Whisker-signalerade frånEyeblinks Classical Conditioning i Head fixerade möss

Introduction

FrånEyeblinks konditioneringen är en form av Pavlovian konditionering och ett modellsystem för att undersöka neurala mekanismerna för associativ inlärning och minne. Det har undersökts i olika arter, inklusive människa, kaniner, katter, råttor och möss. Paradigm innebär presentation av två parade stimuli: en neutral betingad stimulus (CS, till exempel, en ton, en ljusblixt, eller morrhår stimulering), och en framträdande obetingat stimulus (US, t.ex. en luft puff för ögat, eller periorbitalt chock). USA framkallar ett obetingat, reflexiv frånEyeblinks svar (dvs UR). Till slut, efter flera presentationer av den parade CS-USA, lär motivet att associera CS med USA. Detta lärande yttrar sig i form av en betingad respons (CR), en frånEyeblinks framkallad av CS ensam som föregår presentationen av USA.

FrånEyeblinks konditionering i spår Formuläret innehåller en stimulans fritt intervall på några timmarundred millisekunder som skiljer CS och USA (Figur 1). Trace konditioneringen är en form av deklarativ lärande eftersom det kräver medvetenhet om stimulansoförutsedda ^1. Den tidsmässiga klyftan kräver att djuret att hålla ett neuralt "spår" av CS i framhjärnan regioner som hippocampus för att USA och CS att bli associerade ^1-6. Tillsammans med framhjärnan regioner, är spårkonditionering också beroende av cerebellum ^7.

FrånEyeblinks Konditioneringen är därför en användbar paradigm för undersökning av flera olika typer av minne, inklusive förvärv, konsolidering och hämtning. Under frånEyeblinks luftkonditionering, en kontrollgrupp av djur presenteras med oparade stimuli i slumpmässig ordning för att testa pseudoconditioning eller sensibiliserade svar på CS som kan orsakas av amerikanska presentation ensam snarare än en lärd CS-amerikanska föreningen.

En vanligen använd apparatus för undersökning av frånEyeblinks konditionering hos gnagare är en kammare i vilken gnagare tillåts röra sig fritt under träningsprocessen ^8-10. Med denna typ av anordning, är ett tjuder normalt fäst vid en huvudstycke som är fäst på gnagare skalle. Förankringstrossen möjliggör leverans av USA (och ibland det CS) och för överföring av djurets svar på dessa stimuli (dvs., den frånEyeblinks respons) ^10. Tjudret i sig kan modifieras baserat på den typ av stimuli levereras och hur den frånEyeblinks svaret registreras.

Anledningen till att "fritt rörliga" bundna möss för frånEyeblinks konditione är att möss kämpa mot återhållsamhet. Även andra arter kan vara mer mottagliga för återhållsamhet, är den största fördelen med att använda möss i frånEyeblinks experiment konditione att majoriteten av genetiskt modifierade mutantstammar är musstammar. Förutom att kämpa, komplett restraint av möss resulterar i akut nöd. Ett huvud-fast mus preparat som minimerar belastningen skulle öka fysiologisk information som kan erhållas under frånEyeblinks konditionering. Till exempel skulle detta system tillåter avbildning av kortikala neuron med två-foton mikroskopi ^11.

Head-fasta beredningar har använts i tidigare experiment för optisk avbildning av hjärnbarken genom flytt kraniella implantat in vivo elektrofysiologiska inspelningar av gnagare hjärnan med tetrode arrayer, två-foton kalcium avbildning, och även som en plattform för frånEyeblinks konditionering hos möss ^{11 -16.}

I huvudet fixerade systemet, är tillförlitliga stimulering och inspelningar säkerställas utan fullständig begränsning av musen (Figur 2). Ett huvudstycke som den som används i det fritt rörliga systemet är fäst till musens skalle. Under träning är huvudbonaden fäst vid en kontakt som är ansluten till barer överen cylindrisk löpband för att stabilisera gnagare huvud (Figur 2A). Den cylindriska löpband gör musen för att vila bekvämt, men om musen så önskar, kan det också att springa eller gå. Med hjälp av detta system kan möss tränas med ett morrhår vibrationer som CS och en mild periorbitalt elektriska stötar som USA (Figur 1). USA levereras genom ledningar kirurgiskt placeras under huden lateralt till ögat. CS levereras via en kam som är fäst vid en två-lagers rektangulär böjning ställdon (Figur 2B). Kammen och bock ställdon fästs sedan en magnetisk bas som flyttas till rätt position under träning och justeras för optimal leverans för varje enskilt djur. Kammen är placerad för att grensla de valda whiskers. Under leverans av CS, sänds en signal till den bockningsmanövreringsorgan som förskjuter kammen och leder till vibrationer av de whiskers ^17.

16,18,19. Anledningen morrhår stimulering väljs för CS i denna experimentella paradigm är beroende av murina djur på deras vibrissae för somatosensoriska informationsinmatning under utforskning. Morrhår stimulering har visat sig vara en pålitlig och effektiv CS ^20. Med tanke på den väletablerade och organiserade kortikala substrat vibrissae systemet (dvs. pipan cortex), morrhår stimulering som CS ger en elegant verktyg för att kartlägga kortikala förändringar och plasticitet i samband med att lära frånEyeblinks konditione ^20,21. Ett huvud-fast system möjliggör exakt stimulering av valda whiskers att jämföra svaren mellan stimulerade neuroner och neuroner som får insignaler från icke-stimulerade whiskers. Slutligen många stammar av möss uppvisar åldersrelaterad hörselnedsättning som relativt unga vuxna 16). Whisker stimulering påverkas inte av något av dessa komplikationer.

