cilindro. Outra preocupação que se coloca é headpiece avulsão. Tem havido algum problema com este no passado durante as sessões de treino múltiplos dias, mas o uso do adesivo de cimentação cement tem melhorado problemas com avulsão capacete. O uso de película de cimentação adesiva resultou em 0% avulsão headpiece de mais de 50 desde as cirurgias utilizando esta técnica. Com o uso correto e disseminação suficiente do cimento no crânio, os pesquisadores devem encontrar nenhum problema com avulsão capacete. Finalmente, através da apresentação do CS durante as sessões de habituação, pode haver alguma preocupação com a inibição latente. É claro, no entanto, que os ratos foram condicionados com sucesso (ver Figura 7). Note-se que a intensidade da vibração suiça pode ser modificada alterando a quantidade de tensão que lhe é transmitido pelo reostato. Se os murganhos são incapazes de aprender, a tensão pode ser aumentada para suportar condicionado bem sucedida ao mesmo tempo, minimizando respostas de alarme. Os pesquisadores também podem alterar o tipo de choques eléctricos dos EUA que é fornecido ao animal. O choque elétrico US pode ser um único pulso elétrico que dura 100 ms como relatado aqui. Em alternativa, como thisolador e estímulo utilizado neste protocolo é capaz de transmitir impulsos bifásicos, os pesquisadores também podem empregar 120 Hz 6 pares de pulsos bifásicos em 1 ms por impulso de um choque elétrico eficaz EUA também.
Boele et al. Indicou a probabilidade de que certos "condicionado respostas" podem surgir a partir de sobressalto (alpha) respostas ao CS ou respostas de curta latência (SLR) 25. respostas alfa são considerados fechos rápidos pálpebra dentro de uma latência mseg após 50 CS início. Ratos muitas vezes manter os olhos fechados para a duração do julgamento, na sequência desta resposta alfa. SLRs, por outro lado, tem uma latência de 50-70 ms de CS início e normalmente surgem depois de apenas alguns emparelhamentos CS-americanos. O curto tempo de latência para o início de ambos alfa e SLRs eo fato de que SLRs podem surgir depois de apenas alguns emparelhamentos CS-americanos indicam que eles provavelmente não são movidos pelo circuito do hipocampo-cerebelar. Estas observações revisados por Boele et al. Tor conseguinte levantam a questão de saber se os CRs registradas aqui são respostas aprendidas. Como a Figura 7C e 7D mostra, nem respostas alfa nem SLR conta para a maioria das CRs gravados, sugerindo que os RCs adaptativas são mediadas pela parte frontal do cérebro e cerebelo. Os histogramas da Figura 6 que mostram a latência para o pico da resposta eyeblink seguinte CS início também indica que, embora certos ensaios podem incluir uma alfa início precoce ou resposta de latência curta, com mais tentativas de treino, o pico da resposta piscar de olhos, na verdade, ocorre mais tarde e mais perto do início de os EUA, indicando o desenvolvimento de respostas condicionadas bem cronometrados. Como mencionado anteriormente, a estimulação suiça e intensidade de choque foram atenuados para um nível que não era surpreendente ou excessivamente aversivo, mas manteve-se eficaz na produção de respostas adaptativas condicionado. Por fim, como mostra a Figura 7B, o tamanho do CR (medido como a área sob acurva na resposta rectificado e integrado, como na Figura 5) é maior no grupo condicionado do que no grupo pseudoconditioned uma vez que o grupo ar atingiu um critério de aprendizagem de 60%, o que significa que estas respostas requerem várias sessões de aprender, ao contrário de reflex e alfa respostas.
Boele et al. Também apontou que as medições de EMG, enquanto um método preciso de piscadas em animais maiores, como coelhos, não são tão prático em pequenos roedores, como ratos 25. Eles recomendam o uso da técnica de medição de distância magnética (MDMT) para evitar a detecção de sinais falsos positivos que a gravação EMG podem indicar. A técnica MDMT, enquanto impressionante em sua sensibilidade e qualidade de detecção de olhos fechados, também apresenta a desvantagem de ter que anestesiar o animal cada dia de treinamento, a fim de anexar o chip 26. Isso por si só pode confundir as taxas de aprendizagem. Nós achamos que os sinais EMGgravado com os procedimentos descritos aqui são facilmente obtidos, de alta resolução temporal, confiável e relativamente fácil de medir e analisar.
