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Behavior

गलमुच्छा-संकेत दे सिर तय चूहे में eyeblink शास्त्रीय कंडीशनिंग

Published: March 30, 2016 doi: 10.3791/53310
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Physiology, Northwestern University

Introduction

Eyeblink कंडीशनिंग Pavlovian कंडीशनिंग के एक फार्म और साहचर्य सीखने और स्मृति के तंत्रिका तंत्र की जांच के लिए एक मॉडल प्रणाली है। यह मनुष्य, खरगोश, बिल्लियों, चूहों, और चूहों सहित विभिन्न प्रजातियों में जांच की गई है। प्रतिमान दो बनती उत्तेजनाओं की प्रस्तुति शामिल है: एक तटस्थ वातानुकूलित प्रोत्साहन (सीएस, जैसे, एक स्वर, प्रकाश की एक फ्लैश, या गलमुच्छा उत्तेजना), और एक मुख्य असुविधाजनक प्रोत्साहन (अमेरिका, जैसे, आंख के लिए एक हवाई कश, या periorbital सदमे)। अमेरिका के एक असुविधाजनक, कर्मकर्त्ता eyeblink प्रतिक्रिया (यानी, यू.आर.) elicits। आखिरकार, बनती CS-अमेरिका के कई प्रस्तुतियों के बाद, इस विषय में अमेरिका के साथ सीएस संबद्ध करने के लिए सीखता है। यह सीखने की एक वातानुकूलित प्रतिक्रिया (सीआर), एक eyeblink अकेले सीएस कि अमेरिका की प्रस्तुति पछाड़ द्वारा हासिल के रूप में प्रकट होता है।

ट्रेस रूप में eyeblink कंडीशनिंग कुछ घंटा की प्रोत्साहन मुक्त अंतराल में शामिलundred मिसे कि सीएस और अमेरिका (चित्रा 1) अलग करती है। ट्रेस कंडीशनिंग कथात्मक सीखने का एक प्रकार है, क्योंकि यह प्रोत्साहन आकस्मिकताओं 1 के बारे में जागरूकता की आवश्यकता है। लौकिक खाई अमेरिका और सीएस के लिए आदेश में इस तरह के हिप्पोकैम्पस के रूप में अग्रमस्तिष्क क्षेत्रों में सीएस के एक तंत्रिका 'ट्रेस' रखने के लिए संबद्ध 1-6 बनने के लिए पशु की आवश्यकता है। अग्रमस्तिष्क क्षेत्रों के साथ-साथ, ट्रेस कंडीशनिंग भी सेरिबैलम 7 पर निर्भर है।

Eyeblink कंडीशनिंग, इसलिए, स्मृति के कई पहलुओं, सहित अधिग्रहण, समेकन, और पुनः प्राप्ति की जांच के लिए एक उपयोगी प्रतिमान है। eyeblink कंडीशनिंग के दौरान, जानवरों की एक नियंत्रण समूह यादृच्छिक आदेश में कहा कि अमेरिका प्रस्तुति अकेले के बजाय एक सीखा CS-अमेरिका एसोसिएशन के कारण हो सकता सीएस को pseudoconditioning या अवगत प्रतिक्रिया के लिए परीक्षण करने के लिए unpaired उत्तेजनाओं के साथ प्रस्तुत किया है।

आमतौर पर इस्तेमाल किया apparaTus कृन्तकों में eyeblink कंडीशनिंग की जांच के लिए एक कक्ष जिसमें मूषक प्रशिक्षण की प्रक्रिया के दौरान 8-10 के बारे में आसानी से ले जाने की अनुमति दी जाती है। तंत्र के इस प्रकार के साथ, एक तार सामान्य रूप से एक टोप कि कृंतक की खोपड़ी से चिपका है से जुड़ा हुआ है। पगहा अमेरिका (और कभी कभी सीएस) के वितरण के लिए और उन उत्तेजनाओं (यानी, eyeblink प्रतिक्रिया) 10 पशु की प्रतिक्रिया के प्रसारण के लिए अनुमति देता है। तार में ही उत्तेजनाओं के प्रकार के आधार पर संशोधित किया जा सकता को जन्म दिया है और कैसे eyeblink प्रतिक्रिया दर्ज की गई है।

eyeblink कंडीशनिंग के लिए "स्वतंत्र रूप से आगे बढ़" सीमित चूहों का उपयोग करने के लिए कारण यह है कि चूहों संयम के खिलाफ संघर्ष है। हालांकि अन्य प्रजातियों के संयम के लिए उत्तरदायी हो सकता है, eyeblink कंडीशनिंग प्रयोगों में चूहों का उपयोग करने का प्रमुख लाभ यह है कि उपलब्ध आनुवंशिक रूप से संशोधित उत्परिवर्ती उपभेदों के बहुमत माउस उपभेदों हो रहा है। संघर्ष, पूर्ण संसाधन और अन्य विभागों के अलावाचूहों के traint गंभीर संकट में परिणाम है। एक सिर तय माउस तैयारी है कि तनाव को कम करता है शारीरिक जानकारी है कि eyeblink कंडीशनिंग के दौरान प्राप्त की जा सकती है वृद्धि होगी। उदाहरण के लिए, इस प्रणाली 2 फोटॉन माइक्रोस्कोपी 11 के साथ cortical न्यूरॉन्स की इमेजिंग की अनुमति होगी।

सिर से तय की तैयारी, हटाने योग्य कपाल प्रत्यारोपण के माध्यम से कोर्टेक्स के ऑप्टिकल इमेजिंग के लिए पिछले प्रयोगों में इस्तेमाल किया गया है tetrode सरणियों, दो photon कैल्शियम इमेजिंग के साथ कृंतक मस्तिष्क के विवो electrophysiological रिकॉर्डिंग में, और भी चूहों 11 में eyeblink कंडीशनिंग के लिए एक मंच के रूप में -16।

सिर तय प्रणाली, विश्वसनीय उत्तेजना और रिकॉर्डिंग माउस (चित्रा 2) का पूरा संयम के बिना सुनिश्चित कर रहे हैं। स्वतंत्र रूप से चलती प्रणाली में इस्तेमाल एक तरह एक टोप माउस की खोपड़ी से चिपका है। प्रशिक्षण के दौरान, टोप एक योजक है कि अधिक सलाखों से जुड़ा हुआ है पर चिपका हैआदेश में एक बेलनाकार ट्रेडमिल कृंतक के सिर (2A चित्रा) को स्थिर करने के लिए। बेलनाकार ट्रेडमिल माउस आराम से आराम करने की अनुमति देता है, लेकिन अगर माउस इसलिए चाहता है, यह भी इसे चलाने के लिए या चलने के लिए अनुमति देता है। इस प्रणाली के उपयोग के साथ, चूहों सीएस और अमेरिका के रूप में एक हल्के periorbital बिजली के झटके के रूप में एक गलमुच्छा कंपन (चित्रा 1) के साथ प्रशिक्षित किया जा सकता है। अमेरिका के तारों शल्य चिकित्सा द्वारा आंखों के लिए त्वचा के नीचे रखा पार्श्व के माध्यम से दिया जाता है। सीएस एक कंघी है कि एक 2-परत आयताकार झुकने actuator (चित्रा 2 बी) से जुड़ा हुआ है के माध्यम से वितरित किया जाता है। कंघी और झुकने actuator तो एक चुंबकीय आधार है कि प्रशिक्षण के दौरान उचित स्थिति के लिए ले जाया जाता है और प्रत्येक व्यक्ति पशु के लिए इष्टतम वितरण के लिए निकाला जाता है से जुड़े होते हैं। कंघी का चयन किया मूंछ पैर फैलाकर बैठना के लिए तैनात है। सीएस की डिलीवरी के दौरान, एक संकेत झुकने actuator कि कंघी विस्थापित और मूंछ 17 के कंपन करने के लिए सुराग के लिए भेजा है।

16,18,19 में चूहों में प्रभावी वातानुकूलित उत्तेजनाओं के रूप में इस्तेमाल किया गया है। कारण गलमुच्छा उत्तेजना इस प्रयोगात्मक प्रतिमान में सीएस के लिए चुना जाता है अन्वेषण के दौरान somatosensory जानकारी इनपुट के लिए उनकी दृढ़रोम पर murine जानवरों की निर्भरता है। गलमुच्छा उत्तेजना के लिए एक विश्वसनीय और प्रभावी सीएस 20 होना दिखाया गया है। इसके अलावा, अच्छी तरह से स्थापित और संगठित दृढ़रोम प्रणाली (यानी, बैरल कोर्टेक्स), गलमुच्छा उत्तेजना के cortical सब्सट्रेट के रूप में दिया सीएस cortical परिवर्तन और eyeblink कंडीशनिंग 20,21 सीखने के साथ जुड़े प्लास्टिसिटी मानचित्रण के लिए एक सुंदर उपकरण प्रदान करता है। एक सिर तय प्रणाली प्रेरित न्यूरॉन्स और गैर उत्तेजित मूंछ से जानकारी प्राप्त करने के न्यूरॉन्स के बीच प्रतिक्रियाओं की तुलना करने के लिए चुना मूंछ की सटीक उत्तेजना के लिए अनुमति देता है। अंत में, चूहों के कई उपभेदों उम्र से संबंधित सुनवाई हानि के रूप में अपेक्षाकृत युवा वयस्कों के लिए प्रदर्शन 16 के साथ मुद्दों उन्नति करता है)। गलमुच्छा उत्तेजना इन जटिलताओं के दोनों से प्रभावित नहीं है।