Presenteras här är unika och viktiga ändringar vid andra huvudfixerade preparat för frånEyeblinks konditionering, inklusive metoder för CS och US leverans, och förvärvet av frånEyeblinks svaret. Tillförlitligheten i denna apparat och utbildning paradigm i frånEyeblinks konditione demonstreras genom att lära kurvor från rade möss och en relativt platt inlärningskurva från pseudoconditioned kontrolldjur (Figur 7A).

Protocol

Alla procedurer som involverar möss utfördes i enlighet med protokoll som godkänts av Northwestern University Institutional Animal Care och användning kommittén baserat på riktlinjer från National Institute of Health.

1. Cylinder (Figur 2A)

1. Konstruera cylindern som beskrivits av Chettih et al. Och Heiney et al. Från en lång skumcylinder ^14-15. Skär en 10 cm längd av cylindern och borra ett hål genom centrum för att passa på en axel, en metallstång 12,7 mm (0,5 in.) I diameter. Montera cylindern med sin axel på en metall optisk skärbräda som beskrivs av Heiney et al. Eller annan support (t.ex. plexiglas) ^15.
2. Uppföra två vertikala metallstänger av 12,7 mm i diameter på vardera sidan av cylindern.
3. Fäst två rätvinkliga fästen på metallstänger.
4. Säkra två ytterligare stavar (5 cm långa, 12,7 mm i diameter) genom de rätvinkliga fästen. avfasning the ändarna av dessa stavar och nivå sina ändar ovanför centrum av cylindern (figur 2G).
5. Borra och knacka ett hål genom de planat ändarna av stavarna för att passa två 4-40 maskinskruvar som kommer att hålla vingar kontakten på plats (figur 2G).

2. Montering av Morrhår stimuleringssystemet (figur 2B)

1. Skär en 10-tand segment av kam från en vanlig hår kam.
2. Skära en slits omkring 2-3 mm bred och ca 5 mm djupt på den övre delen av kammen för att acceptera en två-lagers rektangulär böjning ställdon.
3. Löda en tråd till varje yta av bockningsmanövreringsorganet. Använda lod och flussmedel som tillhandahålls av tillverkaren. Täcka manövreringsorganet och lodet med eltejp för att skydda musen och användaren från den elektriska strömmen.
4. Slip manöverdonet remsan i slitsen skuren i kammen, så att bockningsmanövreringsorganet remsan sitter vinkelrätt mot planet för kammen. Vinkel kammen så att det lutar vid 45 ° och mer naturligt följer kurvan av musen ansikte.
5. Fästa änden av drivanordningen remsan till toppen av kammen med snabbinställning epoxi.
   Notera: Trådarna lödda på böjnings ställdonet remsan bör vara ansluten till en reostat som levererar 40 volt till ställdonet. Tidigare experiment har visat att 40 volt är effektiv för konditionering men inte framkallar några skrämma svar.
6. Placera böjningsmanövreringsorganet och kammen på ett rörligt fäste. En pipett hållare monterad på en magnetisk bas som normalt används för in vitro elektrofysiologiska riggar fungerar bra.

3. Montera Connector som monteras till Rods ovanför cylindern (figur 2C, 2E)

Obs: Kontakten är en 3-D tryckt 7-håls remsa modelleras från Amphenol 221-serien nylon band som används för tjudret av Weiss och Disterhoft och Galvez et al ^10,17.

1. Tryck på första hålet i remsan för en 0-80 x-1"Maskinskruv. Detta kommer att fungera som en låsskruv för att förankra huvudstycket till kontakten. Fäst en 0-80 mutter i huvudet av låsskruven med cyanoakrylsyra lim för att underlätta att vrida skruven för hand.
2. Lämna ett hål tomt efter det gängade hålet (för att ge utrymme för 0-80 maskin muttern) och tryck fem guldpläterade tillförlitlig-tac uttagen genom de återstående fem hålen.
3. Skala beläggningen av fem långa ledningar (trådar som erhållits från en Ethernet-kabel) och löda till ändarna av uttagen.
   Obs: De två första trådarna kommer att användas för att spela in elektromyografi (EMG) signaler som kommer att upptäcka en frånEyeblinks respons efter signalfiltrering och förstärkning från en förstärkare. Den andra två kommer att leverera chocken signal från en stimulans isolator. Den sista tråden kommer att fungera som en jordanslutning. Dessa trådar kommer att anslutas till de system som används för tidsinställd CS-US leverans.
4. Säkerställa elektrisk anslutning mellan trådarna och kontakterna med multimeter. Sätta multimeter på inställningen kontinuitet och hålla en av proberna till tappen och den andra sonden till de avskalade ändarna av kabeln. Stiften och ledningarna är elektriskt förbundna när motståndet är lågt och multimetern avger en ton.
   1. Alternativt, om multimetern inte har en kontinuitet inställning, mäta resistansen mellan stiften och ledningarna. Det finns elektrisk kontinuitet om det finns mycket lite motstånd mäts.
5. Förbered vingar kontakten från två till-220 stil transistorer. Skär av emitter, bas och kollektor kablar till transistorn och jämna ytan så att den kan fästas till kontakten.
6. Skär kanten av monteringsfliken att bryta hålet så att fliken kan glida under skruvskallen.
7. Epoxi transistorerna till kontakten. Hålet i monteringsfliken kommer att användas för att fästa kontaktdonet till stavarna ovanför cylindern.
8. Applicera epoxi till basen av trådarna protruding från uttag och låta epoxin torka. Epoxin kommer isolera och skydda anslutningarna.