A Figura 4 mostra um sinal de EMG representante detectar pisca com um sinal correspondente a partir de um sensor ótico reflexivo infravermelho colocado próximo ao olho do rato durante o treinamento. Há uma correlação clara em piscadas entre o sinal de EMG e o sensor óptico, o que denota a precisão de detecção de olhos fechados usando registros de EMG. Uma vantagem de registos EMG é que ele permite a maior resolução temporal. Embora a resolução é degradada através da integração de mais de 10 ms constante de tempo, pode-se analisar os dados EMG brutos para detectar a atividade piscar de olhos. Contagem de pico é um parâmetro que pode ser utilizado para detectar RCs 18. Uma desvantagem com registos EMG é que os sinais, sem dúvida, ser contaminado pelo artefato elétrico proveniente do choque elétrico dos EUA (ver
A preparação fixa-cabeça aqui descrito é semelhante ao apresentado por Heiney et al. 15 Há, contudo, algumas diferenças notáveis de seu sistema elegante. Por exemplo, o método descrito aqui para gravar as respostas piscar de olhos são fios colocados subcutaneamente acima do olho para gravar a atividade EMG. Esta técnica permite registos fiáveis e estáveis de actividade pálpebra e assim, a resposta de piscar de olhos. A colocação adequada e a fixação destes fios assegura gravações de qualidade que duram durante, pelo menos, duas semanas, a duração da experiência. Uma vantagem de usar fios de EMG, em vez de um elevadocâmara -velocidade tal como utilizado por Heiney et ai. que é registos EMG tem extremamente alta resolução temporal, e não exigem o posicionamento diário e de calibração que requer uma câmara 15. A câmera, no entanto, oferecer determinação visual direto do fechamento das pálpebras.
Outra diferença entre os dois sistemas consiste no método para a entrega CS. Esta preparação especial do mouse fixo-cabeça utiliza estimulação suiça como o estímulo condicionado. Os resultados demonstram que os ratos pode ser eficazmente condicionado com estimulação suiça como o CS, tal como coelhos fixo de cabeça pode ser condicionada com vibração suiça 27. Heiney et ai. Demonstraram estimulação da almofada suiça como um CS eficaz dirigindo um sopro de ar fraca para a almofada 15 suiça. Embora ambas as técnicas demonstrar condicionado efectiva, colocando um pente sobre suiças seleccionadas e fazer vibrar o pente permite a capacidade de estimular Whiske indivíduor linhas ou mesmo bigodes individuais. Esta técnica tem sido utilizada em estudos anteriores para permitir a animais para servir como o seu próprio controlo (isto é, a linha suiça estimulada foi comparada com uma linha de bigodes não estimuladas) 20.
Em resumo, uma preparação fixo-cabeça para sinalizou-suiça eyeblink condicionado permite uma plataforma cranial seguro para a realização de técnicas avançadas e experimentação que tinha sido anteriormente impossível ou difícil de executar. estimulação suiça leve foi usada como o estímulo condicionado e um choque eléctrico suave foi usado como o estímulo não condicionado. respostas eyeblink foram gravadas com fios colocados subcutaneamente por trás da pálpebra. aprendizagem de confiança foi demonstrada em ratos com estimulação direta de bigodes selecionado como o CS e choque elétrico periorbital, como os EUA, e nenhum aprendizado foi evidente em ratos que foram dadas apresentações aleatórios do CS e os EUA. As gravações do EMG forneceu um confiável e relMétodo tivamente simples para registrar as respostas piscar de olhos e observando como as respostas alteradas em todas as sessões de treinamento.