यहाँ प्रस्तुत सीएस और अमेरिका में प्रसव के लिए तरीकों सहित eyeblink कंडीशनिंग, के लिए अन्य सिर तय की तैयारियों पर अद्वितीय और महत्वपूर्ण संशोधन, और eyeblink प्रतिक्रिया का अधिग्रहण कर रहे हैं। इस तंत्र और eyeblink कंडीशनिंग में प्रशिक्षण प्रतिमान की विश्वसनीयता वातानुकूलित चूहों और pseudoconditioned नियंत्रण जानवरों (चित्रा 7A) से एक अपेक्षाकृत सपाट सीखने की अवस्था से घटता सीखने के द्वारा प्रदर्शन किया है।

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Protocol

चूहों को शामिल सभी प्रक्रियाओं स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थान द्वारा जारी किए गए दिशा-निर्देशों के आधार पर नॉर्थवेस्टर्न विश्वविद्यालय के संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित प्रोटोकॉल के अनुसार में प्रदर्शन कर रहे थे।

1. सिलेंडर (2A चित्रा)

  1. एक लंबे फोम सिलेंडर 14-15 से के रूप में Chettih एट अल। और Heiney एट अल द्वारा वर्णित सिलेंडर का निर्माण।। सिलेंडर के एक 10 सेमी लंबाई में कटौती और केंद्र के माध्यम से एक छेद ड्रिल धुरा, एक धातु की छड़ 12.7 व्यास में मिमी (0.5।) फिट करने के लिए। एक धातु ऑप्टिकल breadboard पर अपना धुरा के साथ सिलेंडर माउंट के रूप में Heiney एट अल। या किसी अन्य के समर्थन (जैसे, Plexiglas) 15 द्वारा वर्णित है।
  2. सिलेंडर के दोनों तरफ व्यास में 12.7 मिमी दो खड़ी धातु की छड़ खड़ा करना।
  3. धातु की छड़ पर दो सही कोण आरोह को संलग्न।
  4. सही कोण mounts के माध्यम से दो और छड़ (5 सेमी लंबा, व्यास में 12.7 मिमी) सुरक्षित। बेवल वेंई इन छड़ों से समाप्त हो जाती है और सिलेंडर (चित्रा 2 जी) के केन्द्र से ऊपर उनके सिरों के स्तर।
  5. ड्रिल और दो ​​4-40 मशीन शिकंजा उस जगह (चित्रा 2 जी) में कनेक्टर के पंखों आयोजित करेगा फिट करने की छड़ से लगाया सिरों के माध्यम से एक छेद नल।

2. कोडांतरण गलमुच्छा उत्तेजना प्रणाली (चित्रा 2 बी)

  1. एक नियमित रूप से बालों में कंघी से कंघी के एक 10 दांत खंड कट।
  2. एक भट्ठा कटौती के बारे में 2-3 मिमी चौड़ा और 5 मिमी के बारे कंघी एक 2-परत आयताकार झुकने actuator को स्वीकार करने के शीर्ष भाग पर गहरे।
  3. झुकने actuator के प्रत्येक सतह के लिए एक तार मिलाप। मिलाप और प्रवाह निर्माता द्वारा प्रदान का प्रयोग करें। actuator और विद्युत धारा से माउस और उपयोगकर्ता की रक्षा करने के लिए बिजली के टेप के साथ मिलाप कवर।
  4. भट्ठा कंघी में कटौती में actuator पट्टी पर्ची इतना है कि झुकने actuator पट्टी कंघी के विमान को सीधा बैठता है। कोण कंघी इतना है कि यह 4 में झुका हुआ है5 डिग्री और अधिक स्वाभाविक रूप से माउस के चेहरे की वक्र निम्नानुसार है।
  5. जल्दी से सेटिंग epoxy के साथ कंघी के शीर्ष करने के actuator पट्टी के अंत सुरक्षित।
    नोट: तारों के झुकने actuator पट्टी करने के लिए soldered एक रिओस्तात कि actuator के लिए 40 वोल्ट उद्धार करने के लिए जोड़ा जाना चाहिए। पिछले प्रयोगों से पता चला है कि 40 वोल्ट कंडीशनिंग के लिए प्रभावी है, लेकिन किसी भी डराना प्रतिक्रियाओं का आह्वान नहीं है।
  6. झुकने actuator और एक जंगम पर्वत पर कंघी रखें। एक पिपेट एक चुंबकीय आधार के रूप में सामान्य रूप से इन विट्रो इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी रिसाव के लिए इस्तेमाल करने के लिए संलग्न धारक अच्छी तरह से काम करता है।

3. कनेक्टर कि सिलेंडर के ऊपर छड़ के लिए mounts कोडांतरण (चित्रा -2 सी, 2 ई)

नोट: कनेक्टर एक 3 डी मुद्रित 7 छेद पट्टी Amphenol 221 श्रृंखला नायलॉन वीस और Disterhoft और Galvez एट अल द्वारा तार के लिए इस्तेमाल पट्टी से मॉडलिंग की है 10,17।

  1. एक 0-80 एक्स -1 के लिए पट्टी में पहला छेद ठोकर"मशीन पेंच। यह एक ताला पेंच कनेक्टर के लिए टोप लंगर के रूप में काम करेगा। क्रम में cyanoacrylic गोंद के साथ ताला लगा पेंच के सिर पर एक 0-80 अखरोट प्रत्यय हाथ से पेंच मोड़ की सुविधा के लिए।
  2. एक छेद टेप छेद के बाद खाली छोड़ दो (0-80 मशीन अखरोट के लिए कमरे की अनुमति के लिए) और शेष पाँच छेद के माध्यम से पांच सोना चढ़ाया relia टीएसी कुर्सियां ​​धक्का।
  3. कुर्सियां ​​के छोर तक पांच लंबे तारों (एक ईथरनेट केबल के तारों से प्राप्त) और मिलाप बंद कोटिंग पट्टी।
    नोट: पहले दो तारों electromyographic (ईएमजी) का संकेत है कि एक eyeblink प्रतिक्रिया संकेत छानने और एक एम्पलीफायर से प्रवर्धन निम्नलिखित का पता लगाने जाएगा रिकॉर्ड करने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा। दूसरा दो एक उत्तेजना अलगाने से सदमे संकेत वितरित करेंगे। पिछले तार एक जमीन कनेक्शन के रूप में काम करेगा। इन तारों से समय पर CS-अमेरिका प्रसव के लिए इस्तेमाल प्रणाली से जोड़ा जाएगा।
  4. तारों और एक mult साथ कुर्सियां ​​के बीच बिजली कनेक्टिविटी सुनिश्चितIMETER। निरंतरता की स्थापना पर मल्टीमीटर रखो और पिन और तार के छोर तक छीन अन्य जांच के लिए जांच में से एक को पकड़ो। पिन और तारों विद्युत जुड़े हुए हैं प्रतिरोध कम है और मल्टीमीटर एक स्वर उत्सर्जन करता है।
    1. वैकल्पिक रूप से, अगर मल्टीमीटर एक निरंतरता सेटिंग नहीं है, पिन और तारों के बीच प्रतिरोध को मापने। वहाँ बिजली निरंतरता है, तो वहाँ बहुत कम प्रतिरोध मापा जाता है।
  5. दो को-220 शैली ट्रांजिस्टर से कनेक्टर के पंखों तैयार करें। ट्रांजिस्टर के emitter, आधार, और कलेक्टर सुराग कट और सतह के स्तर इतना यह कनेक्टर से चिपका जा सकता है।
  6. छेद भंग करने के लिए इतना टैब पेंच के सिर के नीचे पर्ची कर सकते हैं बढ़ते टैब के किनारे कट।
  7. कनेक्टर के लिए ट्रांजिस्टर epoxy। बढ़ते टैब में छेद सिलेंडर के ऊपर छड़ को कनेक्टर सुरक्षित करने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा।
  8. तारों जनसंपर्क के आधार पर epoxy लागूकुर्सियां ​​से otruding और epoxy सूखे के लिए अनुमति देते हैं। epoxy बचाने और कनेक्शन की रक्षा करेगा।