4. Förbereda Headpiece (figur 2D, 2E)

Obs! Huvudbonaden remsan är en 3-D tryckt 7-håls remsa modelleras från Amphenol 221-serien nylon band som används för huvudstycket av Weiss och Disterhoft och Galvez et al ^10,17.. Detta stycke är inte längre tillverkas kommersiellt. Skrivaren filen kan laddas ner från denna tidskriftens webbplats.

1. Tryck på första hålet i remsan för en 0-80 x 1 "maskinskruv och lämna ett hål tomt efter det första hålet.
2. Tryck fem guldpläterade stift genom botten av de återstående fem hål (genom de smalare ändarna). Använd ett skruvstäd för att underlätta att trycka stiften i remsan jämnt.
3. Användning av en termisk strippa, ta bort ca 0,5 cm av polyimidbeläggning bort i slutet av en tråd av rostfritt stål (0,005 in. Diameter), löda den avskalade änden av wire till öppnandet av ett av stiften och skär tråden till 0,6-0,7 cm.
4. Remsor ca 0,2 cm från änden av kabeln för att tillåta ström att passera till djuret.
5. Upprepa steg från 4,3 till 4,4 för de återstående tre trådar.
   Obs: De två första trådarna kommer att spela EMG svar medan den andra två kommer att användas för att leverera en chock för djuret.
6. Som den sista (femte) tråd kommer att fungera som en jordledning, klippa ungefär 5 cm av obestruket tråd av rostfritt stål (0,005 in. Diameter), och lod till den återstående pin.
7. Säkerställa kontinuitet mellan trådarna och stiften med en multimeter. (I fallet med jordledningen, som är obelagd, kan multimetern sonden placeras var som helst längs tråden.)

5. Kirurgisk förberedelse (Figur 2F)

1. Sterilisera alla kirurgiska verktyg, inklusive huvudbonad. Sterilisera huvudbonaden genom att blötlägga den i alkohol och sedan skölja med steril koksaltlösning.
2. Söva musen i en induktionskammare med 3-4% vaporized isofluran blandas med en flödeshastighet av 1-2 liter syre per minut.
3. Förvissa sig om att djuret är helt bedövad med en tå nypa. Musen är helt bedövad när det inte svarar reflexmässigt till tå nypa.
4. När djuret har helt bedövad, injicera en dos av buprenorfin hydroklorid som ett smärtstillande medel (0,05-2 mg / kg, SC), raka toppen av djurets huvud, placera den på en täckt värmedyna på basen av stereotaxic ram förvissa sig om att djuret är helt bedövad och säkra huvudet på ramen. Upprätthålla flödet av förångad isofluran till djuret, att byta till 2% vid en flödeshastighet av 1-2 liter syre per minut. Använda en liten mängd av oftalmisk salva till hornhinnor.
5. Desinficera hårbotten med povidon-jod och alkohol tre tid varje, alternerande mellan de två.
6. Med ett antal 10 eller 15 skalpellblad, gör ett snitt längs mittlinjen av huvudsvålen, vilket exponerar skallbenet från framsidan av tHan ögon förbi interparietal ben (~ 1,5-2 cm).
7. Hålla tillbaka flikarna i huden med mikroklämmor. Placera ett klipp ovanför ögat, en längs mitten av rostralt-caudal axeln, och en på baksidan av skallen bilateralt (dvs använda sex clips i alla). För att förhindra huvudbonaden avulsion, exponera så mycket av skallen som möjligt, inklusive sidorna och tillbaka. Detta kommer att öka ytarean för tillämpningen av den adhesiva cementering cement.
8. Med användning av skalpell, skrapa längs toppen av skallen för att avlägsna periosteum och garantera en ren och torr arbetsyta. Rengör toppen av skallen med 3% väteperoxid tre gånger.
9. Borra två hål i skallen med en storlek 34 inverterad kon burr eller en 1,6 mm gravyr fräs borr för att ta emot 00-90 skruvar (0,0625 in. Lång). Skruvarna kommer att ge den elektriska jordanslutningen. Placera ett hål framför Bregma, och den andra framför Lambda, till vänster om mittlinjen när konditionering av right ögat. Placera en skruv i varje hål. Sänk skruven 0,28 mm i skallen för varje helt varv; två hela varv är tillräckligt.
10. Skapa flera små divots på ungefär 0,75 mm i diameter på skallen för att öka ytarean och greppstyrka för cement.
11. Ta den färdiga headpiece och linda jordledningen i en åtta konfiguration runt de två skruvarna. Låt några slack (~ 1,5 cm mellan huvudstycket och skruven) i jordledningen så att huvudbonaden kan placeras korrekt senare.
    Obs: Figuren åtta säkerställer vanligtvis en god elektrisk förbindelse mellan tråden och jordskruvarna. Tråden kan också lödas till skruven för att säkerställa en elektrisk förbindelse.
12. Applicera limmet cementering cement. Följ tillverkarens instruktioner för att blanda limmet cementering cement eller blanda 4 skopor av L-pulverblandning, 8 droppar basen, och 2 droppar av katalysatorn i en kall keramisk blandningsskål (se temperaturremsan on blandnings skålen är helt svart.) Den kalla temperatur förlänger arbetstiden för cement.
    1. Coat skallen och skruvarna villigt med cementering cement och tillåta cement att torka. Detta tar bara några minuter.
13. Efter det att cementen har torkat, placera headpiece vertikalt, med stiften står upp, ovanför skallen. Hålla huvudstycket på plats med en hållare som liknar kontaktdonet
    Obs: Se "3. Montera Connector" -Den innehavaren behöver bara vara en fem-hål remsa med guldpläterade socklar för att få stiften i huvudbonaden. Hållaren är fäst vid en arm på stereotaktisk ram. Användningen av hållaren och armen underlättar positionering av huvudstycket och ledningarna.
14. Efter att huvudbonaden har placerats, skära ner huden runt periorbitalt område och placera de två stöttrådarna att låta 0,2 cm avskalade änden för att vila under huden och ca 2-4 mm direkt caudal till eye. Tillåter inte ändarna av de två ledningarna för att vidröra varandra. Placera de två EMG ledningar på muscularis orbikularis okuli ovanför ögonhålan.
    1. Om nödvändigt, skära av ändarna av trådarna, om de är för långa och verkar som om de kan direkt repa omloppsbana och resultera i infektion. Om skära av ändarna av kabeln, se till att det finns tillräckligt med metalltråd exponeras. Alternativt, om trådarna verkar alltför länge, böja tråden tillbaka på basen, där de sträcker sig ut från huvudbonaden.
    2. Cement basen av trådarna (dvs., i slutet nära huvudstycke) på plats på skallen med en liten spridning av den adhesiva cementering cement och låt torka (använd halv av den del som beskrivits tidigare).
15. Ta bort mikro klipp och försiktigt vika flikarna i huden tillbaka över cement. Låt huden att lösa naturligt att undvika spänningar på någon del av huden för att undvika en snedvridning av ögonlocket, förhindrande av frånEyeblinks svaroch lidande för djuret.
16. Täta exponerade området med tandcement, som täcker allt från snittade huden till kanten av toppen av headpiece med cement. Var extra noga med att undvika droppande cement på ögonen eller stiften i huvudbonaden. Delvis härdade cement kan jämnas och manipuleras med en bomullspinne som fuktats med dentala cement lösningsmedel. Låt cementen torka helt innan du tar bort huvudbonaden hållaren.
17. Låt djuret att återhämta sig från anestesi på en uppvärmd yta innan du byter djuret tillbaka i sin bur. Administrera Metacam (1 mg / kg, SQ) och sedan placera djuret tillbaka i sin bur.
18. Låt djuret 5-7 dagars återhämtning före testning eller utbildning. Behåll standardpostoperativ vård till djuret enligt institutionens riktlinjer. bör kontrolleras djuren minst en gång per dag efter det har återhämtat sig från operationen. Håll utkik efter tecken på dålig kost och / eller dricka och håglös beteende. Om smärtanmisstänks ge Metacam varje 24 h (samma dos som vid slutet av post-kirurgi) till dess att lindras. Lidokain kan lokalt appliceras på såret om djuret kliar eller visar tecken på obehag.

