Introduction
Blink med øjet condition er en form for pavlovsk condition og et modelsystem til undersøgelse de neurale mekanismer for associativ indlæring og hukommelse. Det er blevet undersøgt i forskellige arter, herunder mennesker, kaniner, katte, rotter og mus. Paradigmet indebærer præsentationen af to parrede stimuli: en neutral konditioneret stimulus (CS, fx en tone, et lysglimt, eller trikit stimulation), og en anselig ubetinget stimulus (US; fx en luft pust til øjet, eller periorbitalt shock). USA fremkalder et ubetinget, refleksiv blink med øjet respons (dvs. UR). Til sidst, efter flere præsentationer af den parrede CS-USA, emnet lærer at associere CS med USA. Denne læring manifesterer sig i form af en betinget respons (CR), en blink med øjet fremkaldt af CS alene, der går forud for præsentationen af USA.
Blink med øjet condition i spor formularen indeholder en stimulus-interval på et par timerundred millisekunder der adskiller KS og USA (figur 1). Trace condition er en form for deklarativ læring, da det kræver kendskab til de stimulerende uforudsete 1. Den tidsmæssige mellemrum kræver dyret til at holde et neuralt "spor" af CS i forhjernen regioner som hippocampus, for USA og CS til at blive associeret 1-6. Sammen med forhjernen regioner, trace conditioning er også afhængig af cerebellum 7.
Blink med øjet condition er derfor et nyttigt paradigme for undersøgelsen af de mange facetter af hukommelse, herunder erhvervelse, konsolidering, og genfinding. Under blink med øjet condition, er en kontrolgruppe af dyr præsenteret med uparrede stimuli i vilkårlig rækkefølge at teste for pseudoconditioning eller sensibiliserede reaktioner på CS, der kan være forårsaget af amerikanske præsentation alene snarere end en lærd CS-amerikanske forening.
En almindeligt anvendt apparatus for undersøgelsen af blink med øjet condition i gnavere er et kammer, hvor gnavere får lov til at bevæge sig frit under uddannelsen processen 8-10. Med denne type apparat, er en forankring normalt fastgjort til en hovedstykke, der er fastgjort til gnaver kranium. Tøjret muliggør levering af USA (og undertiden CS) og til transmission af dyrets reaktion på disse stimuli (dvs. blink med øjet respons) 10. Tøjret selv kan ændres på basis af typen af stimuli leveret og hvordan registreres den blink med øjet respons.
Grunden til at bruge "frit-bevægelige" tøjrede mus for blink med øjet condition er, at mus kæmpe mod tilbageholdenhed. Skønt andre arter kan være mere modtagelige for tilbageholdenhed, den største fordel ved anvendelse af mus i blink med øjet conditioning eksperimenter er, at størstedelen af tilgængelige genetisk modificerede mutantstammer er musestammer. Ud over at kæmper, komplet restraint af mus resulterer i akut nød. Et hoved-fast mus forberedelse, der minimerer stress vil øge den fysiologiske oplysninger, der kan opnås i løbet af blink med øjet condition. For eksempel vil dette system muliggøre billeddannelse af kortikale neuroner med 2-foton mikroskopi 11.
Head-fikserede præparater er blevet anvendt i tidligere eksperimenter til optisk billeddannelse af cortex gennem aftagelige kraniale implantater, in vivo elektrofysiologiske optagelser af gnaverhjerner med tetrode arrays, to-foton calcium imaging, og også som en platform for blink med øjet konditionering i mus 11 -16.
I hovedet-fikserede system er pålideligt stimulering og optagelser sikres uden fuldstændig fastholdelse af musen (figur 2). En hovedstykket, som blev brugt i det frit bevægelige system er fastgjort til musens kranium. Under træningen er medaljon fastgjort til et stik, der er knyttet til barer ien cylindrisk løbebånd for at stabilisere den gnaver hoved (figur 2A). Den cylindriske løbebånd tillader musen til at hvile behageligt, men hvis musen ønsker det, også gør det muligt at køre eller gå. Med brugen af dette system, kan mus trænes med en knurhår vibrationer CS og en mild periorbital elektrisk stød som USA (figur 1). USA leveres gennem ledninger kirurgisk anbragt under huden lateralt i forhold til øjet. CS leveres via en kam, der er fastgjort til et 2-lags rektangulær bøjning aktuator (figur 2B). Kammen og bøjning aktuator derpå fastgjort til en magnetisk base, der bevæges til den korrekte position under træning og justeres til optimal levering for hvert enkelt dyr. Kammen er positioneret til at skræve de valgte knurhår. Under afgivelse af CS, sendes et signal til den bøjning aktuator, som forskyder kammen og fører til vibration af whiskers 17.
16,18,19. Årsagen bakkenbart stimulation er valgt til CS i denne eksperimentelle paradigme er afhængigheden af murine dyr på deres vibrissae for somatosensoriske information input under udforskning. Whisker stimulation har vist sig at være en pålidelig og effektiv CS 20. På grund af den veletablerede og organiserede kortikale substrat vibrissae systemet (dvs. tønden cortex), knurhår stimulation som CS giver et elegant værktøj til kortlægning kortikale ændringer og plasticitet er forbundet med at lære blink med øjet condition 20,21. Et hoved-fast system giver mulighed for præcis stimulering af udvalgte whiskers at sammenligne svar mellem stimuleret neuroner og neuroner, der modtager input fra ikke-stimulerede knurhår. Endelig er mange stammer af mus udviser aldersrelateret høretab som relativt unge voksne
Præsenteret her er unikke og vigtige ændringer upon andre hoved-faste præparater til blink med øjet condition, herunder metoder til CS og amerikanske levering og erhvervelse af blink med øjet respons. Pålideligheden af dette apparat og uddannelse paradigme i blink med øjet condition demonstreres ved at lære kurver fra aircondition mus og en forholdsvis flad indlæringskurve fra pseudoconditioned kontroldyr (Figur 7A).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedurer, der involverer mus blev udført i overensstemmelse med protokoller, der er godkendt af Northwestern Universitys Institutional Animal Care og brug Udvalg baseret på retningslinjer fra National Institute of Health.
1. Cylinder (figur 2A)
- Konstruer cylinderen som beskrevet af Chettih et al. Og Heiney et al. Fra en lang skum cylinder 14-15. Skær en 10 cm længde af cylinderen og bore et hul gennem centrum, så det passer akslen, en metalstang 12,7 mm (0,5 in.) I diameter. Monter cylinder med sin aksel på en metal optisk breadboard som beskrevet af Heiney et al. Eller en anden støtte (f.eks, plexiglas) 15.