4. टोप तैयारी (चित्रा 2 डी, 2 ई)

नोट:। टोप पट्टी एक 3 डी मुद्रित 7 छेद पट्टी Amphenol 221 श्रृंखला नायलॉन वीस और Disterhoft और Galvez एट अल 10,17 से टोप के लिए इस्तेमाल पट्टी से मॉडलिंग की है। यह टुकड़ा अब वाणिज्यिक रूप से निर्मित है। प्रिंटर फ़ाइल इस पत्रिका की वेबसाइट से डाउनलोड किया जा सकता है।

  1. एक 0-80 एक्स 1 "मशीन पेंच के लिए पट्टी में पहला छेद नल और एक छेद पहली छेद के बाद खाली छोड़ दें।
  2. (संकरा सिरों के माध्यम से) शेष पाँच छेद के नीचे के माध्यम से पांच सोना चढ़ाया पिन पुश। पट्टी में पिन धकेलने के समान रूप से की सुविधा के लिए एक शिकंजा प्रयोग करें।
  3. एक थर्मल खाल उधेड़नेवाला का उपयोग करना, (में 0,005। व्यास) एक स्टेनलेस स्टील के तार के अंत बंद polyimide कोटिंग के बारे में 0.5 सेमी हटाने, w के अंत छीन मिलापपिंस में से एक का उद्घाटन करने के लिए गुस्सा और 0.6-0.7 सेमी करने के लिए तार काट दिया।
  4. तार के अंत से 0.2 सेमी के बारे में पट्टी जानवर को पारित करने के लिए वर्तमान की अनुमति है।
  5. दोहराएँ शेष तीन तारों के लिए 4.3-4.4 कदम।
    नोट: पहले दो तारों ईएमजी प्रतिक्रियाओं को रिकॉर्ड जबकि दूसरा दो पशु के लिए एक आघात देने के लिए की सेवा करेंगे।
  6. पिछले (पांचवें) तार एक जमीन तार के रूप में काम करेगा के रूप में, uncoated स्टेनलेस स्टील के तार के बारे में 5 सेमी कटौती (0.005 में। व्यास), और शेष पिन करने के लिए मिलाप।
  7. तारों और एक मल्टीमीटर के साथ पिन के बीच निरंतरता सुनिश्चित करें। (जमीन के तार, जो uncoated है के मामले में, मल्टीमीटर जांच तार के साथ कहीं भी रखा जा सकता है।)

5. शल्य चिकित्सा की तैयारी (चित्रा 2 एफ)

  1. सभी सर्जिकल उपकरण जीवाणुरहित, टोप भी शामिल है। शराब में भिगोने और फिर बाँझ खारा के साथ rinsing द्वारा टोप जीवाणुरहित।
  2. 3-4% वी के साथ एक प्रेरण कक्ष में माउस anesthetizeisoflurane प्रति मिनट ऑक्सीजन की 1-2 एल के प्रवाह की दर के साथ मिश्रित aporized।
  3. पता लगाना है कि जानवर एक पैर की अंगुली चुटकी के साथ पूरी तरह से anesthetized है। माउस जब यह पैर के अंगूठे चुटकी करने के लिए reflexively जवाब नहीं है पूरी तरह से anesthetized है।
  4. एक बार जानवर पूरी तरह से anesthetized किया गया है, एक एनाल्जेसिक (0.05-2 मिलीग्राम / किग्रा, अनुसूचित जाति) के रूप में buprenorphine हाइड्रोक्लोराइड की एक खुराक इंजेक्षन, पशु के सिर के ऊपर दाढ़ी, stereotaxic फ्रेम के आधार पर एक कवर हीटिंग पैड पर जगह , पता लगाना है कि जानवर पूरी तरह से anesthetized है, और फ्रेम करने के लिए सिर सुरक्षित। जानवर को वाष्पीकृत isoflurane के प्रवाह को बनाए रखने के लिए, प्रति मिनट ऑक्सीजन की 1-2 एल के प्रवाह की दर पर 2% करने के लिए स्विच। कॉर्निया को नेत्र मरहम की एक छोटी राशि लागू करें।
  5. povidone आयोडीन और शराब तीन बार प्रत्येक के साथ खोपड़ी कीटाणुरहित, दोनों के बीच बारी।
  6. एक नंबर 10 या 15 स्केलपेल ब्लेड के साथ, टी के सामने से खोपड़ी को प्रकाश में लाने, खोपड़ी के midline के साथ एक चीरा बनानेपिछले interparietal हड्डी (~ 1.5-2 सेमी) करने के लिए वह आँखें।
  7. सूक्ष्म क्लिप के साथ त्वचा का फ्लैप वापस पकड़। द्विपक्षीय खोपड़ी के पीछे (यानी, सभी में छह क्लिप का उपयोग) पर आंख के ऊपर एक क्लिप, व्याख्यान चबूतरे वाला दुम अक्ष के बीच के साथ एक है, और एक ही जगह। आदेश टोप अलगाव को रोकने के लिए, संभव के रूप में खोपड़ी के रूप में ज्यादा के पक्ष और वापस सहित बेनकाब। यह चिपकने वाला वीणा करना सीमेंट के आवेदन के लिए सतह क्षेत्र में वृद्धि होगी।
  8. छुरी का प्रयोग, खोपड़ी periosteum हटाने और एक साफ और शुष्क सतह काम सुनिश्चित करने के शीर्ष के साथ परिमार्जन। 3% हाइड्रोजन पेरोक्साइड तीन बार के साथ खोपड़ी के शीर्ष साफ करें।
  9. एक आकार 34 उल्टे शंकु गड़गड़ाहट या 1.6 मिमी उत्कीर्णन कटर ड्रिल बिट के साथ खोपड़ी में दो छेद ड्रिल 00-90 शिकंजा स्वीकार करने के लिए (में 0.0625। लंबे)। शिकंजा बिजली जमीन कनेक्शन प्रदान करेगा। शीर्षस्थान के सामने एक छेद है, और Lambda के सामने अन्य जगह, midline के छोड़ दिया जब righ कंडीशनिंगटी आंख। प्रत्येक छेद में एक पेंच रखें। पेंच 0.28 मिमी प्रत्येक पूर्ण बारी के लिए खोपड़ी में कम; दो पूर्ण बदल जाता है पर्याप्त है।
  10. आदेश में सीमेंट की सतह क्षेत्र और पकड़ शक्ति को बढ़ाने के लिए खोपड़ी पर व्यास में लगभग 0.75 मिमी के कई छोटे divots बनाएँ।
  11. पूरा टोप ले लो और दो शिकंजा चारों ओर एक आंकड़ा आठ विन्यास में तार जमीन से हवा। कुछ सुस्त (~ टोप और पेंच के बीच 1.5 सेमी) जमीन तार में इतना टोप ठीक से बाद में तैनात किया जा सकता अनुमति दें।
    नोट: आठ आंकड़ा आम तौर पर तार और जमीन शिकंजा के बीच एक अच्छा विद्युत कनेक्शन सुनिश्चित करता है। तार भी पेंच करने के लिए soldered जा सकती है एक बिजली के कनेक्शन सुनिश्चित करने के लिए।
  12. चिपकने वाला वीणा करना सीमेंट लागू करें। चिपकने वाला वीणा करना सीमेंट के मिश्रण के लिए निर्माता के निर्देशों का पालन करें या सर्दी चीनी मिट्टी के मिश्रण डिश में एल पाउडर मिश्रण के 4 scoops, आधार के 8 बूँदें, और उत्प्रेरक के 2 बूँदें मिश्रण (सुनिश्चित तापमान पट्टी ओn मिश्रण पकवान पूरी तरह से काला है।) ठंडे तापमान सीमेंट का काम समय फैली हुई है।
    1. कोट खोपड़ी और वीणा करना सीमेंट के साथ उदारतापूर्वक शिकंजा और सीमेंट सुखाने के लिए अनुमति देते हैं। यह केवल कुछ मिनट लग चाहिए।
  13. बाद सीमेंट सूख गया है, पिन खड़े, खोपड़ी के ऊपर के साथ खड़ी टोप स्थिति। एक धारक कनेक्टर के समान के साथ जगह में टोप पकड़ो
    नोट: देखें "3. कनेक्टर कोडांतरण" -इस धारक की जरूरत ही होना सोना चढ़ाया कुर्सियां ​​के साथ एक पांच छेद पट्टी आदेश टोप की पिन प्राप्त करने के लिए। धारक stereotaxic फ्रेम पर एक हाथ से जुड़ी है। धारक और हाथ का उपयोग टोप और तारों की स्थिति की सुविधा।
  14. बाद टोप तैनात किया गया है, periorbital क्षेत्र के आसपास की त्वचा वापस छील और दो सदमे तारों की स्थिति 0.2 सेमी अंत छीन ey करने के लिए त्वचा के नीचे आराम करने के लिए और लगभग 2-4 मिमी सीधे दुम अनुमति देने के लिएई। दो तारों के सिरों एक दूसरे को स्पर्श करने के लिए अनुमति न दें। थैली ऊपर पेशीय orbicularis oculi पर दो ईएमजी तारों की स्थिति।
    1. यदि आवश्यक हो, तारों के सिरों काट अगर वे भी लंबे समय से कर रहे हैं और जैसे कि वे कक्षा सीधे खरोंच और संक्रमण में परिणाम हो सकता है लगता है। तार के सिरों को काटने हैं, तो सुनिश्चित करें कि पर्याप्त नंगे उजागर तार। वैकल्पिक रूप से, अगर तारों भी लंबे समय लगता है, आधार है, जहां वे टोप से बाहर विस्तार पर वापस तार मोड़।
    2. तारों के आधार सीमेंट (यानी, टोप के पास अंत) चिपकने वाला वीणा करना सीमेंट की एक छोटी प्रसार के साथ खोपड़ी पर जगह में और सुखाने के लिए (भाग पहले वर्णित के उपयोग के आधा) की अनुमति है।
  15. सूक्ष्म क्लिप निकालें और धीरे त्वचा के फ्लैप वापस सीमेंट पर मोड़ो। पलक की विकृति से बचने के लिए त्वचा स्वाभाविक क्रम में व्यवस्थित करने के लिए त्वचा के किसी भी हिस्से पर तनाव को रोकने के लिए अनुमति दें, eyeblink प्रतिक्रिया की रोकथाम,और पशुओं के लिए संकट।
  16. दंत सीमेंट के साथ उजागर क्षेत्र सील, सीमेंट के साथ टोप के शीर्ष के किनारे करने के छिन्न त्वचा से सब कुछ कवर। आँखें या टोप की पिन पर सीमेंट टपकता से बचने के लिए अतिरिक्त ख्याल रखना। आंशिक रूप से ठीक सीमेंट smoothed और एक कपास झाड़ू कि दंत सीमेंट विलायक के साथ घटा है के साथ छेड़छाड़ कर सकते हैं। सीमेंट टोप धारक को हटाने से पहले पूरी तरह से सूखे की अनुमति दें।
  17. जानवर जानवर अपने पिंजरे में वापस जगह से पहले एक गर्म सतह पर संज्ञाहरण से उबरने के लिए अनुमति दें। Metacam (1 मिलीग्राम / किग्रा, वर्ग) प्रशासन और फिर जानवर अपने पिंजरे में वापस जगह है।
  18. परीक्षण या प्रशिक्षण से पहले जानवरों की वसूली के 5-7 दिनों की अनुमति दें। अपनी संस्था के दिशा निर्देशों के अनुसार पशु करने के लिए मानक पोस्ट ऑपरेटिव देखभाल बनाए रखें। पशु कम से कम एक बार प्रति दिन जाँच की जानी चाहिए के बाद यह सर्जरी से बरामद किया है। गरीब खाने और / या पीने और उदासीन व्यवहार के संकेत के लिए देखो। दर्द तोसंदेह है, Metacam हर 24 घंटा (के बाद सर्जरी के अंत में एक ही खुराक) प्रदान करते हैं जब तक क्रमशः समाप्त। Lidocaine स्थानीय स्तर पर घाव अगर पशु scratching या बेचैनी के लक्षण दिखाता है के लिए लागू किया जा सकता है।