6. Placera musen på cylindern och utbildning (figur 2G)

1. Att placera musen på cylindern, hålla musen med en hand kort genom att hålla honom i stjärten med en hand och sedan ta tag i musen bakom skuldrorna med pekfingret och tummen med den andra. Wrap resterande fingrarna runt musens buk och bålen.
2. Med handen inte hållande musen, anslut kontakten till huvudbonaden på musens huvud och vrid låsskruven.
3. Placera musen försiktigt på cylindern och hålla den på plats medan fästa kontakten i ramen. Använd de två skruvarna för att fästa kontakten till barerna ovanför cylindern.
4. När kontaktdonet har säkrats till cylinderramen, release last på musen. Ge musen en dag av två sessioner tillvänjning till cylindern. Låt varje tillvänjning session samma varaktighet som varje konditionering session.
   1. Rekord spontan blinkhastighet under tillvänjning och pre-utsätta mössen till whisker vibrations CS för att minimera förekomsten av skrämselsvar. Applicera CS som under en verklig konditione session, men utan elektrisk stöt USA.
   2. Applicera whisker stimulering CS genom att placera Piezo systemet nära (ca 0,5 cm) till det konditionerade sidan (den högra sidan) av musen, medan glider tänderna hos kammen över enskilda whiskers. Se till att samma whiskers stimuleras dag till dag genom att placera Piezo-systemet i samma läge från dag till dag.
5. Börja träna musen på klassisk betingning. Leverera två sessioner träning per dag under fem dagar. Lämna cirka två timmar mellan varje träningspass.
   1. Till rade gruppen, deliver trettio försök per session av en 250 ms lång morrhår vibrationer CS (60 Hz) paras med en 100 ms lång elektrisk puls USA (0,3 mA - 3 mA, som levereras från en WPI A385R stimulans isolator). Separera CS och USA med en 250 ms lång stimulans fritt svepintervallet för att göra arbetet beroende på hippocampus (figur 1) ^23.
   2. Justera intensiteten av den elektriska stötar för varje djur så att en blinkning framkallas. Separata försök med ett slumpmässigt intertrial intervall på 30-60 sekunder (genomsnitt 45 sekunder, total varaktighet på 30 minuter per session.)
   3. Leverera trettio oparade CS ensam och oss ensamma försök vardera (för totalt sextio försök) till pseudoconditioned grupp med samma stimulans parametrar som anges för den konditionerade gruppen. Se till att CS ensam och oss ensamma försök pseudorandomized så att ingen stimulans presenteras mer än två gånger i rad. Separera varje försök med en genomsnittlig intertrial intervall på 22,5 sekunder.
6. deleverbakgrundsljud på 65 dB under tillvänjning och utbildning för att maskera varje ljud av vibrationer som genereras av morrhår stimulatorn.

Representative Results

8-10 veckor gamla manliga C57BL6 / J-möss tränades på spår frånEyeblinks konditioneringen på huvudet fixerade cylindrisk löpband apparat. 8 möss tränades med parade CS-amerikanska presentationer (rade grupp) och 9 möss tränade med oparade CS och US presentationer (pseudoconditioned grupp).