- Opretstående to lodrette metalstænger på 12,7 mm i diameter på hver side af cylinderen.
- Fastgør to retvinklede mounts på metal stænger.
- Fastgør yderligere to stænger (5 cm lange, 12,7 mm i diameter) gennem de retvinklede mounts. facet the ender af disse stænger og niveau deres ender over midten af cylinderen (figur 2G).
- Bor og tryk et hul gennem den jævnet med jorden enderne af stængerne til at passe to 4-40 maskinskruer, der vil holde vingerne af stikket på plads (figur 2G).
2. Montering af Whisker Stimulation System (figur 2B)
- Skær 10 tand segment af kammen fra en regelmæssig hår kam.
- Skær en spalte omkring 2-3 mm bred og omkring 5 mm dyb på den øverste del af kammen til at acceptere en 2-lags rektangulær bøjning aktuator.
- Lod en ledning til hver overflade af bøjning aktuatoren. Brug lodde og flux leveres af producenten. Dæk aktuator og lodde med tape for at beskytte musen og bruger fra den elektriske strøm.
- Slip aktuatoren strimlen ind i slidsen skæres i kammen, således at bøjning aktuatoren strimlen sidder vinkelret på planet af kammen. Vinkel kammen så den vippes ved 45 ° og mere naturligt følger kurven for musens ansigt.
- Fastgør ende af aktuatoren strimmel til toppen af kammen med quick-indstilling epoxy.
Bemærk: Ledningerne loddet til bøjning aktuatoren strimmel skal tilsluttes en rheostat, der leverer 40 volt til aktuatoren. Tidligere forsøg har vist, at 40 volt er effektiv til konditionering men ikke fremkalder nogen forskrækkelseskasser responser. - Placer bøjning aktuatoren og kam på en bevægelig mount. En pipette holder fastgjort til en magnetisk base som normalt anvendes til in vitro elektrofysiologi rigge fungerer godt.
3. Montering af Connector der monteres til Stænger over Cylinder (figur 2C, 2E)
Bemærk: Stikket er en 3-D udskrevet 7-hullers strimmel modelleret fra Amphenol 221 serien nylon bånd anvendes til tøjr af Weiss og Disterhoft og Galvez et al 10,17.
- Tryk på første hul i strip for en 0-80 x-1"Maskine skrue. Dette vil tjene som en låseskrue at forankre medaljon til stikket. Forsynes med et 0-80 møtrik til lederen af låseskruen med cyanoacrylsyre lim for at lette at dreje skruen med hånden.
- Efterlad et hul tom efter bankede hul (for at give plads til den 0-80 maskine møtrik) og skub fem guldbelagte Relia-tac stikkontakter gennem de resterende fem huller.
- Strip belægningen off fem lange ledninger (ledninger opnået fra et Ethernet-kabel) og lodde til enderne af stikkene.
Bemærk: De første to ledninger vil blive anvendt til at registrere de elektromyografiske (EMG) signaler der kan påvise en blink med øjet respons efter signal filtrering og forstærkning fra en forstærker. Den anden to vil levere chok signal fra en stimulus isolator. Den sidste ledning vil tjene som en jordforbindelse. Disse ledninger vil blive forbundet til de systemer, der anvendes for den tidsindstillede CS-US levering. - Sørg elektrisk forbindelse mellem ledningerne og stikkene med en multimeter. Sæt multimeter på indstillingen kontinuitet og hold en af sonderne til stiften og den anden sonde til de afisolerede ender af wiren. Stifterne og ledningerne er elektrisk forbundet, når modstanden er lav og multimeter udsender en tone.
- Alternativt, hvis multimeter ikke har en kontinuitet indstilling, måle modstanden mellem benene og ledningerne. Der er elektrisk kontinuitet, hvis der er meget lidt modstand målt.
- Forbered vingerne af stikket fra to til-220 stil transistorer. Skær de emitter, base, og opkøber fører af transistoren og niveau overfladen, så den kan fastgøres til stikket.
- Skær kanten af fanen montering at bryde hul, så fanen kan glide under skruehovedet.
- Epoxy transistorer af stikket. Hullet i fanebladet montering vil blive brugt til at fastgøre stikket til stængerne over cylinderen.
- Påfør epoxy til bunden af trådene protruding fra soklerne og lade epoxyen tørre. Den epoxy vil isolere og beskytte tilslutningerne.
4. Forberedelse af medaljon (figur 2D, 2E)
Bemærk: medaljon strimmel er en 3-D udskrevet 7-hullers strimmel modelleret fra Amphenol 221 serien nylon bånd anvendes til medaljon af Weiss og Disterhoft og Galvez et al 10,17.. Dette stykke er ikke længere fremstilles kommercielt. Printeren fil kan downloades fra dette tidsskrift hjemmeside.
- Tryk på det første hul i strip for en 0-80 x 1 "maskinskrue og efterlade et hul tom efter det første hul.
- Push fem guldbelagte ben gennem bunden af de resterende fem huller (gennem de snævrere ender). Brug en skruestik for at lette skubbe stifterne ind i strimlen jævnt.
- Ved hjælp af en termisk stripper, fjerne omkring 0,5 cm af polyimidovertræk fra slutningen af en tråd af rustfrit stål (0,005 in. I diameter), lodde den afisolerede ende af wire til åbningen af en af stifterne og skæres tråden til 0,6-0,7 cm.
- Strip ca. 0,2 cm fra enden af tråden for at tillade strøm at passere til dyret.
- Gentag trin 4,3-4,4 for de resterende tre tråde.
Bemærk: De første to ledninger registrerer EMG responser, mens den anden to vil tjene til at afgive et stød til dyret. - Som den sidste (femte) ledning vil tjene som en jordledning, skære omkring 5 cm af tråd ubestrøget rustfrit stål (0,005 i. Diameter), og lodde til den resterende pin.
- Sikre kontinuitet mellem trådene og pins med et multimeter. (I tilfælde af jordledningen, som er belagt, kan multimeter sonden placeres overalt langs tråden.)
5. Kirurgisk forberedelse (figur 2F)
- Sterilisere alle kirurgiske værktøjer, herunder medaljon. Sterilisere hovedstykket ved opblødning det i alkohol og derefter skylning med sterilt saltvand.