6. सिलेंडर और प्रशिक्षण (चित्रा 2 जी) पर माउस रखने के

  1. सिलेंडर पर माउस जगह करने के लिए, एक हाथ से पूंछ द्वारा पकड़े और उसके बाद तर्जनी और अंगूठे के साथ दूसरे के साथ कंधे के पीछे माउस लोभी द्वारा एक हाथ संक्षिप्त के साथ माउस को नियंत्रित। माउस के पेट और धड़ के आसपास शेष उंगलियों लपेटें।
  2. हाथ माउस निरोधक नहीं के साथ, माउस के सिर पर टोप करने के लिए कनेक्टर देते हैं और ताला लगा पेंच की बारी है।
  3. सिलेंडर पर धीरे माउस प्लेस और यह जगह में पकड़ जबकि फ्रेम करने के लिए कनेक्टर संलग्न। सिलेंडर के ऊपर सलाखों के लिए कनेक्टर दृढ़ करने के लिए दो शिकंजा प्रयोग करें।
  4. एक बार जब कनेक्टर सिलेंडर फ्रेम करने के लिए सुरक्षित किया गया है, releमाउस पर पकड़ एएसई। माउस सिलेंडर के लिए आदी होना के दो सत्रों में से एक दिन दे। प्रत्येक आदी होना सत्र प्रत्येक कंडीशनिंग सत्र रूप में इसी अवधि की अनुमति दें।
    1. आदी होना दौरान रिकार्ड सहज झपकी दर और पूर्व बेनकाब आदेश डराना प्रतिक्रियाओं की घटना को कम करने के लिए गलमुच्छा कंपन सीएस को चूहों। सीएस एक वास्तविक कंडीशनिंग सत्र के दौरान के रूप में लागू है, लेकिन बिजली के बिना अमेरिका को झटका।
    2. माउस के वातानुकूलित ओर करने के लिए Piezo प्रणाली बंद (लगभग 0.5 सेमी) (दाईं ओर) रखकर जबकि व्यक्तिगत मूंछ से ज्यादा कंघी के दांत फिसल द्वारा गलमुच्छा उत्तेजना सीएस को लागू करें। सुनिश्चित करें कि एक ही मूंछे दिन से दिन में एक ही स्थिति में Piezo प्रणाली रखकर दिन से दिन प्रेरित कर रहे हैं।
  5. शास्त्रीय कंडीशनिंग पर माउस प्रशिक्षण शुरू। पांच दिनों के लिए प्रति दिन के प्रशिक्षण के दो सत्रों के उद्धार। प्रत्येक प्रशिक्षण सत्र के बीच लगभग दो घंटे तक छोड़ दें।
    1. वातानुकूलित समूह, डेली के लिए(- 3 मा, एक डब्ल्यूपीआई A385R उत्तेजना अलगाने से बचाया 0.3 मा) एक 250 मिसे लंबे गलमुच्छा कंपन सीएस (60 हर्ट्ज) एक 100 मिसे लंबे समय से बिजली पल्स अमेरिका के साथ रखा के प्रति सत्र तीस परीक्षणों देखें। एक 250 मिसे लंबे प्रोत्साहन मुक्त अंतराल का पता लगाने के साथ सीएस और हमें अलग (चित्रा 1) 23 कार्य हिप्पोकैम्पस पर निर्भर बनाने के लिए।
    2. इतना है कि एक झपकी पैदा किया जाता है प्रत्येक जानवर के लिए बिजली के झटके की तीव्रता को समायोजित करें। 30-60 सेकंड के एक यादृच्छिक intertrial अंतराल के साथ अलग परीक्षणों (45 सेकंड, प्रति सत्र 30 मिनट की कुल अवधि के औसत।)
    3. अकेले तीस unpaired सीएस उद्धार और हमें अकेला परीक्षणों प्रत्येक pseudoconditioned समूह के लिए, के रूप में वातानुकूलित समूह के लिए कहा गया है एक ही प्रोत्साहन मापदंडों का उपयोग (साठ परीक्षणों की कुल के लिए)। सुनिश्चित करें कि सीएस अकेले और हमें अकेला परीक्षणों ऐसे pseudorandomized कर रहे हैं कि कोई प्रोत्साहन एक पंक्ति में दो बार से अधिक प्रस्तुत किया है। 22.5 सेकंड के एक औसत intertrial अंतराल के साथ प्रत्येक परीक्षण अलग करें।
  6. डेआदेश में आदी होना और प्रशिक्षण के दौरान 65 डीबी पर जिगर पृष्ठभूमि शोर गलमुच्छा उत्तेजक द्वारा उत्पन्न कंपन के किसी भी शोर मुखौटा करने के लिए।

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Representative Results

8-10 सप्ताह पुराने पुरुष C57BL6 / जम्मू चूहों सिर तय बेलनाकार ट्रेडमिल तंत्र पर ट्रेस eyeblink कंडीशनिंग पर प्रशिक्षित किया गया। 8 चूहों बनती CS-अमेरिका प्रस्तुतियों (वातानुकूलित समूह) और 9 चूहों के साथ प्रशिक्षण दिया गया unpaired सीएस और अमेरिका प्रस्तुतियों (pseudoconditioned समूह) के साथ प्रशिक्षित किया गया।