Exempel EMG inspelningar av ett konditionerat svar från en betingad mus visas i figurerna 3 och 4. EMG inspelningar för varje försök var rättas och integreras med en 10 ms tidskonstant. Figur 5 visar den likriktade och integrerade EMG svar spår i genomsnitt över alla försök för var och en av 10 sessioner för både en betingad (A) och en pseudoconditioned (B) mus. Utvecklingen av konditionerade svar kan ses i figur 5A, med responser blir större närmare uppkomsten av USA. Denna utveckling är inte sett in pseudoconditioned svar i figur 5B.

Utvecklingen av läglig, och därmed väl lärt rade svar kan också ses i figur 6. Figur 6 visar histogram av tiden till toppen av svaret efter CS debut. Det finns en initial topp i diagrammet mellan 0 - 150 ms efter CS debut. Denna första topp kan ses så tidigt som i session 1. Med fler träningspass, det är utvecklingen av en andra topp i diagrammet mellan 400-500 ms bland konditionerade djur, som anger utvecklingen av bättre tidsinställda rade svar.

Figur 7A visar de genomsnittliga procent adaptiva rade svar som spelats in från betingade och pseudoconditioned möss. Adaptiva rade responser anses ha signifikant aktivitet som är närvarande åtminstone 20 ms befmalm amerikanska debut (dvs åtminstone fyra SD större än den genomsnittliga aktiviteten närvarande 250 msek före CS debut). Under träningen, rade möss visade gradvis inlärning av konditione paradigm genom att uppvisa mer betingade adaptiva svar med varje träningspass så att konditionerat möss uppvisade signifikant fler adaptiva rade svar än pseudoconditioned möss (grupper, F _(1,15) = 20,62, p <.0005, sessioner, F _(1,9) = 9,987, p <0,0001, grupper * sessioner, F _(1,9) = 5,977, p <0,0001). Observera att pseudoconditioned gruppen typiskt uppvisade pseudo CR på mindre än 20% av försöken.

Figur 7B visar den genomsnittliga betingad respons område (området under kurvan för den likriktade och integrerade EMG svar) för både konditionerade och pseudoconditioned möss över tio träningspass. Planerade jämförelser med en upprepade mätningar ANOVA över last fyra sessioner (dvs., sessioner 7-10, när det konditionerade gruppen hade nått en inlärnings kriteriet 60% CR) visar en signifikant huvudeffekt av grupp, vilket indikerar att CR området var större i det konditionerade gruppen än i pseudoconditioned grupp inlägget lärande kriterium (grupper, F _(1,14) = 5,733, p <0,05, session, F _(1,3) = 0,486, NS, grupper * session, F _(1,3) = 0,432, ns).

Figur 7C visar i genomsnitt procent alfa (skrämma) svar som spelats in från de konditionerade och pseudoconditioned möss. Alpha svar är aktiviteten inom 50 ms CS debut som var åtminstone 4SD över medelvärdet baslinjen aktivitet. Under träningen, rade och pseudoconditioned möss typiskt uppvisade alfa svar på mindre än 25% av försöken, med inga signifikanta skillnader mellan betingade och pseudoconditioned möss (grupper, F _(1,15) = 2,502, NS). the upprepade mätningar ANOVA gjorde dock avslöja en signifikant interaktion grupper och sessioner på grund av minskningen i pseudoconditioned svaren och upprätthållandet av alfa svar på ca 25% för konditionerat möss (grupper * sessioner, F _(1,9) = 2,074, p <0,05). Ökningen av alfa svar under sessionen 10 beror sannolikt på den korta debut latens av välutvecklade CR.

Figur 7D visar den genomsnittliga procent kort latens reaktion registreras från båda grupperna av möss. Korta latens svar reflekterade aktivitet mellan 50-70 ms efter CS debut som var 4SD över medelvärdet baslinjen aktivitet. A upprepade mätningar ANOVA visade att konditionerade djur uppvisade mer korta latency svar än pseudoconditioned djur under de tio träningspass (grupper, F _(1,15) = 5,377, p <0,05, session, F _(1,9) = 3,920, p <.0005, grupper * session, F _(1,9) = 3,158, p <0,005). Thans kan återspegla en tidigare tillslagstiden för CR, som rade gruppen uppvisade större CR med varje träningspass.

Figur 1:. Trace frånEyeblinks Conditioning Paradigm i spår frånEyeblinks luftkonditionering, en ofarlig betingad stimulus (CS) är ihopkopplad med en milt skadligt obetingat stimulus (US) avsedda att framkalla en frånEyeblinks svar. CS och US skiljs åt av en stimulus-fri tidsgapet, vilket gör paradigm hippocampus-beroende ^23. I paradigm som beskrivs här, är en 250 ms lång morrhår vibrationer CS parat med en 100 ms lång periorbitalt chock USA. CS och US skiljs åt av en 250 ms lång tidsgapet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 2:. Chefen fixerade Framställning A, Huvudet fixerade set-up för frånEyeblinks konditionering med cylindern, morrhår stimulatorn, och kontakten indikerade B, Den morrhår stimulator med två lager bock ställdon och kamma anges.. C, kontakten med de enskilda delarna som anges: låsskruv, 7-håls band, kablar lödda till uttagen och epoxi för att bevara trådarna, vingarna omvandlas från en stil transistor D TO-220, huvudstycket med den enskilde. delar som anges: den 7-håls remsa, stiften, och ledningarna lödda in stiften, inklusive den obelagda rostfritt stål jordledning, och den individuella chock och EMG rostfria ståltrådar, med 0,2 cm av polyimidbeläggning avskalade av änden E. , konfigurationen för varje hål i 7-håls remsa för både kontaktdonet ochhuvudbonaden. F, en mus med en inopererad huvudbonaden. G, En mus placeras på cylindern, redo att utbildas. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3:. Exempel EMG inspelning De blå linjerna avgränsa CS presentation (250 ms lång). De röda linjerna beskriva den amerikanska presentation, som visar artefakt som kommer från elektriska stötar (100 ms). CS och US skiljs åt av en 250-ms stimulus-fritt intervall. Inom denna stimulans fritt intervall är högre amplitud EMG-aktivitet (i förhållande till baslinjen) som avgränsar en CR. Klicka här för att se en större version av denna siffra. </ A>