- Bedøver musen i en induktion kammer med 3-4% volumenaporized isofluran blandet med en strømningshastighed på 1-2 l ilt per minut.
- Konstatere, at dyret er fuldt bedøvet med en tå knivspids. Musen er fuldt bedøvet, når det ikke reagerer refleksivt til tå knivspids.
- Når dyret er fuldt bedøvet, indsprøjte en dosis af buprenorphin hydrochlorid som et analgetikum (0,05-2 mg / kg, sc), barbere toppen af dyrets hoved, placere den på en overdækket varmepude på bunden af stereotaktisk ramme , konstatere, at dyret er fuldstændigt bedøvet, og fastgør hovedet til rammen. Opretholde strømmen af fordampet isofluran til dyret, skifte til 2% ved en strømningshastighed på 1-2 l ilt per minut. Anvende en lille mængde af ophthalmisk salve til hornhinder.
- Desinficer hovedbunden med povidon-jod og alkohol tre gang hver skiftevis mellem de to.
- Med en række 10 eller 15 skalpelblad, lave et snit langs midterlinien i hovedbunden, udsætter kraniet fra forsiden af than øjne for forbi interparietal knogle (~ 1,5-2 cm).
- Hold tilbage flapperne af huden med mikro klip. Placer et klip over øjet, en langs midten af rostralt-caudale akse, og en på bagsiden af kraniet bilateralt (dvs. bruger seks klip i alle). For at forhindre headpiece avulsion, afsløre så meget af kraniet som muligt, herunder siderne og bagsiden. Dette vil forøge overfladearealet for anvendelsen af klæbemidlet cementering cement.
- Brug af skalpel, skrabe langs toppen af kraniet for at fjerne periosteum og sikre en ren og tør arbejdsflade. Rengør toppen af kraniet med 3% hydrogenperoxid tre gange.
- Bor to huller i kraniet med en størrelse 34 omvendt kegle grat eller en 1,6 mm gravering cutter boret til at acceptere 00-90 skruer (0,0625 i. Lang). Skruerne vil give den elektriske jordforbindelse. Placer en hul foran Bregma, og den anden foran Lambda, til venstre for midterlinien, da den betinget right øje. Placer en skrue i hvert hul. Sænk skruen 0,28 mm ind i kraniet for hver fuld omdrejning; to hele omdrejninger er tilstrækkelig.
- Skabe flere små divots på ca. 0,75 mm i diameter på kraniet for at forøge overfladearealet og gribestyrke for cementen.
- Tag den udfyldte medaljon og vind jorden wire i en figur-otte konfiguration omkring de to skruer. Tillad nogle slæk (~ 1,5 cm mellem medaljonen og skruen) i jordledningen så medaljon kan placeres korrekt senere.
Note: Figuren otte normalt sikrer en god elektrisk forbindelse mellem wiren og jorden skruer. Tråden kan også loddes til skruen for at sikre en elektrisk forbindelse. - Påfør limen cementering cement. Følg producentens anvisninger til at blande klæbemidlet cementering cement eller mix 4 kugler L-pulverblanding, 8 dråber af basen, og 2 dråber af katalysatoren i en kold keramisk blanding skålen (sikre temperaturen strimler on blandingsforholdet parabol er helt sort.) Den kolde temperatur forlænger arbejdstiden for cementen.
- Coat kraniet og rundhåndet skruer med cementering cement og tillade cementen tørre. Dette bør kun tage et par minutter.
- Efter at cementen er tørret, positionere hovedstykket lodret, med benene stående, over kraniet. Hold hovedstykket på plads med en holder svarende til konnektoren
Bemærk: Se "3. Montering af Connector" -Den holder behøver kun være en fem-hullers strimmel med guldbelagte stikkontakter for at modtage de stifter af medaljon. Holderen er fastgjort til en arm på stereotaktisk ramme. Anvendelsen af holderen og arm letter placeringen af hovedstykket og ledningerne. - Efter hovedstykket er blevet placeret, skrælle huden omkring øjenområdet og placere de to shock ledninger for at tillade 0,2 cm afisolerede ende til hvile under huden og ca. 2-4 mm direkte kaudalt for eye. Lad ikke enderne af de to ledninger til at røre hinanden. Placer de to EMG ledninger på muscularis orbicularis oculi over øjenhulen.
- Hvis det er nødvendigt, afskåret enderne af trådene, hvis de er for lange og synes som om de kan direkte ridse bane og resultere i infektion. Hvis afskæring enderne af tråden, sikre, at der er nok blank tråd blotlagt. Alternativt, hvis ledningerne synes for lang, bøje ledningen tilbage ved basis, hvor de strækker sig ud af hovedstykket.
- Cement bunden af trådene (dvs. enden nær hovedstykket) på plads på kraniet med en lille spredning af klæbemidlet cementering cement og lad det tørre (brug halvdelen af delen beskrevet tidligere).
- Fjern de mikro clips og forsigtigt fold flapperne på huden tilbage over cementen. Tillader huden at afvikle naturligt at forhindre spænding på nogen del af huden for at undgå forvridning af øjenlåget, forebyggelse af blink med øjet respons,og angst til dyret.
- Forsegl udsatte område med dental cement, der dækker alt fra den indridset hud til kanten af toppen af medaljon med cement. Vær ekstra opmærksom på at undgå dryp cement på øjnene eller stifter af medaljon. Delvist hærdet cement kan udjævnes og manipuleres med en vatpind, der er fugtet med dental cement opløsningsmiddel. Lad cementen tørre helt, før du fjerner holderen medaljon.
- Lad dyret kan komme sig anæstesi på en opvarmet overflade, før du udskifter dyret tilbage i sit bur. Administrer Metacam (1 mg / kg, SQ) og derefter placere dyret tilbage i sit bur.
- Lad dyret 5-7 dages restitution før testning eller uddannelse. Oprethold standard postoperativ pleje til dyret i henhold til din institutionens retningslinjer. Dyret bør kontrolleres mindst en gang om dagen, efter at den er kommet sig kirurgi. Hold øje med tegn på dårlig spise og / eller drikke og sløv adfærd. Hvis smertener mistanke, give Metacam hver 24 timer (samme dosis som i slutningen af post-kirurgi), indtil lindres. Lidocain kan lokalt påføres såret, hvis dyret er ridser eller viser tegn på ubehag.
6. Placering af musen på Cylinder og uddannelse (figur 2G)
- For at placere musen på cylinderen, begrænse musen med en hånd kort ved at holde den i halen med den ene hånd og derefter tage fat i musen bag skuldrene med pegefinger og tommelfinger med den anden. Wrap resterende fingre omkring musens abdomen og torsoen.