एक वातानुकूलित माउस से एक वातानुकूलित प्रतिक्रिया का उदाहरण ईएमजी रिकॉर्डिंग आंकड़े 3 और 4 में दिखाया जाता है। प्रत्येक परीक्षण के लिए ईएमजी रिकॉर्डिंग सुधारा गया और एक 10 मिसे लगातार समय के साथ एकीकृत। चित्रा 5 से पता चलता सुधारा और एकीकृत ईएमजी प्रतिक्रिया निशान दोनों एक वातानुकूलित (ए) के लिए 10 सत्रों और एक pseudoconditioned (बी) माउस से प्रत्येक के लिए सभी परीक्षण के पार औसत। वातानुकूलित प्रतिक्रियाओं का विकास चित्रा 5 ए में देखा जा सकता है, प्रतिक्रियाओं अमेरिका के शुरू होने के करीब बड़ा हो रही है। यह विकास मैंने नहीं देखा हैn pseudoconditioned चित्रा 5 ब में हिमायती हैं।

के विकास अच्छी तरह से समय, और इस तरह, अच्छी तरह से सीखा वातानुकूलित प्रतिक्रियाएं भी चित्रा 6 में देखा जा सकता है। चित्रा 6 सीएस शुरुआत के बाद प्रतिक्रिया के शिखर के लिए समय की histograms पता चलता है। सीएस शुरू होने के बाद 150 मिसे - वहाँ 0 के बीच ग्राफ में एक प्रारंभिक चोटी है। यह प्रारंभिक चोटी के रूप में जल्दी सत्र 1. अधिक प्रशिक्षण सत्र के साथ के रूप में देखा जा सकता है, वहाँ 400-500 वातानुकूलित जानवरों के बीच मिसे के बीच ग्राफ में एक दूसरे चोटी के विकास के लिए बेहतर समय पर वातानुकूलित प्रतिक्रियाओं के विकास का संकेत है।

चित्रा 7A वातानुकूलित और pseudoconditioned चूहों से दर्ज औसतन प्रतिशत अनुकूली वातानुकूलित प्रतिक्रियाओं से पता चलता है। अनुकूली वातानुकूलित प्रतिक्रियाएं महत्वपूर्ण गतिविधि है कि वर्तमान में कम से कम 20 मिसे BEF है माना जाता हैअयस्क अमेरिका शुरुआत (यानी, सीएस शुरू होने से पहले कम से कम 4 एसडी मतलब गतिविधि से अधिक वर्तमान 250 मिसे)। प्रशिक्षण सत्र के दौरान, वातानुकूलित चूहों प्रत्येक प्रशिक्षण सत्र के साथ और अधिक वातानुकूलित अनुकूली प्रतिक्रियाओं का प्रदर्शन इतना है कि वातानुकूलित चूहों pseudoconditioned चूहों (समूहों, एफ (1,15) = 20.62, पी की तुलना में काफी अधिक अनुकूली वातानुकूलित प्रतिक्रियाओं का प्रदर्शन द्वारा कंडीशनिंग प्रतिमान की क्रमिक सीखने से पता चला <.0005; सत्र, एफ (1,9) = 9.987, पी <0.0001, समूहों * सत्र, एफ (1,9) = 5.977, पी <.0001)। ध्यान दें कि pseudoconditioned समूह आम तौर पर परीक्षण के कम से कम 20% पर छद्म गोपनीय रिपोर्ट का प्रदर्शन किया।

चित्रा 7B दस प्रशिक्षण सत्रों में दोनों वातानुकूलित और pseudoconditioned चूहों के लिए औसत वातानुकूलित प्रतिक्रिया क्षेत्र (सुधारा और एकीकृत ईएमजी प्रतिक्रिया की वक्र के तहत क्षेत्र) से पता चलता। एक दोहराया उपायों एनोवा लास ओवर के साथ योजना बनाई तुलनाटी चार सत्रों (यानी, सत्र 7-10, एक बार वातानुकूलित समूह 60% सीआर के एक सीखने की कसौटी पर पहुंच गया था) समूह की एक महत्वपूर्ण मुख्य प्रभाव दिखाने के लिए, यह दर्शाता है कि सीआर क्षेत्र pseudoconditioned समूह पद सीखने की तुलना में वातानुकूलित समूह में बड़ा था कसौटी (समूहों, एफ (1,14) = 5.733, पी <.05; सत्र, एफ (1,3) = 0.486, एन एस, समूहों * सत्र, एफ (1,3) = 0.432, एन एस)।

चित्रा 7C वातानुकूलित और pseudoconditioned चूहों से दर्ज औसतन प्रतिशत अल्फा (डराना) प्रतिक्रियाओं से पता चलता है। अल्फा प्रतिक्रियाएं कि कम से कम मतलब आधारभूत गतिविधि के ऊपर 4SD थे सीएस शुरुआत के 50 एमएस के भीतर गतिविधि कर रहे हैं। प्रशिक्षण सत्र के दौरान, वातानुकूलित और pseudoconditioned चूहे आम तौर पर परीक्षण के कम से कम 25% पर अल्फा प्रतिक्रियाओं का प्रदर्शन किया, वातानुकूलित और pseudoconditioned चूहों (समूहों, एफ (1,15) = 2.502, एन एस) के बीच कोई महत्वपूर्ण अंतर के साथ। गुई दोहराया उपायों एनोवा किया था, हालांकि, समूहों और सत्र की एक महत्वपूर्ण बातचीत pseudoconditioned प्रतिक्रियाओं में कमी और वातानुकूलित चूहों के लिए 25% के बारे में अल्फा प्रतिक्रियाओं के रखरखाव (समूहों * सत्र, एफ (1,9) = 2.074 के कारण का पता चलता है पी <.05)। सत्र के दौरान 10 अल्फा प्रतिक्रियाओं में वृद्धि अच्छी तरह से विकसित सीआर से कम शुरुआत विलंबता के कारण होने की संभावना है।

चित्रा 7 दिन के औसत प्रतिशत कम विलंबता प्रतिक्रिया चूहों के दोनों समूहों से दर्ज चलता। कम विलंबता प्रतिक्रियाओं सीएस शुरुआत मतलब आधारभूत गतिविधि के ऊपर 4SD था निम्नलिखित 50-70 एमएस के बीच गतिविधि परिलक्षित। सत्र, एफ (1,9) = 3.920, पी, ए दोहराया उपायों एनोवा कि वातानुकूलित जानवरों दस प्रशिक्षण सत्रों में pseudoconditioned जानवरों से भी अधिक कम विलंबता प्रतिक्रियाओं का प्रदर्शन (समूहों, एफ (1,15) = 5.377, पी <.05 का पता चला <0.0005, समूहों * सत्र, एफ (1,9) = 3.158, पी <.005)। टीउसकी सीआर के पहले के एक शुरुआत के समय को प्रतिबिंबित हो सकता है, के रूप में वातानुकूलित समूह प्रत्येक प्रशिक्षण सत्र के साथ बड़ा गोपनीय रिपोर्ट का प्रदर्शन किया।

आकृति 1
चित्रा 1:। ट्रेस eyeblink कंडीशनिंग प्रतिमान ट्रेस eyeblink कंडीशनिंग में, एक अहानिकर वातानुकूलित प्रोत्साहन (सीएस) एक हल्का हानिकारक असुविधाजनक प्रोत्साहन (अमेरिका) के साथ रखा जाता है एक eyeblink प्रतिक्रिया के लिए प्रेरित करने का मतलब है। सीएस और अमेरिका एक प्रोत्साहन मुक्त अस्थायी अंतर से अलग हो रहे हैं, प्रतिमान हिप्पोकैम्पस पर निर्भर 23 बना रही है। प्रतिमान यहाँ वर्णित में, एक 250 मिसे लंबे गलमुच्छा कंपन सीएस एक 100 के साथ जोड़ा जाता है मिसे लंबे periorbital अमेरिका झटका। सीएस और अमेरिका एक 250 मिसे लंबे अंतराल के लौकिक से अलग होती है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।