Figur 4:. Exempel EMG och motsvarande optiska infraröda reflektion inspelningar EMG inspelning är lika noggrann som den optiska IR-fotocell vid detektering konditionerat svar debut (blå linje), latens till svar topp (röd linje) och obetingat frånEyeblinks svar debut ( rosa linje). klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 5:. Averaged frånEyeblinks Spår medelvärdes likriktade och integrerade spår av frånEyeblinks respons för en rade mus (A) och en pseudoconditioned mus (B). Varje spår representerar medelvärdetsvar på musen för alla prövningar under en enda session. Den blå delen representerar svaret under morrhår vibrationer CS presentation. Den röda delen representerar svaret under stimulus fria svepintervallet. I A, chocken USA inducerade en artefakt som är närvarande under den mörkgrå området efter svepintervallet. B visar svaren på morrhår endast vibration CS. Framläggande av CS ensam och oss ensamma försök var pseudorandomized i pseudoconditioning. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Fig. 6: histogram av svars Peak Times histogram av tiden till svarstoppen för alla rade (n = 8, blå staplar) och 8 pseudoconditioned (röda staplar) djur för alla trIALS över alla sessioner (data från en pseudoconditioned mus uteslöts för att tillåta en direkt jämförelse av antalet svar mellan grupperna). Lila staplar indikerar där konditionerade och pseudoconditioned djur överlappar varandra. Response högtrafik beräknas som tiden för den största toppen av den likriktade och integrerade EMG inspelning mellan CS och US debut. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 7: responskurvor av rade djur (n = 8; blå kurvor) och pseudoconditioned djur (n = 9; röda kurvor). A, Procent Averaged Adaptive Konditionerade svar (± SEM) för rade och pseudoconditioned djur över 10 träningspass. B genomsnitt område (± SEM) av CR för konditionoch pseudoconditioned djur över 10 träningspass. C, Percent Averaged Alpha Response (± SEM) för rade och pseudoconditioned djur över 10 träningspass. D, Procent Averaged Kort Latens svar (± SEM) för konditionerat och pseudoconditioned över 10 sessioner. Klicka här att se en större version av denna siffra.

Discussion

Klassisk frånEyeblinks konditioneringen är en form av associativ inlärning som är ett användbart verktyg för att förstå de neurala substrat underliggande inlärning och minne. Tidigare metoder som används för frånEyeblinks konditionering hos gnagare såsom möss involverade en kammare som tillät för djuret att röra sig fritt. Ett huvud-fast beredning för frånEyeblinks konditioneringen i möss med användning av anordningen som beskrivs av Chettih et Heiney et al. Och senast utnyttjade al. Och i ljuset-framkallade spår frånEyeblinks konditioneringen i Siegel et al. Erbjuder flera fördelar, såsom att låta för vissa förfaranden och experiment som ska utföras under frånEyeblinks konditione som inte hade varit möjligt eller hade begränsats i det förflutna (t.ex. in vivo två photon kalcium imaging) ^14-16. Denna typ av preparat underlättar också användningen av andra tekniker, såsom in vivo elektrofysiologi med tetrode matriser. Som möss tycks bli Distressed ur fixeringen, var detta huvud fixerade preparat utvecklade för att hålla huvudena säkra samtidigt som mängden av fasthållning krävs. Även om detta preparat tillåter möss att pendla på en cylindrisk löpband, andra har också framgångsrikt samlat beteendedata från huvud fixerade möss på en stabil plattform ^24.

Det finns emellertid vissa problem som uppstår med användningen av huvudet fixerade cylindersystem. En oro är att när man först placerar en otränad musen på cylindern, kan det behöva lite tid att lära sig att vila, gå eller springa på den nya apparaten. De flesta möss lär sig snabbt att vila, gå eller springa på cylindern bekvämt. Två tillvänjningssessioner bidra till att vänja mössen till cylindern och i mitten av den andra sessionen, de flesta möss är bekväm på cylindern. Ett annat bekymmer som uppstår är huvudbonaden avulsion. Det har förekommit en del problem med detta tidigare under flera dag träningspass, men användningen av limmet cementering cement har förbättras problem med huvudbonaden avulsion. Användningen av den adhesiva cementering cement har lett till 0% headpiece avulsions från mer än 50 operationer, eftersom användning av denna teknik. Med korrekt användning och tillräcklig spridning av cement på kraniet, bör forskare möter inga problem med huvudstycke avulsion. Slutligen, genom att presentera CS under tillvänjningssessioner, kan det finnas en viss oro latent inhibition. Det är dock klart att mössen rade framgångsrikt (se figur 7). Notera att intensiteten hos den whisker vibration kan modifieras genom att ändra mängden av spänning som passeras av reostaten. Om mössen inte kan lära sig, kan ökas spänningen för att stödja framgångsrika konditionering samtidigt minimerar skrämma svar. Forskare kan också ändra typen av elektriska stötar USA som levereras till djuret. Den elektriska stötar USA kan vara en enda elektrisk puls varar 100 msek som redovisas här. Alternativt, som the stimulans isolator som används i detta protokoll kan överföra bifasiska pulser, kan forskarna också använda 120 Hz 6 bifasiska pulsparen på 1 ms per puls för en effektiv elektrisk stöt oss.