- Med hånden ikke fastholdende musen, fastgøre stikket til hovedstykket på musens hoved og drej låseskruen.
- Placer musen forsigtigt på cylinderen og holde det på plads, mens fastgørelse af stikket til rammen. Brug de to skruer til at fastgøre stikket til barer over cylinderen.
- Når konnektoren er blevet fastgjort til cylinderen ramme, release lastrummet på musen. Giv musen én dag i to sessioner på tilvænning til cylinderen. Tillad hver tilvænning session samme varighed som hver condition session.
- Optag spontane blinkhastighed under tilvænning og pre-udsætte musene for whisker vibrationer CS for at minimere forekomsten af forskrækkelseskasser responser. Påfør CS som under en egentlig condition session, men uden den elektriske chok USA.
- Påfør knurhår stimulation CS ved at placere Piezo systemet tæt (ca. 0,5 cm) til det konditionerede side (højre side) af musen, mens glide tænderne i kammen over de enkelte whiskers. Sørg for, at de samme knurhår stimuleres dag til dag ved at placere Piezo system i samme position fra dag til dag.
- Begynd at træne musen på klassisk betingning. Lever to sessioner af træning om dagen i fem dage. Lad omkring to timer mellem hver træningssession.
- Til den betingede gruppe, deliver tredive forsøg pr session på en 250 msek lang knurhår vibrationer CS (60 Hz) parret med en 100 msek lang elektrisk puls USA (0,3 mA - 3 mA, leveret fra et WPI A385R stimulus isolator). Adskil KS og USA med 250 msek lang stimulus-fri spor interval for at gøre opgaven afhængig af hippocampus (figur 1) 23.
- Juster intensiteten af det elektriske stød for hvert dyr, således at et blink fremkaldes. Separate forsøg med en tilfældig interforsøgsinterval på 30-60 sek (gennemsnit af 45 sek, samlet varighed på 30 min per session.)
- Lever tredive uparrede CS alene og os alene forsøg hver (i alt tres forsøg) til pseudoconditioned gruppe, anvendelse af de samme stimulusparametre som angivet for det konditionerede gruppe. Sørg for, at CS alene og os alene forsøg pseudorandomized således at ingen stimulus præsenteres mere end to gange i træk. Adskil hvert forsøg med en gennemsnitlig interforsøgsinterval på 22,5 sek.
- delever baggrundsstøj på 65 dB i hele tilvænning og træning med henblik på at maskere støj af vibrationer fra den knurhår stimulator.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
8-10 uger gamle mandlige C57BL6 / J mus blev uddannet på spor blink med øjet condition på hovedet-faste cylindriske løbebånd apparat. 8 mus blev trænet med parrede CS-amerikanske præsentationer (aircondition gruppe) og 9 mus blev trænet med uparrede CS og amerikanske præsentationer (pseudoconditioned gruppe).
Eksempel EMG optagelser af en betinget reaktion fra et konditioneret mus er vist i figur 3 og 4. EMG optagelser for hvert forsøg blev udbedret, og integreret med en 10 ms tidskonstant. Figur 5 viser den ensrettede og integreret EMG respons spor gennemsnit på tværs af alle forsøg for hver af 10 sessioner for både en betinget (A) og en pseudoconditioned (B) mus. Udviklingen af konditioneret reaktioner kan ses i figur 5A, med responser bliver større tættere til udbrud af USA. Denne udvikling er ikke set in pseudoconditioned reaktioner i figur 5B.
Udviklingen i godt timet, og således, well-lært conditioned responser kan også ses i figur 6. Figur 6 viser histogrammer af tiden til toppen af respons efter CS indtræden. Der er en indledende top i grafen mellem 0 - 150 ms efter CS debut. Denne første top kan ses så tidligt som i session 1. Med flere træningssessioner, der er udviklingen af en top i grafen mellem 400-500 msek blandt de konditionerede dyr, hvilket indikerer udviklingen af bedre timet betingede responser.
Figur 7A viser de gennemsnitlige procent adaptive konditioneret svar registreres fra konditioneret og pseudoconditioned mus. Adaptive konditioneret reaktioner anses for at have væsentlig aktivitet, som er til stede mindst 20 msek befmalm US indtræden (dvs. mindst 4 SD større end den gennemsnitlige aktivitet nuværende 250 msek før CS indtræden). I løbet af de kurser, viste aircondition mus gradvis indlæring af konditionering paradigme ved at udstille mere betingede adaptive responser med hver træningssession, så betinget mus udviste signifikant flere adaptive aircondition respons end pseudoconditioned mus (grupper, F (1,15) = 20,62, p <.0005, sessioner, F (1,9) = 9,987, p <0,0001; grupper * sessioner, F (1,9) = 5,977, p <0,0001). Bemærk, at den pseudoconditioned gruppe typisk udstillet pseudo CR på mindre end 20% af forsøgene.
Figur 7B viser den gennemsnitlige betinget reaktion (området under kurven for den ensrettede og integreret EMG respons) for begge aircondition og pseudoconditioned mus over ti træningssessioner. Planlagte sammenligninger med en gentagne målinger ANOVA over last fire sessioner (dvs. sessioner 7-10, når den betingede gruppe havde nået en indlæring kriterium på 60% CR) viser en signifikant væsentligste virkning af gruppen, hvilket indikerer, at CR-området var større i den konditionerede end i pseudoconditioned gruppe indlæg læring kriterium (grupper, F (1,14) = 5,733, p <0,05, session, F (1,3) = 0,486, ns; grupper * session, F (1,3) = 0,432, ns).
Figur 7C viser de gennemsnitlige procent alfa (forskrækkelseskasser) svar optaget fra de betingede og pseudoconditioned mus. Alpha svar er aktivitet inden for 50 ms af CS debut, der var i hvert fald 4SD over den gennemsnitlige baseline aktivitet. I løbet af de kurser, aircondition og pseudoconditioned mus typisk udstillet alfa svar på mindre end 25% af forsøgene, med ingen signifikante forskelle mellem betingede og pseudoconditioned mus (grupper, F (1,15) = 2,502, NS). the gentagne målinger ANOVA har dog afsløre en signifikant interaktion af grupper og sessioner på grund af faldet i pseudoconditioned svarene og vedligeholdelse af alfa respons på omkring 25% for betinget mus (grupper * sessioner, F (1,9) = 2,074, p <0,05). Stigningen i alpha reaktioner under sessionen 10 skyldes sandsynligvis den korte indtræden latenstiden for det veludviklede CR.