चित्रा 2:। सिर से तय तैयारी एक, सिर तय सिलेंडर, गलमुच्छा उत्तेजक, और कनेक्टर संकेत दिया बी, दो परत झुकने actuator और कंघी संकेत दिया साथ गलमुच्छा उत्तेजक साथ eyeblink कंडीशनिंग के लिए सेट अप।। सी, अलग अलग हिस्सों के साथ कनेक्टर संकेत दिया: पेंच ताला लगा, 7-छेद पट्टी, तारों तारों संरक्षित करने के लिए कुर्सियां ​​और epoxy के लिए soldered, पंखों के एक करने के लिए 220 शैली ट्रांजिस्टर डी से परिवर्तित, व्यक्ति के साथ बुद्धि। भागों संकेत दिया: 7-छेद पट्टी, पिन, और तारों uncoated स्टेनलेस स्टील के तार जमीन सहित पिन, में soldered, और व्यक्तिगत सदमे और ईएमजी स्टेनलेस स्टील के तारों, polyimide कोटिंग की 0.2 सेमी अंत उतारे साथ ई। , दोनों कनेक्टर और के लिए 7-छेद पट्टी में एक छेद के लिए विन्यासटोप। एफ, एक शल्य चिकित्सा प्रत्यारोपित टोप। जी, एक माउस सिलेंडर पर रखा गया है, प्रशिक्षित किया जा करने के लिए तैयार के साथ एक माउस। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3:। उदाहरण ईएमजी रिकॉर्डिंग नीली लाइनों सीएस प्रस्तुति (250 मिसे लंबे) चित्रित करना। लाल लाइनों अमेरिका प्रस्तुति, जो विरूपण साक्ष्य है कि बिजली के झटके (100 मिसे) से आता है पता चलता चित्रित करना। सीएस और अमेरिका एक 250 मिसे प्रोत्साहन मुक्त अंतराल से अलग होती है। भीतर इस उत्तेजना से मुक्त अंतराल उच्च आयाम EMG गतिविधि (आधारभूत के सापेक्ष) जो एक सीआर रूपरेखा बनाती है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें। </ A>

चित्रा 4
चित्रा 4:। उदाहरण ईएमजी और इसी ऑप्टिकल अवरक्त प्रतिबिंब रिकॉर्डिंग ईएमजी रिकॉर्डिंग बस के रूप में प्रतिक्रिया चोटी (लाल रेखा) के लिए वातानुकूलित प्रतिक्रिया शुरुआत (ब्लू लाइन), विलंबता का पता लगाने में ऑप्टिकल अवरक्त प्रतिबिंब संवेदक, और असुविधाजनक eyeblink प्रतिक्रिया शुरुआत (के रूप में सही है गुलाबी लाइन)। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5
चित्रा 5:। औसतन eyeblink निशान सुधारा और एक वातानुकूलित माउस (ए) और एक pseudoconditioned माउस (बी) के लिए eyeblink प्रतिक्रिया के एकीकृत निशान औसत। प्रत्येक ट्रेस औसत का प्रतिनिधित्वएक ही सत्र खत्म सभी परीक्षणों के लिए माउस का जवाब नहीं। नीले खंड गलमुच्छा कंपन सीएस प्रस्तुति के दौरान प्रतिक्रिया का प्रतिनिधित्व करता है। लाल खंड प्रोत्साहन मुक्त अंतराल का पता लगाने के दौरान प्रतिक्रिया का प्रतिनिधित्व करता है। एक में, सदमे अमेरिका एक विरूपण साक्ष्य है कि पता लगाने के अंतराल के बाद गहरे भूरे रंग के क्षेत्र के दौरान मौजूद है प्रेरित किया। बी गलमुच्छा कंपन सीएस केवल करने के लिए प्रतिक्रियाओं से पता चलता है। अकेले सीएस की प्रस्तुति और हमें अकेला परीक्षणों pseudoconditioning में pseudorandomized किया गया था। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 6
। चित्रा 6: रिस्पांस पीक समय सभी के लिए प्रतिक्रिया पीक करने के लिए समय के histograms के histograms वातानुकूलित (एन = 8; नीले बार) और 8 सब टीआर के लिए pseudoconditioned (लाल बार) पशुसभी सत्रों के ials (एक pseudoconditioned माउस से डेटा समूहों के बीच प्रतिक्रियाओं की संख्या के एक प्रत्यक्ष तुलना अनुमति देने के लिए बाहर रखा गया था)। बैंगनी सलाखों से संकेत मिलता है जहां वातानुकूलित और pseudoconditioned जानवरों ओवरलैप। रिस्पांस पीक समय सीएस और अमेरिका के बीच शुरू होने सुधारा और एकीकृत ईएमजी रिकॉर्डिंग की सबसे बड़ी चोटी के समय के रूप में गणना कर रहे हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 7
चित्रा 7: वातानुकूलित पशु की प्रतिक्रिया घटता (एन = 8, नीले घटता) और pseudoconditioned जानवरों (एन = 9; लाल घटता)। ए, 10 प्रशिक्षण सत्रों में वातानुकूलित और pseudoconditioned जानवरों के लिए प्रतिशत औसत अनुकूली वातानुकूलित प्रतिक्रियाओं (± SEM)। बी, औसतन क्षेत्र वातानुकूलित लिए सीआर का (± SEM)और 10 प्रशिक्षण सत्रों से अधिक पशुओं pseudoconditioned। सी, वातानुकूलित और pseudoconditioned जानवरों के लिए प्रतिशत औसत अल्फा रिस्पांस (± SEM) के 10 से अधिक प्रशिक्षण सत्र। वातानुकूलित लिए डी, प्रतिशत औसत कम विलंबता प्रतिक्रियाओं (SEM ±) और 10 सत्रों में pseudoconditioned। कृपया यहाँ क्लिक करें यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए।

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Discussion

शास्त्रीय eyeblink कंडीशनिंग साहचर्य सीखने की है कि सीखने और स्मृति अंतर्निहित तंत्रिका substrates समझने के लिए एक उपयोगी उपकरण है का एक रूप है। पिछला चूहों जैसे कृन्तकों में eyeblink कंडीशनिंग के लिए नियोजित तरीके एक कक्ष है कि जानवर के बारे में आसानी से ले जाने के लिए अनुमति दी शामिल किया गया। चूहों में eyeblink कंडीशनिंग के लिए एक सिर तय तैयारी, उपकरण सीगल एट अल। में Chettih एट अल। और Heiney एट अल। और सबसे हाल ही में उपयोग किया द्वारा वर्णित प्रकाश पैदा ट्रेस eyeblink कंडीशनिंग में उपयोग करते हुए इस तरह के कुछ के लिए अनुमति के रूप में कई लाभ प्रदान करता है प्रक्रियाओं और प्रयोगों eyeblink कंडीशनिंग है कि संभव नहीं किया गया था या अतीत में सीमित कर दिया गया था (जैसे, विवो दो photon कैल्शियम इमेजिंग में) 14-16 के दौरान प्रदर्शन किया जाएगा। तैयारी इस प्रकार का भी इस तरह के tetrode सरणियों के साथ इन विवो इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी के रूप में अन्य तकनीकों के उपयोग की सुविधा। चूहों distre बनने के लिए दिखाई देते हैंसंयम से ssed, इस सिर तय तैयारी सिर सुरक्षित रखने के लिए जब आवश्यक संयम की मात्रा को कम करने के लिए विकसित किया गया था। जबकि इस तैयारी चूहों एक बेलनाकार ट्रेडमिल पर ambulate करने के लिए अनुमति देता है, दूसरों को भी सफलतापूर्वक सिर से तय चूहों से व्यवहार डेटा एक स्थायी मंच 24 पर एकत्र किया है।

कर रहे हैं, हालांकि, कुछ मुद्दों है कि सिर से तय सिलेंडर प्रणाली के उपयोग के साथ उत्पन्न होती हैं। एक चिंता का विषय है कि जब एक शुरू में सिलेंडर पर एक अप्रशिक्षित माउस देता है, यह जानने के आराम करने के लिए चलना, या उपन्यास तंत्र पर चलाने के लिए कुछ समय की जरूरत हो सकती है। ज्यादातर चूहों आराम करने के लिए जल्दी सीखते हैं, चलना, या आराम से सिलेंडर पर चलाते हैं। दो आदी होना सत्र सिलेंडर के लिए चूहों accustom करने में मदद मिलेगी और दूसरे सत्र के मध्य तक, सबसे चूहों सिलेंडर पर आराम कर रहे हैं। एक और चिंता यह है कि उठता है टोप अलगाव है। बहु दिवसीय प्रशिक्षण सत्र के दौरान अतीत में इस के साथ कुछ समस्या है, लेकिन चिपकने वाला वीणा करना सी का उपयोग नहीं किया गया हैement टोप अलगाव के साथ मुद्दों ameliorated गया है। चिपकने वाला वीणा करना सीमेंट का उपयोग इस तकनीक का उपयोग करने के बाद से 50 से अधिक सर्जरी से 0% टोप avulsions में हुई है। सही उपयोग और कपाल पर सीमेंट की पर्याप्त प्रसार के साथ, शोधकर्ताओं टोप अलगाव के साथ कोई समस्या का सामना करना चाहिए। अंत में, आदी होना सत्र के दौरान सीएस पेश करके, वहाँ अव्यक्त निषेध के बारे में कुछ चिंता का विषय हो सकता है। यह स्पष्ट है, तथापि, कि चूहों को सफलतापूर्वक वातानुकूलित थे (7 चित्रा देखें)। ध्यान दें कि गलमुच्छा कंपन की तीव्रता वोल्टेज की राशि बदलते रिओस्तात द्वारा पारित किया जा रहा द्वारा संशोधित किया जा सकता है। चूहों को जानने के लिए असमर्थ हैं, तो वोल्टेज सफल कंडीशनिंग का समर्थन करते हुए भी डराना प्रतिक्रियाओं को न्यूनतम बढ़ाया जा सकता है। शोधकर्ताओं ने यह भी बिजली के झटके अमेरिका के प्रकार है कि पशु के लिए दिया जाता है बदल सकते हैं। बिजली के झटके अमेरिका एक भी बिजली नाड़ी स्थायी 100 मिसे के रूप में यहां सूचना दी जा सकती है। वैकल्पिक रूप से, वें के रूप मेंई उत्तेजना अलगाने इस प्रोटोकॉल में उपयोग किया, शोधकर्ताओं ने यह भी 120 हर्ट्ज के लिए एक प्रभावी बिजली के झटके अमेरिका के लिए पल्स प्रति 1 मिसे पर 6 biphasic पल्स जोड़े को रोजगार के रूप में अच्छी तरह से कर सकते हैं biphasic दालों संचारित करने में सक्षम है।