Boele et al. Indikerade sannolikheten för att vissa "rade svar" kan uppstå från spritta (alfa) svar på CS eller korta latency svar (SLR) ^25. Alfa svar anses vara förslutningar snabba ögonlocket inom en 50 ms fördröjning efter CS debut. Möss ofta hålla sina slutna ögon under hela rättegången, efter denna alfa svar. Systemkameror, å andra sidan, har en latens på 50-70 msek från CS debut och vanligtvis uppstår efter bara några CS-amerikanska ligaspel. Den korta latensen till uppkomsten av både alfa- och spegelreflexkameror och det faktum att systemkameror kan uppstå efter bara några CS-USA ihopkopplingar indikerar att de sannolikt inte är drivna av den hippocampala-cerebellär kretsar. Dessa granskas av Boele et al observationer. Thärför tigga frågan om CR inspelade här är inlärda svar. Såsom figur 7C och 7D visar, varken alfa responser eller SLRs står för en majoritet av de CR inspelade, vilket tyder på att de adaptiva CR förmedlas av framhjärnan och cerebellum. Histogrammen i figur 6 som visar latens till toppen av frånEyeblinks svar efter CS debut visar också att medan vissa analyser kan omfatta en tidig debut alfa- eller kort latens svar med fler träningsförsök, faktiskt inträffar toppen av frånEyeblinks svaret senare och närmare starten av USA, som anger utvecklingen av vältajmade betingade svar. Som tidigare nämnts, var morrhår stimulering och chock intensitet dämpas till en nivå som inte var uppseendeväckande eller alltför obehaglig, men förblev effektivt på att producera adaptiva rade svar. Slutligen, såsom Figur 7B visar, storleken på CR (mätt som arean underkurva i den likriktade och integrerad reaktion, såsom i figur 5) är större i det konditionerade gruppen än i pseudoconditioned gruppen gång det konditionerade gruppen nådde en inlärningskriterium 60%, vilket innebär att dessa svar kräva flera sessioner för att lära sig, till skillnad från spegelreflexkameror och alfa svar.

Boele et al. Påpekade också att EMG mätningar, medan en noggrann metod för blinkar upptäckt i större djur såsom kaniner, är inte så praktiskt i små gnagare såsom möss ^25. De rekommenderar användning av den magnetiska avståndsmätningsteknik (MDMT) för att undvika upptäckt av falska positiva signaler som EMG inspelning kan tyda. Den MDMT teknik, medan imponerande i sin känslighet och kvalitet glimten upptäckten, presenterar också nackdelen av att behöva söva djuret varje dag av utbildning för att fästa chipset ^26. Detta i sig kan förväxla inlärningshastigheter. Vi finner att EMG signalerregistreras med de förfaranden som beskrivs här är lätt erhållas, med hög tidsupplösning, pålitlig och relativt lätt att mäta och analysera.

Figur 4 visar en representativ EMG signaldetekterande blinkar med en motsvarande signal från en infraröd reflekterande optisk sensor placerad nära musens ögat under träning. Det finns ett tydligt samband i glimten upptäckten mellan EMG-signalen och den optiska sensorn, betecknar riktigheten i blinkdetektering med hjälp av EMG inspelningar. En fördel med EMG inspelningar är att det möjliggör för den största tidsupplösning. Även om upplösningen bryts ned genom att integrera över en 10 ms tidskonstant, kan en även analysera rå EMG-data för att detektera ögonblinknings aktivitet. Spike räkna är en parameter som kan användas för att detektera CR ^18. En nackdel med EMG inspelningar är att signalerna utan tvekan kommer att förorenas av elektriska artefakt som kommer från elektriska stötar USA (se svar, det vill säga de som uppstår före uppkomsten av USA. En annan nackdel i att använda EMG inspelningar är att, med hjälp av nuvarande kriteriet för CR detektering, kan en bullrig baslinjen dölja vad som annars skulle ha upptäckts som en CR.

Huvudet fixerade preparat som beskrivs här liknar den som presenteras av Heiney et al. ¹⁵ Det finns dock vissa viktiga skillnader från sin eleganta systemet. Till exempel, beskrivs metoden här för inspelning frånEyeblinks responser är ledningar placerade subdermalt ovanför ögat för att spela in EMG-aktivitet. Denna teknik gör det möjligt för pålitliga och stabila inspelningar av ögonlocks aktivitet och därmed av frånEyeblinks svaret. Korrekt placering och fixering av dessa trådar säkerställer kvalitet inspelningar som varar under minst två veckor, varaktighet av experimentet. En fördel med att använda EMG trådar i stället för en högväxlad kamera som används av Heiney et al. är att EMG inspelningar har extremt hög tidsupplösning, och kräver inte den dagliga positioneringen och kalibrering som en kamera kräver ^15. Kameran har dock erbjuda direkt visuell bestämning av ögonlocks stängning.

En annan skillnad mellan de två systemen är metoden för CS leverans. Denna speciella huvud fixerade mus beredning utnyttjar whisker stimulering som betingat stimulus. Resultaten visar att möss kan rade effektivt med morrhår stimulering som CS, precis som huvudfixerade kaniner kan konditioneras med morrhår vibrationer ^27. Heiney et al. Visade stimulering av morrhår dynan som en effektiv CS genom att rikta en svag puff av luft till whisker dynan ^15. Även om båda teknikerna påvisar effektiv konditionering, placera en kam över utvalda whiskers och vibrerande kammen medger förmågan att stimulera enskilda whisker rader eller ens enskilda whiskers. Denna teknik har använts i tidigare studier för att göra det möjligt för djuren att fungera som sin egen kontroll (dvs var stimulerade morrhår rad jämfört med en rad av ostimulerade whiskers) ^20.