Figur 7D viser den gennemsnitlige procent korte latenstid respons registreres fra begge grupper af mus. Korte latency svar afspejlede aktivitet mellem 50-70 ms efter CS debut, der var 4SD over den gennemsnitlige baseline aktivitet. A gentagne målinger ANOVA viste, at betingede dyr udstillet flere korte latenstid respons end pseudoconditioned dyr over de ti træningssessioner (grupper, F (1,15) = 5,377, p <0,05, session, F (1,9) = 3,920, p <.0005, grupper * session, F (1,9) = 3,158, p <0,005). Thans kan afspejle en tidligere debut tidspunkt af CR, da den betingede gruppe udstillede større CR med hver træning.
Figur 1:. The Trace blink med øjet Conditioning Paradigm I spor blink med øjet condition, er en uskadelig betinget stimulus (CS) parret med en mildt skadelig ubetinget stimulus (US) betød at fremkalde en blink med øjet respons. CS og USA er adskilt af en stimulus-fri tidsmæssige hul, hvilket gør paradigme hippocampus-afhængige 23. I paradigmet her beskrevne, er en 250 msek lang knurhår vibrationer CS parret med en 100 ms lang periorbital chokere USA. CS og USA er adskilt af en 250 msek lang tidsmæssig hul. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2:. Chefen-fikseret Forberedelse A, The head-faste set-up for blink med øjet condition med cylinderen, den knurhår stimulator, og stikket angivne B, The knurhår stimulator med to-lags bøjning aktuator og kam angivet.. C, stikket med de enkelte dele angivne: låseskrue, den 7-hullers strimmel, ledningerne loddet til stikkontakter og epoxy for at bevare ledningerne, vingerne konverteret fra en TO-220 stil transistor D, The medaljon med den enkelte. dele angivet: 7-hullers strimmel, stifterne, og trådene loddes ind stifterne, herunder den ikke-coatede rustfri jordleder, og den enkelte stød og EMG tråd af rustfrit stål, med 0,2 cm polyimidovertræk strippet ud i slutningen E. , konfigurationen for hvert hul i 7-hullers strip for både stikket og denmedaljon. F, En mus med en indopereret medaljon. G, En mus anbringes på cylinderen, klar til at blive uddannet. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3:. Eksempel EMG optagelse De blå linjer afgrænse CS præsentation (250 msek lang). De røde linjer afgrænse den amerikanske præsentation, som viser artefakt, der kommer fra det elektriske stød (100 msek). CS og US er adskilt af en 250-msek stimulus interval. Inden for denne stimulus interval er højere amplitude EMG aktivitet (i forhold til baseline), der afgrænser en CR. Klik her for at se en større version af dette tal. </ A>
Figur 4:. Eksempel EMG og tilsvarende optiske infrarøde refleksion optagelser EMG optagelsen er lige så nøjagtig som den optiske infrarød refleksion sensor i detektering betinget respons debut (blå linje), latenstid til respons peak (rød linje), og ubetinget blink med øjet respons debut ( lyserød linie). klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5:. Averaged blink med øjet Traces gennemsnit rektificeret og integrerede spor af blink med øjet respons for en konditioneret mus (A) og en pseudoconditioned mus (B). Hver spor repræsenterer gennemsnittetreaktion af musen for alle forsøg over en enkelt session. Den blå del repræsenterer responsen under knurhår vibrationer CS præsentation. Den røde sektion repræsenterer responsen under stimulus-fri trace interval. I A, chok USA inducerede en artefakt, der er til stede under mørkegrå område efter spor interval. B viser svarene på knurhår vibrationer CS alene. Præsentation af CS alene og os alene forsøg blev pseudorandomized i pseudoconditioning. Klik her for at se en større version af dette tal.
. Figur 6: Histogrammer af Response Peak Times Histogrammer af tiden til spidsresponsen for alle aircondition (n = 8; blå søjler) og 8 pseudoconditioned (røde søjler) dyr for alle stIALS tværs af alle sessioner (data fra én pseudoconditioned mus blev udelukket for at muliggøre en direkte sammenligning af antallet af svar mellem grupperne). Lilla søjler angiver hvor de betingede og pseudoconditioned dyr overlapper hinanden. Top respons tider er beregnet som tidspunktet for den største top i udbedret og integreret EMG registrering mellem CS og amerikanske debut. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 7: respons kurver af konditioneret Dyr (n = 8; blå kurver) og pseudoconditioned dyr (n = 9; røde kurver). A, Procent Averaged Adaptive Betinget Responses (± SEM) for betingede og pseudoconditioned dyr over 10 træningssessioner. B gennemsnit område (± SEM) i CR for betingetog pseudoconditioned dyr over 10 træningssessioner. C, Procent Middelværdi Alpha Response (± SEM) for betingede og pseudoconditioned dyr over 10 træningssessioner. D, Procent gennemsnit af Short Latency Responses (± SEM) for betinget og pseudoconditioned over 10 sessioner. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Klassisk blink med øjet condition er en form for associativ læring, der er et nyttigt redskab til at forstå de neurale substrater underliggende indlæring og hukommelse. Tidligere metoder anvendes til blink med øjet konditionering hos gnavere såsom mus involverede et kammer, der tillod for dyret at bevæge sig frit. Et hoved-fikserede præparat til blink med øjet konditionering i mus, under anvendelse af apparatet beskrevet af Chettih et al. Og Heiney et al. Og senest anvendt i lys-fremkaldte spor blink med øjet condition i Siegel et al. Giver flere fordele, såsom at muliggøre visse procedurer og eksperimenter, der skal udføres i løbet af blink med øjet condition, der ikke havde været muligt eller havde været begrænset i fortiden (fx in vivo to-foton calcium imaging) 14-16. Denne type præparat letter også anvendelsen af andre teknikker, såsom in vivo elektrofysiologi med tetrode arrays. Som mus synes at blive Distressed fra tilbageholdenhed blev denne head-fikseret præparat udviklet til at holde hovederne sikker og samtidig reducere mængden af tilbageholdenhed påkrævet. Mens dette præparat tillader mus til ambulate på en cylindrisk løbebånd, andre har også med succes indsamlet adfærdsmæssige data fra head-faste mus på en stabil platform 24.