Boele एट अल। संभावना है कि कुछ "वातानुकूलित जवाब" डराना (अल्फा) से उत्पन्न हो सकती सीएस या कम विलंबता प्रतिक्रियाएं (एसएलआर) 25 के लिए प्रतिक्रियाओं का संकेत दिया। अल्फा प्रतिक्रियाओं सीएस शुरू होने के बाद एक 50 मिसे विलंबता के भीतर तेजी से पलक बंद होने को माना जाता है। चूहे अक्सर रखने के लिए उनकी आंखों परीक्षण की अवधि के लिए बंद कर दिया, इस अल्फा प्रतिक्रिया के बाद। एसएलआर, दूसरे हाथ पर, सीएस शुरुआत से 50-70 मिसे के एक विलंबता है और आम तौर पर केवल कुछ ही सीएस अमेरिका pairings के बाद उत्पन्न होती हैं। दोनों अल्फा और एसएलआर और तथ्य यह है कि एसएलआर केवल कुछ सीएस अमेरिका pairings के बाद पैदा कर सकते हैं की शुरुआत करने के लिए कम विलंबता संकेत मिलता है कि वे संभावना हिप्पोकैम्पस अनुमस्तिष्कीय circuitry से प्रेरित नहीं कर रहे हैं। इन टिप्पणियों Boele एट अल द्वारा की समीक्षा की। टीherefore की गोपनीय रिपोर्ट यहाँ दर्ज की प्रतिक्रियाएं सीख रहे हैं कि क्या सवाल भीख माँगती हूँ। चित्रा 7 और 7 डी शो के रूप में, न अल्फा प्रतिक्रियाओं और न ही एसएलआर दर्ज की गई गोपनीय रिपोर्ट के बहुमत के लिए खाते, सुझाव है कि अनुकूली गोपनीय रिपोर्ट अग्रमस्तिष्क और सेरिबैलम द्वारा मध्यस्थता कर रहे हैं। चित्रा 6 में histograms जो eyeblink प्रतिक्रिया सीएस शुरुआत के बाद के शिखर पर विलंबता शो भी इंगित करता है कि जबकि कुछ परीक्षण एक जल्दी शुरू होने अल्फा या कम विलंबता प्रतिक्रिया, और अधिक प्रशिक्षण परीक्षण के साथ शामिल हो सकते हैं, eyeblink प्रतिक्रिया के शिखर वास्तव में होता है और बाद में अमेरिका की शुरुआत, अच्छी तरह से समय वातानुकूलित प्रतिक्रियाओं के विकास का संकेत करने के लिए करीब। जैसा कि पहले उल्लेख, गलमुच्छा उत्तेजना और सदमे तीव्रता एक स्तर है कि चौंकाने वाले या पीढ़ी प्रतिकूल नहीं था, लेकिन अनुकूली वातानुकूलित प्रतिक्रियाओं का निर्माण करने में प्रभावी बना रहा तनु थे। अंत में, के रूप में चित्रा 7B पता चलता है, सीआर का आकार (के तहत क्षेत्र के रूप में मापाचित्रा 5 में के रूप में सुधारा और एकीकृत जवाब में वक्र), एक बार वातानुकूलित समूह में 60% की एक सीखने की कसौटी पर पहुंच गया है, वाचक है कि इन प्रतिक्रियाओं को जानने के लिए कई सत्रों की आवश्यकता होती है pseudoconditioned समूह की तुलना में वातानुकूलित समूह में बड़ा है एसएलआर और अल्फा के विपरीत हिमायती हैं।

Boele एट अल। यह भी बताया कि ईएमजी माप, जबकि इस तरह के खरगोश के रूप में बड़े जानवरों में पलक पता लगाने का सही तरीका है, इस तरह के चूहों 25 के रूप में छोटे कृन्तकों में के रूप में व्यावहारिक नहीं हैं। वे चुंबकीय दूरी की माप तकनीक (MDMT) के इस्तेमाल की सिफारिश झूठी सकारात्मक संकेत है कि ईएमजी रिकॉर्डिंग का संकेत हो सकता का पता लगाने से बचने के लिए। MDMT तकनीक, जबकि इसकी संवेदनशीलता और पलक पता लगाने की गुणवत्ता में प्रभावशाली है, यह भी आदेश चिप 26 को संलग्न करने में पशु प्रशिक्षण के प्रत्येक दिन anesthetize होने के नुकसान को प्रस्तुत करता है। यह अपने आप में सीखने दरों उलझाना सकता है। हम पाते हैं कि ईएमजी संकेतोंयहाँ वर्णित प्रक्रियाओं के साथ दर्ज आसानी से उच्च अस्थायी समाधान, विश्वसनीय और अपेक्षाकृत आसान उपाय और विश्लेषण करने के लिए की प्राप्त कर रहे हैं।

चित्रा 4 एक प्रतिनिधि ईएमजी संकेत प्रशिक्षण के दौरान माउस की आंख के पास रखा एक अवरक्त चिंतनशील ऑप्टिकल सेंसर से एक इसी संकेत के साथ झपकाए का पता लगाने से पता चलता है। वहाँ ईएमजी संकेत और ऑप्टिकल सेंसर के बीच का पता लगाने झपकी, ईएमजी रिकॉर्डिंग का उपयोग झपकी पता लगाने की सटीकता को दर्शाने में एक स्पष्ट संबंध है। ईएमजी रिकॉर्डिंग का एक लाभ यह है कि यह सबसे बड़ी अस्थायी समाधान के लिए अनुमति देता है। हालांकि संकल्प एक 10 मिसे समय लगातार ओवर एकीकृत करके अपमानित किया जाता है, एक भी आंख झपकी गतिविधि का पता लगाने के लिए कच्चे ईएमजी डेटा का विश्लेषण कर सकते हैं। स्पाइक गिनती एक पैरामीटर है कि गोपनीय रिपोर्ट 18 का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। ईएमजी रिकॉर्डिंग के साथ एक नुकसान यह है कि संकेतों निस्संदेह विद्युत विरूपण साक्ष्य बिजली के झटके अमेरिका से आने वाले से दूषित हो जाएगा (देखें यानी, उन है कि अमेरिका की शुरुआत से पहले घटित रिकॉर्ड करने की क्षमता में बाधा नहीं है। ईएमजी रिकॉर्डिंग रोजगार में एक और नुकसान यह है कि, सीआर का पता लगाने के लिए वर्तमान कसौटी का उपयोग कर, एक शोर आधारभूत छिपा सकते हैं जो अन्यथा एक सीआर के रूप में पहचान किया गया हो सकता है।