Sammanfattningsvis, ett huvud-fast beredning för morrhår-signal frånEyeblinks konditione möjliggör en säker hjärn plattform för att utföra avancerade tekniker och experiment som tidigare varit omöjligt eller svårt att utföra. Mild whisker stimulering användes som betingat stimulus och en mild elektrisk chock användes som obetingat stimulus. FrånEyeblinks svar registrerades med kablar placerade subdermalt bakom ögonlocket. Pålitlig lärande visades i möss med direkt stimulering av utvalda whiskers som CS och periorbitalt elektriska stötar som USA, och ingen inlärnings var uppenbar i möss som fick slump presentationer av CS och USA. EMG inspelningar som en pålitlig och reldevis enkel metod för att spela in frånEyeblinks svaren och observera hur svaren förändrats över utbildningar.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Exervo TeraNova Foam Roller 36" x 6"	Amazon	B002ONUM0E	For cylinder
Plexiglas			Custom-made; 1 cm thick
Metal Rods (12.7 mm diameter)			Custom-made
4-40 machine screw (.25 in. long)	Amazon Supply	B00F33Q8QO	For cylinder
Classic Design Hair Comb	Conair	93505WG-320	For whisker stimulation
2-Layer Rectangular Bending Actuator	Piezo Systems	T220-A4-303X	For whisker stimulation
Solder and Flux Kit	Piezo Systems	MSF-003-NI	For whisker stimulation
Magnetic Base	Thor Labs	MB175	For whisker stimulation
Threaded rod for magnetic base			Custom-made
Strips based on 221 series nylon strip connectors from Electronic Connector Corp.			Custom-made, based on Weiss and Disterhoft, 2008
TO-220 Style Transistor	Amazon Supply	B0002ZPZYO	For connector; for the wings
Relia-Tac Sockets	Electronic Connector Corp.	220-S02	For connector
Relia-Tac Pins	Electronic Connector Corp.	220-P02	For headpiece
0-80 stainless steel machine screw (1 in. long)	Amazon Supply	B000FN68EE	Locking Screw
0-80 stainless steel machine screw hex nut (5/32 in. thick)	Amazon Supply	B000N2TK7Y	Locking Screw Head
Loctite Super Glue-Liquid	Loctite	1365896	Cyanoacrylic glue; for the locking screw
Quick Setting Epoxy	Ace Hardware	18613	For connector and whisker stimulation system
Ethernet Cable Wires			Ethernet cable can be taken apart to use the individual wires for the connector
Polyimide coated stainless steel wires (2 in. long, .005 in. diameter)	PlasticsOne	005sw/2.0 37365 S-S	For headpiece, EMG and shock wires
Stainless steel uncoated wire (.005 in. diameter)	AM Systems	792800	For headpiece, ground wires
Tenma Variable Autotransformer	Tenma	72-110	For the whisker stimulation; rheostat to adjust current to the bending actuator
Amplifier	A-M Systems	1700	Amplifier for filtering and amplifying EMG signals
WPI A385R stimulus isolator	World Precision Instruments	31405	For the electrical shock
Isothesia (Isoflurane)	Henry Schein: Animal Health	50031	For surgery; anesthesia
Buprenex Injectable CIII	Reckett Benckiser Pharmaceuticals Inc	NDC 12496-0757-1	For surgery; analgesic
Akwa Tears: Lubricant Ophthalmic Ointment	Akorn	NDC 17478-062-35	Artificial tear ointment to prevent dry eyes while under anesthesia
Povidine-Iodine Prep Pads	PDI	NDC 10819-3883-1	For surgery; antiseptic
Alcohol Prep Pads			May be purchased from any standard pharmacy
Stainless steel surgical scalpel handles (no.3)	Integra Miltex	4-7.	For surgery
Stainless steel surgical scalpel blades	Integra Miltex	4-310 or 4-315	For surgery; number 10 or 15 scalpel blade
3% Hydrogen Peroxide			May be purchased from any standard pharmacy
Micro Clip	Roboz	RS-5459	For surgery, to hold back skin
00-90 stainless steel machine screw (0.0625 in. long)	Amazon Supply	B002SG89X4	For surgery, to wrap ground wire around
Professional Rotary Tool	Walnut Hollow	29637	Hand drill for surgery, to drill holes in skull
Inverted Cone Burr	Roboz	RS-6282C-34	Inverted cone burr size 34; for surgery, to drill holes in skull
Engraving Cutter Drill Bit	Dremel	106	Engraving cutter; 1.6 mm bit; for surgery, to drill holes in skull
C&B Metabond-Quick! Cement System "B" Quick Base	Parkell	S398	For surgery; adhesive luting cement system; important to prevent headpiece avulsion
C&B Metabond-Quick! Cement System Clear L-Powder	Parkell	S399	For surgery; adhesive luting cement system; important to prevent headpiece avulsion
C&B Metabond-Quick! Cement System "C" Universal TBB Catalyst 0.7 ml	Parkell	S371	For surgery; adhesive luting cement system; important to prevent headpiece avulsion
C&B Metabond-Quick! Cement System Ceramic Mixing Dish with temperature strip	Parkell	S387	For surgery; adhesive luting cement system; important to prevent headpiece avulsion
Swiss Tweezers, style #5	World Precision Instruments	504506	For surgery
Puritan Cotton-Tipped Applicators	VWR International	10806-005	For surgery
Dental Caulk Grip Cement Kit	Dentsply	675570	For surgery; dental cement