Der er dog visse problemer, der opstår ved brug af hoved-faste cylinder system. En bekymring er, at når man i første omgang placerer en utrænet mus på cylinderen, kan det brug for lidt tid til at lære at hvile, gå, eller køre på nye apparat. De fleste mus lærer hurtigt at hvile, gå, eller køre på cylinderen komfortabelt. To tilvænnings- sessioner med til at vænne musene til cylinderen og i midten af den anden session, de fleste mus er komfortable på cylinderen. En anden bekymring der opstår, er medaljon avulsion. Der har været nogle problemer med dette i fortiden under multi dag træning, men brugen af den klæbende cementering cement har lindres problemer med medaljon avulsion. Anvendelsen af klæbemidlet cementering cement har resulteret i 0% medaljon avulsions fra mere end 50 operationer siden med denne teknik. Med korrekt brug og tilstrækkelig spredning af cement på kraniet, bør forskerne støder ingen spørgsmål med medaljon avulsion. Endelig ved at præsentere CS under tilvænnings- sessioner, kan der være en vis bekymring over latent hæmning. Det er imidlertid klart, at musene blev konditioneret med succes (se figur 7). Bemærk at intensiteten af den knurhår vibration kan ændres ved at ændre mængden af spænding væltes af rheostat. Hvis musene ikke kan lære, kan spændingen øges til støtte vellykkede konditionering samtidig minimerer forskrækkelseskasser responser. Forskerne kan også ændre typen af elektrisk stød USA, der er leveret til dyret. Den elektriske stød USA kan være en enkelt elektrisk impuls varer 100 msek som rapporteret her. Alternativt, som the stimulus isolator anvendt i denne protokol kan sende bifasiske pulser, kan forskerne også anvende 120 Hz 6 bifasiske pulspar på 1 msek pr puls for en effektiv elektrisk stød os samt.
Boele et al. Anførte sandsynligheden for, at visse "konditioneret svar" kan stamme fra forskrækkelse (alfa) reaktioner på CS eller korte latenstid reaktioner (SLR) 25. Alpha reaktioner anses for at være hurtige øjenlåg lukninger inden for en 50 ms latency efter CS debut. Mus holder ofte lukkede øjne for varigheden af forsøget, følger denne alpha svar. Spejlreflekskameraer, på den anden side, har en latenstid på 50-70 msek fra CS debut og opstår typisk efter kun et par CS-amerikanske fodboldmesterskaber. Den korte latenstid til indtræden af både alfa og spejlreflekskameraer og det faktum at der kan opstå spejlreflekskameraer efter kun et par CS-amerikanske parringer angiver, at de sandsynligvis er ikke drevet af den hippocampale-cerebellare kredsløb. Disse observationer gennemgået af Boele et al. Therefore tigge spørgsmålet om, hvorvidt CRS registreres her, er lært reaktioner. Som figur 7C og 7D show, hverken alfa reaktioner eller spejlreflekskameraer udgør et flertal af CRS optagne, hvilket tyder på, at de adaptive CR er medieret af forhjernen og lillehjernen. Histogrammerne i figur 6, som viser latens til toppen af blink med øjet respons efter CS indtræden viser også, at mens visse analyser kan omfatte en tidlig indtræden alfa- eller korte latenstid respons, med flere uddannelse forsøg, toppen af blink med øjet respons faktisk forekommer senere og tættere til udbrud af USA, der angiver udviklingen af vel-timede betingede reaktioner. Som tidligere nævnt blev whisker stimulering og chok intensitet dæmpes til et niveau, der ikke var overraskende eller overdrevent afskrækningsmiddel, men forblev effektiv til at producere adaptive konditioneret responser. Endelig, som Figur 7B viser, størrelsen af CR (målt som arealet underkurve i udbedret og integreret indsats, som i figur 5) er større i den betingede gruppen end i pseudoconditioned gruppe, når den betingede gruppe nåede en lærerig kriterium på 60%, der betyder, at disse reaktioner kræve flere sessioner for at lære, i modsætning til spejlreflekskameraer og alpha reaktioner.
Boele et al. Påpegede også, at EMG målinger, mens en præcis metode til blink detektion i større dyr såsom kaniner, der ikke er så praktisk i små gnavere såsom mus 25. De anbefaler brugen af den magnetiske afstand måleteknik (MDMT) for at undgå detektering af falske positive signaler, EMG optagelse kan indikere. Den MDMT teknik, mens imponerende i sin følsomhed og kvaliteten af blink detektion, præsenterer også den ulempe at skulle bedøve dyret hver dag af uddannelse for at fastgøre chippen 26. Dette i sig selv kan forvirre læring satser. Vi finder, at EMG-signaleroptaget med fremgangsmåderne beskrevet her opnås let, af høj tidsmæssig opløsning, pålidelig og relativt let at måle og analysere.
Figur 4 viser et repræsentativt EMG signal detektion blinker med et tilsvarende signal fra en infrarød reflekterende optisk sensor placeret tæt på musens øje under træning. Der er en klar sammenhæng i blinke afsløring mellem EMG-signalet og den optiske sensor, der angiver nøjagtigheden af blink påvisning ved EMG optagelser. En fordel ved EMG optagelser er, at det giver mulighed for den største tidsmæssige opløsning. Selvom opløsningen nedbrydes ved at integrere over en 10 msek tidskonstant, kan man også analysere de rå EMG-data til påvisning af øjet blink aktivitet. Spike tæller er en parameter, der kan anvendes til at detektere CR'er 18. En ulempe med EMG optagelser er, at signalerne uden tvivl vil blive forurenet af den elektriske artefakt kommer fra elektrisk stød USA (se
Hovedet-fikserede fremstilling beskrevet her ligner den præsenteret af Heiney et al. 15 Der er imidlertid visse bemærkelsesværdige forskelle fra deres elegante system. For eksempel den her beskrevne fremgangsmåde til optagelse blink med øjet responser er ledninger placeret subdermalt over øjet at optage EMG-aktivitet. Denne teknik muliggør pålidelige og stabile optagelser af øjenlåg aktivitet og derved af blink med øjet respons. Korrekt placering og fiksering af disse tråde sikrer optagelser kvalitet, som holder i mindst to uger, varigheden af forsøget. En fordel ved anvendelse EMG tråde snarere end en højspeed kamera, som anvendes af Heiney et al., er, at EMG optagelser har ekstremt høj tidsmæssig opløsning, og kræver ikke den daglige positionering og kalibrering at et kamera kræver 15. Kameraet kan dog tilbyde direkte visuel bestemmelse af øjenlåg lukning.