सिर तय तैयारी यहाँ वर्णित Heiney एट अल द्वारा प्रस्तुत किया है कि के समान है। 15 कर रहे हैं, हालांकि, उनके सुरुचिपूर्ण प्रणाली से कुछ उल्लेखनीय मतभेद। उदाहरण के लिए, विधि eyeblink प्रतिक्रिया कर रहे हैं आंख के ऊपर subdermally रखा ईएमजी गतिविधि रिकॉर्ड करने के लिए तारों की रिकॉर्डिंग के लिए यहां का वर्णन किया। इस तकनीक eyeblink प्रतिक्रिया की, पलक गतिविधि के लिए विश्वसनीय और स्थिर रिकॉर्डिंग के लिए अनुमति देता है और इस तरह। उचित स्थान और इन तारों के निर्धारण गुणवत्ता रिकॉर्डिंग है कि कम से कम दो सप्ताह, प्रयोग की अवधि के लिए पिछले सुनिश्चित करता है। एक उच्च बजाय ईएमजी तारों का उपयोग करने का एक लाभ यह हैगति कैमरा के रूप में Heiney एट अल। द्वारा इस्तेमाल किया जाता है कि ईएमजी रिकॉर्डिंग अत्यंत उच्च अस्थायी समाधान है, और दैनिक स्थिति और अंशांकन है कि एक कैमरा 15 की आवश्यकता की आवश्यकता नहीं है। कैमरा है, तथापि, पलक बंद होने के प्रत्यक्ष दृश्य दृढ़ संकल्प प्रदान करते हैं।

दो प्रणालियों के बीच एक और अंतर यह सीएस प्रसव के लिए विधि है। यह विशेष रूप से सिर तय माउस तैयारी वातानुकूलित प्रोत्साहन के रूप में गलमुच्छा उत्तेजना का इस्तेमाल करता है। परिणाम दिखाना है कि चूहों सीएस के रूप में गलमुच्छा उत्तेजना के साथ प्रभावी ढंग से वातानुकूलित किया जा सकता है, सिर तय खरगोश गलमुच्छा कंपन 27 के साथ वातानुकूलित किया जा सकता बस के रूप में। Heiney एट अल। गलमुच्छा पैड से 15 हवा का एक कश कमजोर निर्देशन द्वारा एक प्रभावी सीएस के रूप में गलमुच्छा पैड की उत्तेजना का प्रदर्शन किया। हालांकि दोनों तकनीकों प्रभावी कंडीशनिंग का प्रदर्शन, चयनित मूंछ पर एक कंघी रखने और कंघी हिल व्यक्ति whiske प्रोत्साहित करने की क्षमता के लिए अनुमति देता हैआर पंक्तियों या यहां तक ​​कि व्यक्तिगत मूंछ। इस तकनीक को पिछले अध्ययनों में इस्तेमाल किया गया है जानवरों को उनके स्वयं के नियंत्रण के रूप में सेवा करने के लिए अनुमति देने के लिए 20 (यानी, उत्तेजित गलमुच्छा पंक्ति unstimulated मूंछ की एक पंक्ति की तुलना में था)।

सारांश में, गलमुच्छा-संकेत है eyeblink कंडीशनिंग के लिए एक सिर तय तैयारी उन्नत तकनीक और प्रयोग है कि पहले असंभव या प्रदर्शन करने के लिए मुश्किल हो गया था के प्रदर्शन के लिए एक सुरक्षित कपाल मंच के लिए अनुमति देता है। हल्के गलमुच्छा उत्तेजना वातानुकूलित प्रोत्साहन के रूप में इस्तेमाल किया गया था और एक हल्के बिजली के झटके असुविधाजनक प्रोत्साहन के रूप में इस्तेमाल किया गया था। Eyeblink प्रतिक्रियाओं पलक पीछे subdermally रखा तारों के साथ दर्ज किए गए। विश्वसनीय सीखने सीएस और अमेरिका के रूप में periorbital बिजली के झटके के रूप में चयनित मूंछ के प्रत्यक्ष उत्तेजना के साथ चूहों में प्रदर्शन किया गया है, और कोई सीखने चूहों कि सीएस और अमेरिका के यादृच्छिक प्रस्तुतीकरण दिया गया में स्पष्ट किया गया था। ईएमजी रिकॉर्डिंग एक भरोसेमंद और रिलायंस एनर्जी प्रदान कीeyeblink प्रतिक्रियाओं की रिकॉर्डिंग और देख कैसे प्रतिक्रियाओं प्रशिक्षण सत्र के पार बदल लिए atively सरल विधि।

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Disclosures

लेखकों घोषणा की कि वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है कि।

Acknowledgments

इस काम के रक्षा विभाग (W81XWH-13-01-0243) और राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (R37 AG008796) द्वारा वित्त पोषित किया गया था। हम सिर तय सिलेंडर तंत्र के निर्माण के लिए नॉर्थवेस्टर्न विश्वविद्यालय के मशीन की दुकान में एलन बेकर धन्यवाद। हम MATLAB और Solidworks में उनके मार्गदर्शन के लिए डॉ Shoai Hattori धन्यवाद। हम LabView सॉफ्टवेयर है कि प्रयोग नियंत्रित करने के लिए डॉ जॉन पावर धन्यवाद।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Exervo TeraNova Foam Roller 36" x 6"  Amazon B002ONUM0E For cylinder
Plexiglas Custom-made; 1 cm thick
Metal Rods (12.7 mm diameter) Custom-made
4-40 machine screw (.25 in. long) Amazon Supply B00F33Q8QO For cylinder
Classic Design Hair Comb Conair 93505WG-320 For whisker stimulation
2-Layer Rectangular Bending Actuator Piezo Systems T220-A4-303X  For whisker stimulation
Solder and Flux Kit Piezo Systems MSF-003-NI For whisker stimulation
Magnetic Base Thor Labs MB175 For whisker stimulation
Threaded rod for magnetic base Custom-made
Strips based on 221 series nylon strip connectors from Electronic Connector Corp. Custom-made, based on Weiss and Disterhoft, 2008
TO-220 Style Transistor Amazon Supply B0002ZPZYO  For connector; for the wings
Relia-Tac Sockets Electronic Connector Corp. 220-S02 For connector
Relia-Tac Pins Electronic Connector Corp. 220-P02 For headpiece
0-80 stainless steel machine screw (1 in. long) Amazon Supply B000FN68EE Locking Screw
0-80 stainless steel machine screw hex nut (5/32 in. thick) Amazon Supply B000N2TK7Y Locking Screw Head
Loctite Super Glue-Liquid Loctite 1365896 Cyanoacrylic glue; for the locking screw
Quick Setting Epoxy Ace Hardware 18613 For connector and whisker stimulation system
Ethernet Cable Wires Ethernet cable can be taken apart to use the individual wires for the connector
Polyimide coated stainless steel wires (2 in. long, .005 in. diameter) PlasticsOne 005sw/2.0 37365 S-S  For headpiece, EMG and shock wires
Stainless steel uncoated wire (.005 in. diameter) AM Systems 792800 For headpiece, ground wires
Tenma Variable Autotransformer Tenma 72-110 For the whisker stimulation; rheostat to adjust current to the bending actuator
Amplifier A-M Systems 1700 Amplifier for filtering and amplifying EMG signals
WPI A385R stimulus isolator World Precision Instruments 31405 For the electrical shock
Isothesia (Isoflurane) Henry Schein: Animal Health 50031 For surgery; anesthesia
Buprenex Injectable CIII Reckett Benckiser Pharmaceuticals Inc NDC 12496-0757-1 For surgery; analgesic
Akwa Tears: Lubricant Ophthalmic Ointment  Akorn NDC 17478-062-35 Artificial tear ointment to prevent dry eyes while under anesthesia
Povidine-Iodine Prep Pads PDI NDC 10819-3883-1 For surgery; antiseptic
Alcohol Prep Pads May be purchased from any standard pharmacy
Stainless steel surgical scalpel handles (no.3) Integra Miltex  4-7. For surgery
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00-90 stainless steel machine screw (0.0625 in. long) Amazon Supply B002SG89X4  For surgery, to wrap ground wire around
Professional Rotary Tool Walnut Hollow 29637 Hand drill for surgery, to drill holes in skull
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Engraving Cutter Drill Bit Dremel 106 Engraving cutter; 1.6 mm bit; for surgery, to drill holes in skull
C&B Metabond-Quick! Cement System "B" Quick Base Parkell S398 For surgery; adhesive luting cement system; important to prevent headpiece avulsion
C&B Metabond-Quick! Cement System Clear L-Powder Parkell S399 For surgery; adhesive luting cement system; important to prevent headpiece avulsion
C&B Metabond-Quick! Cement System "C" Universal TBB Catalyst 0.7 ml Parkell S371 For surgery; adhesive luting cement system; important to prevent headpiece avulsion
C&B Metabond-Quick! Cement System Ceramic Mixing Dish with temperature strip Parkell S387 For surgery; adhesive luting cement system; important to prevent headpiece avulsion
Swiss Tweezers, style #5 World Precision Instruments 504506 For surgery
Puritan Cotton-Tipped Applicators VWR International 10806-005  For surgery
Dental Caulk Grip Cement Kit Dentsply 675570 For surgery; dental cement

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Lin, C., Disterhoft, J., Weiss, C. Whisker-signaled Eyeblink Classical Conditioning in Head-fixed Mice. J. Vis. Exp. (109), e53310, doi:10.3791/53310 (2016).

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