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Disclosures
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado pelo Departamento de Defesa (W81XWH-13-01-0243) e os Institutos Nacionais de Saúde (R37 AG008796). Agradecemos Alan Baker em oficina mecânica da Universidade Northwestern para a construção do aparelho de cilindro fixo-cabeça. Agradecemos ao Dr. Shoai Hattori por sua orientação em MATLAB e Solidworks. Agradecemos ao Dr. John Power para o software LabView que controlava o experimento.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Exervo TeraNova Foam Roller 36" x 6" | Amazon | B002ONUM0E | For cylinder |
| Plexiglas | Custom-made; 1 cm thick | ||
| Metal Rods (12.7 mm diameter) | Custom-made | ||
| 4-40 machine screw (.25 in. long) | Amazon Supply | B00F33Q8QO | For cylinder |
| Classic Design Hair Comb | Conair | 93505WG-320 | For whisker stimulation |
| 2-Layer Rectangular Bending Actuator | Piezo Systems | T220-A4-303X | For whisker stimulation |
| Solder and Flux Kit | Piezo Systems | MSF-003-NI | For whisker stimulation |
| Magnetic Base | Thor Labs | MB175 | For whisker stimulation |
| Threaded rod for magnetic base | Custom-made | ||
| Strips based on 221 series nylon strip connectors from Electronic Connector Corp. | Custom-made, based on Weiss and Disterhoft, 2008 | ||
| TO-220 Style Transistor | Amazon Supply | B0002ZPZYO | For connector; for the wings |
| Relia-Tac Sockets | Electronic Connector Corp. | 220-S02 | For connector |
| Relia-Tac Pins | Electronic Connector Corp. | 220-P02 | For headpiece |
| 0-80 stainless steel machine screw (1 in. long) | Amazon Supply | B000FN68EE | Locking Screw |
| 0-80 stainless steel machine screw hex nut (5/32 in. thick) | Amazon Supply | B000N2TK7Y | Locking Screw Head |
| Loctite Super Glue-Liquid | Loctite | 1365896 | Cyanoacrylic glue; for the locking screw |
| Quick Setting Epoxy | Ace Hardware | 18613 | For connector and whisker stimulation system |
| Ethernet Cable Wires | Ethernet cable can be taken apart to use the individual wires for the connector | ||
| Polyimide coated stainless steel wires (2 in. long, .005 in. diameter) | PlasticsOne | 005sw/2.0 37365 S-S | For headpiece, EMG and shock wires |
| Stainless steel uncoated wire (.005 in. diameter) | AM Systems | 792800 | For headpiece, ground wires |
| Tenma Variable Autotransformer | Tenma | 72-110 | For the whisker stimulation; rheostat to adjust current to the bending actuator |
| Amplifier | A-M Systems | 1700 | Amplifier for filtering and amplifying EMG signals |
| WPI A385R stimulus isolator | World Precision Instruments | 31405 | For the electrical shock |
| Isothesia (Isoflurane) | Henry Schein: Animal Health | 50031 | For surgery; anesthesia |
| Buprenex Injectable CIII | Reckett Benckiser Pharmaceuticals Inc | NDC 12496-0757-1 | For surgery; analgesic |
| Akwa Tears: Lubricant Ophthalmic Ointment | Akorn | NDC 17478-062-35 | Artificial tear ointment to prevent dry eyes while under anesthesia |
| Povidine-Iodine Prep Pads | PDI | NDC 10819-3883-1 | For surgery; antiseptic |
| Alcohol Prep Pads | May be purchased from any standard pharmacy | ||
| Stainless steel surgical scalpel handles (no.3) | Integra Miltex | 4-7. | For surgery |
| Stainless steel surgical scalpel blades | Integra Miltex | 4-310 or 4-315 | For surgery; number 10 or 15 scalpel blade |
| 3% Hydrogen Peroxide | May be purchased from any standard pharmacy | ||
| Micro Clip | Roboz | RS-5459 | For surgery, to hold back skin |
| 00-90 stainless steel machine screw (0.0625 in. long) | Amazon Supply | B002SG89X4 | For surgery, to wrap ground wire around |
| Professional Rotary Tool | Walnut Hollow | 29637 | Hand drill for surgery, to drill holes in skull |
| Inverted Cone Burr | Roboz | RS-6282C-34 | Inverted cone burr size 34; for surgery, to drill holes in skull |
| Engraving Cutter Drill Bit | Dremel | 106 | Engraving cutter; 1.6 mm bit; for surgery, to drill holes in skull |
| C&B Metabond-Quick! Cement System "B" Quick Base | Parkell | S398 | For surgery; adhesive luting cement system; important to prevent headpiece avulsion |
| C&B Metabond-Quick! Cement System Clear L-Powder | Parkell | S399 | For surgery; adhesive luting cement system; important to prevent headpiece avulsion |
| C&B Metabond-Quick! Cement System "C" Universal TBB Catalyst 0.7 ml | Parkell | S371 | For surgery; adhesive luting cement system; important to prevent headpiece avulsion |
| C&B Metabond-Quick! Cement System Ceramic Mixing Dish with temperature strip | Parkell | S387 | For surgery; adhesive luting cement system; important to prevent headpiece avulsion |
| Swiss Tweezers, style #5 | World Precision Instruments | 504506 | For surgery |
| Puritan Cotton-Tipped Applicators | VWR International | 10806-005 | For surgery |
| Dental Caulk Grip Cement Kit | Dentsply | 675570 | For surgery; dental cement |
References
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