En anden forskel mellem de to systemer er metoden til CS levering. Denne særlige head-fikserede muse præparat udnytter whisker stimulation som den konditionerede stimulus. Resultaterne viser, at mus kan konditioneres effektivt med knurhår stimulation som CS, ligesom hoved-fikserede kaniner kan konditioneres med knurhår vibration 27. Heiney et al. Demonstrerede stimulering af knurhår pad som en effektiv CS ved at rette en svag pust af luft til knurhår puden 15. Selvom begge teknikker demonstrere effektiv konditionering, at placere en kam over udvalgte whiskers og vibrerende kammen tillader evnen til at stimulere individuelle whisker rækker eller endda enkelte whiskers. Denne teknik er blevet anvendt i tidligere forsøg til at give dyr at tjene som sin egen kontrol (dvs. blev stimuleret whisker rækken sammenlignet med en række af ikke-stimulerede whiskers) 20.
Sammenfattende et hoved-fikseret præparat til whisker-signaleres blink med øjet conditioning muliggør en sikret kranial platform til udførelse avancerede teknikker og eksperimenter, der tidligere havde været umuligt eller vanskeligt at udføre. Mild knurhår stimulering blev anvendt som den konditionerede stimulus og et mildt elektrisk stød blev anvendt som ubetinget stimulus. Blink med øjet svar blev optaget med ledninger placeret subdermalt bag øjenlåget. Pålidelig læring blev påvist i mus med direkte stimulering af udvalgte knurhår som CS og periorbitalt elektrisk stød som USA, og ingen læring var tydelig i mus, der fik tilfældige præsentationer af CS og USA. EMG optagelser lavet en pålidelig og relholdsvis enkel metode til optagelse blink med øjet svarene og observere, hvordan svarene ændret tværs træningssessioner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Dette arbejde blev finansieret af Department of Defense (W81XWH-13-01-0243) og National Institutes of Health (R37 AG008796). Vi takker Alan Baker i Northwestern Universitys maskinværksted for at bygge head-faste cylinder apparat. Vi takker Dr. Shoai Hattori for hans vejledning i Matlab og Solidworks. Vi takker Dr. John Strøm af LabView software, der styrede eksperimentet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Exervo TeraNova Foam Roller 36" x 6" | Amazon | B002ONUM0E | For cylinder |
| Plexiglas | Custom-made; 1 cm thick | ||
| Metal Rods (12.7 mm diameter) | Custom-made | ||
| 4-40 machine screw (.25 in. long) | Amazon Supply | B00F33Q8QO | For cylinder |
| Classic Design Hair Comb | Conair | 93505WG-320 | For whisker stimulation |
| 2-Layer Rectangular Bending Actuator | Piezo Systems | T220-A4-303X | For whisker stimulation |
| Solder and Flux Kit | Piezo Systems | MSF-003-NI | For whisker stimulation |
| Magnetic Base | Thor Labs | MB175 | For whisker stimulation |
| Threaded rod for magnetic base | Custom-made | ||
| Strips based on 221 series nylon strip connectors from Electronic Connector Corp. | Custom-made, based on Weiss and Disterhoft, 2008 | ||
| TO-220 Style Transistor | Amazon Supply | B0002ZPZYO | For connector; for the wings |
| Relia-Tac Sockets | Electronic Connector Corp. | 220-S02 | For connector |
| Relia-Tac Pins | Electronic Connector Corp. | 220-P02 | For headpiece |
| 0-80 stainless steel machine screw (1 in. long) | Amazon Supply | B000FN68EE | Locking Screw |
| 0-80 stainless steel machine screw hex nut (5/32 in. thick) | Amazon Supply | B000N2TK7Y | Locking Screw Head |
| Loctite Super Glue-Liquid | Loctite | 1365896 | Cyanoacrylic glue; for the locking screw |
| Quick Setting Epoxy | Ace Hardware | 18613 | For connector and whisker stimulation system |
| Ethernet Cable Wires | Ethernet cable can be taken apart to use the individual wires for the connector | ||
| Polyimide coated stainless steel wires (2 in. long, .005 in. diameter) | PlasticsOne | 005sw/2.0 37365 S-S | For headpiece, EMG and shock wires |
| Stainless steel uncoated wire (.005 in. diameter) | AM Systems | 792800 | For headpiece, ground wires |
| Tenma Variable Autotransformer | Tenma | 72-110 | For the whisker stimulation; rheostat to adjust current to the bending actuator |
| Amplifier | A-M Systems | 1700 | Amplifier for filtering and amplifying EMG signals |
| WPI A385R stimulus isolator | World Precision Instruments | 31405 | For the electrical shock |
| Isothesia (Isoflurane) | Henry Schein: Animal Health | 50031 | For surgery; anesthesia |
| Buprenex Injectable CIII | Reckett Benckiser Pharmaceuticals Inc | NDC 12496-0757-1 | For surgery; analgesic |
| Akwa Tears: Lubricant Ophthalmic Ointment | Akorn | NDC 17478-062-35 | Artificial tear ointment to prevent dry eyes while under anesthesia |
| Povidine-Iodine Prep Pads | PDI | NDC 10819-3883-1 | For surgery; antiseptic |
| Alcohol Prep Pads | May be purchased from any standard pharmacy | ||
| Stainless steel surgical scalpel handles (no.3) | Integra Miltex | 4-7. | For surgery |
| Stainless steel surgical scalpel blades | Integra Miltex | 4-310 or 4-315 | For surgery; number 10 or 15 scalpel blade |
| 3% Hydrogen Peroxide | May be purchased from any standard pharmacy | ||
| Micro Clip | Roboz | RS-5459 | For surgery, to hold back skin |
| 00-90 stainless steel machine screw (0.0625 in. long) | Amazon Supply | B002SG89X4 | For surgery, to wrap ground wire around |
| Professional Rotary Tool | Walnut Hollow | 29637 | Hand drill for surgery, to drill holes in skull |
| Inverted Cone Burr | Roboz | RS-6282C-34 | Inverted cone burr size 34; for surgery, to drill holes in skull |
| Engraving Cutter Drill Bit | Dremel | 106 | Engraving cutter; 1.6 mm bit; for surgery, to drill holes in skull |
| C&B Metabond-Quick! Cement System "B" Quick Base | Parkell | S398 | For surgery; adhesive luting cement system; important to prevent headpiece avulsion |
| C&B Metabond-Quick! Cement System Clear L-Powder | Parkell | S399 | For surgery; adhesive luting cement system; important to prevent headpiece avulsion |
| C&B Metabond-Quick! Cement System "C" Universal TBB Catalyst 0.7 ml | Parkell | S371 | For surgery; adhesive luting cement system; important to prevent headpiece avulsion |
| C&B Metabond-Quick! Cement System Ceramic Mixing Dish with temperature strip | Parkell | S387 | For surgery; adhesive luting cement system; important to prevent headpiece avulsion |
| Swiss Tweezers, style #5 | World Precision Instruments | 504506 | For surgery |
| Puritan Cotton-Tipped Applicators | VWR International | 10806-005 | For surgery |
| Dental Caulk Grip Cement Kit | Dentsply | 675570 | For surgery; dental cement |
References
- Clark, R. E., Squire, L. R. Classical conditioning and brain systems: the role of awareness. Science. 280 (5360), 77-81 (1998).
- Thompson, R. F., Kim, J. J. Memory systems in the brain and localization of a memory. PNAS. 93 (24), 13438-13444 (1996).
- Solomon, P. R., Vander Schaaf, E. R., Thompson, R. F., Weisz, D. J. Hippocampus and trace conditioning of the rabbit's classically conditioned nictitating membrane response. Behav Neurosci. 100 (5), 729-744 (1986).
- Moyer, J. R., Deyo, R. A., Disterhoft, J. F. Hippocampectomy disrupts trace eye-blink conditioning in rabbits. Behav Neurosci. 104 (2), 243-252 (1990).
- Weiss, C., Bouwmeester, H., Power, J. M., Disterhoft, J. F. Hippocampal lesions prevent trace eyeblink conditioning in the freely moving rat. Behav Brain Res. 99 (2), 123-132 (1999).
- Weiss, C., Disterhoft, J. F. Exploring prefrontal cortical memory mechanisms with eyeblink conditioning. Behav Neurosci. 125 (3), 318-326 (2011).
- Aiba, A., et al. Deficient cerebellar long-term depression and impaired motor learning in mGluR1 mutant mice. Cell. 79 (2), 377-388 (1994).
- Skelton, R. W. Bilateral cerebellar lesions disrupt conditioned eyelid responses in unrestrained rats. Behav Neurosci. 102 (4), 586-590 (1988).
- Takehara, K., Kawahara, S., Takatsuki, K., Kirino, Y. Time-limited role of the hippocampus in the memory for trace eyeblink conditioning in mice. Brain Res. 951 (2), 183-190 (2002).
- Weiss, C., Disterhoft, J. F. Evoking blinks with natural stimulation and detecting them with a noninvasive optical device: A simple, inexpensive method for use with freely moving animals. J Neurosci Meth. 173, 108-113 (2008).
- Royer, S., et al. Control of timing, rate and bursts of hippocampal place cells by dendritic and somatic inhibition. Nature. 15 (5), 769-775 (2012).
- Goldey, G. J., et al. Removable cranial windows for long-term imaging in awake mice. Nature Protoc. 9 (11), 2515-2538 (2014).
- Lovett-Barron, M., et al. Dendritic inhibition in the hippocampus supports fear learning. Science. 343 (6173), 857-863 (2014).
- Chettih, S. N., McDougle, S. D., Ruffolo, L. I., Medina, J. F. Adaptive timing of motor output in the mouse: the role of movement oscillations in eyelid conditioning. Front in Integ Neurosci. 5 (72), (2011).
- Heiney, S. A., Wohl, M. P., Chettih, S. N., Ruffolo, L. I., Medina, J. F. Cerebellar-Dependent Expression of Motor Learning during Eyeblink Conditioning in Head-Fixed Mice. J Neurosci. 34 (45), 14845-14853 (2014).
- Siegel, J. J., et al. Trace Eyeblink Conditioning in Mice is Dependent upon the Dorsal Medial Prefrontal Cortex, Cerebellum, and Amygdala: Behavioral Characterization and Functional Circuity. eNeuro. , (2015).
- Galvez, R., Weiss, C., Cua, S., Disterhoft, J. A novel method for precisely timed stimulation of mouse whiskers in a freely moving preparation: application for delivery of the conditioned stimulus in trace eyeblink conditioning. J Neurosci Meth. 177 (2), 434-439 (2009).
- Gruart, A., Sánchez-Campusano, R., Fernández-Guizán, A., Delgado-Garcìa, J. M. A Differential and Timed Contribution of Identified Hippocampal Synapses to Associative Learning in Mice. Cereb Cortex. , (2014).
- Weiss, C., et al. Impaired Eyeblink Conditioning and Decreased Hippocampal Volume in PDAPP V717F Mice. Neurobiol Dis. 11 (3), 425-433 (2002).
- Galvez, R., Weiss, C., Weible, A. P., Disterhoft, J. F. Vibrissa-signaled eyeblink conditioning induces somatosensory cortical plasticity. J Neurosci. 26 (22), 6062-6068 (2006).
- Galvez, R., Weible, A. P., Disterhoft, J. F. Cortical barrel lesions impair whisker-CS trace eyeblink conditioning. Learn & Memory. 14 (1), 94-100 (2007).
- Johnson, K. R., Zheng, Q. Y., Erway, L. C. A Major Gene Affecting Age-Related Hearing Loss Is Common to at Least Ten Inbred Strains of Mice. Genomics. 70 (2), 171-180 (2000).
- Tseng, W., Guan, R., Disterhoft, J. F., Weiss, C. Trace eyeblink conditioning is hippocampally dependent in mice. Hippocampus. 14 (1), 58-65 (2004).
- Joachimsthaler, B., Brugger, D., Skodras, A., Schwarz, C. Spine loss in primary somatosensory cortex during trace eyeblink conditioning. J Neurosci. 35 (9), 3772-3781 (2015).
- Boele, H. J. Cerebellar and extracerebellar involvement in mouse eyeblink conditioning: the ACDC model. Front in Cell Neurosci. 3 (19), (2010).
- Koekkoek, S. K. E., Den Ouden, W. L., Perry, G., Highstein, S. M., De Zeeuw, C. I. Monitoring kinetic and frequency-domain properties of eyelid responses in mice with magnetic distance measurement technique. J Neurophysiol. 88 (4), 2124-2133 (2002).
- Ward, R. L., Flores, L. C., Disterhoft, J. F. Infragranular barrel cortex activity is enhanced with learning. J Neurophysiol. 108 (5), 1278-1287 (2012).
