The preparation presented here for whisker-signaled eyeblink conditioning in head-fixed mice precisely stimulates specific whiskers while allowing mice to ambulate on a cylindrical treadmill. A whisker stimulation conditioned stimulus (CS) paired with a periorbital shock unconditioned stimulus (US) results in reliable associative learning on this apparatus.
Eyeblink conditioning is a common paradigm for investigating the neural mechanisms underlying learning and memory. To better utilize the extensive repertoire of scientific techniques available to study learning and memory at the cellular level, it is ideal to have a stable cranial platform. Because mice do not readily tolerate restraint, they are usually trained while moving about freely in a chamber. Conditioned stimulus (CS) and unconditioned stimulus (US) information are delivered and eyeblink responses recorded via a tether connected to the mouse’s head. In the head-fixed apparatus presented here, mice are allowed to run as they desire while their heads are secured to facilitate experimentation. Reliable conditioning of the eyeblink response is obtained with this training apparatus, which allows for the delivery of whisker stimulation as the CS, a periorbital electrical shock as the US, and analysis of electromyographic (EMG) activity from the eyelid to detect blink responses.
Eyeblink condition er en form for Pavlovian condition og et modellsystem for å undersøke nevrale mekanismer for assosiativ læring og hukommelse. Det har blitt undersøkt i forskjellige arter, inkludert mennesker, kaniner, katter, rotter og mus. Paradigmet innebærer presentasjon av to sammenkoblede stimuli: en nøytral betinget stimulus (CS, for eksempel, en tone, et lysglimt, eller whisker stimulering), og en fremtredende ubetinget stimulus (US, for eksempel, en luft puff for øyet, eller periorbitalt sjokk). Den amerikanske utløser en ubetinget, refleksiv eyeblink respons (dvs. UR). Til slutt, etter flere presentasjoner av paret CS-amerikansk, lærer faget å knytte CS med USA. Dette læring manifesterer seg i form av en betinget respons (CR), en eyeblink utløst av CS alene som går forut for presentasjonen av USA.
Eyeblink condition i spor skjemaet inneholder en stimulus fritt intervall på noen hundred millisekunder som skiller CS og USA (Figur 1). Trace condition er en form for deklarativ læring siden det krever bevissthet om stimulanse situasjoner 1. Den tidsmessige gapet krever dyret å holde en neural "spor" av CS i forhjernen regioner som hippocampus for at USA og CS å bli assosiert 1-6. Sammen med forhjernen regionene, er spor kondisjone også avhengig av cerebellum 7.
Eyeblink condition er derfor en nyttig paradigme for etterforskningen av de mange fasetter av minne, inkludert oppkjøp, konsolidering, og gjenfinning. Under eyeblink condition, er en kontrollgruppe av dyr presenteres med uparede stimuli i tilfeldig rekkefølge for å teste for pseudoconditioning eller sensitive svar på CS som kan være forårsaket av amerikanske presentasjon alene heller enn en lærd CS-amerikanske foreningen.
En vanlig brukt Apparatertus for etterforskningen av eyeblink condition i gnagere er et kammer der gnagere får lov til å bevege seg fritt under opplæringsprosessen 8-10. Med denne type apparat er en tjore vanligvis festet til et hodestykke som er festet til den gnager skallen. Fortøyningen gjør det mulig for levering av USA (og noen ganger CS) og for overføring av dyrets respons på disse stimuli (dvs. eyeblink respons) 10. Fortøyningen i seg selv kan bli modifisert basert på typen av stimuli levert og hvordan den eyeblink responsen registreres.
Grunnen til å bruke "fritt bevegelige" tethered mus for eyeblink condition er at mus kjemper mot tilbakeholdenhet. Selv om andre arter kan være mer mottagelig for tilbakeholdenhet, er den store fordelen med å bruke mus i eyeblink condition eksperimenter som de fleste tilgjengelige genmodifiserte mutantstammer er musestammer. I tillegg til sliter, komplett restraint av mus resulterer i akutt nød. Et hode-fast mus forberedelse som minimerer stresset ville øke den fysiologiske informasjon som kan oppnås i løpet eyeblink condition. For eksempel vil dette systemet tillater avbildning av kortikale nevroner med to-foton mikroskopi 11.
Hodefaste preparater har blitt brukt i tidligere eksperimenter for optisk avbildning av hjernebarken gjennom flyttbare hjerneimplantater, in vivo elektrofysiologiske opptak av gnager hjernen med tetrode arrays, to-foton kalsium bildebehandling, og også som en plattform for eyeblink condition i mus 11 -16.
I hodet faste system, er pålitelig stimulering og opptak sikres uten fullstendig beherskelse av mus (figur 2). En hodestykket som den som ble brukt i den fritt bevegelige systemet er festet til musens skallen. Under trening, er hodedelen festet til et koplingsstykke som er festet til stolpene i løpeten sylindrisk tredemølle for å stabilisere den gnager hode (figur 2A). Den sylindriske tredemølle gjør at musen til å hvile komfortabelt, men hvis musen ønsker det, kan også det å løpe eller gå. Med bruk av dette systemet, kan mus trenes med en whisker vibrasjon som CS og en mild periorbital elektrisk støt som USA (figur 1). Den amerikanske leveres gjennom ledninger opereres inn under huden lateralt for øyet. CS er levert via en kam som er festet til en to-lags rektangulær bøying aktuator (figur 2B). Kammen og bøye aktuator blir så festet til en magnetisk base som beveges til riktig stilling under trening og er justert for optimal levering for hvert enkelt dyr. Kammen er posisjonert til å skreve de valgte værhår. Under levering av CS, sendes det et signal til den aktuator som bøye forskyver kammen og fører til vibrasjon av hårkrystallene 17.
<p class= "jove_content"> Andre stimuli som en tone eller et lysglimt har blitt brukt som effektive betingede stimuli hos mus i det siste 16,18,19. Grunnen til at whisker stimulering er valgt for CS i denne eksperimentelle paradigmet er avhengigheten av murine dyr på deres vibrissae for somatosensory informasjon om inndata under utforskning. Whisker stimulering har vist seg å være en pålitelig og effektiv CS 20. Videre gis det veletablerte og organisert kortikale substrat for vibrissae system (dvs. fat cortex), whisker stimulering som CS gir et elegant verktøy for å kartlegge kortikale endringer og plastisitet knyttet til læring eyeblink condition 20,21. Et hode-fast system gir mulighet for nøyaktig stimulering av utvalgte værhår å sammenligne svarene mellom stimulerte nevroner og nevroner som mottar innspill fra ikke-stimulert værhår. Til slutt, mange stammer av mus utviser aldersrelatert hørselstap som relativt unge voksne <sup> 22, og øyelokk nedleggelse i løpet av den betingede blink endrer en visuell CS (selv om en visuell CS gjør bøte problemer med skremme responser 16). Whisker stimulering er ikke påvirket av noen av disse komplikasjoner.Presenteres her er unike og viktige endringer ved andre hode-fast forberedelsene til eyeblink conditioning, herunder metoder for CS og USA levering, og oppkjøpet av eyeblink respons. Påliteligheten av dette apparatet, og opplæringen paradigmet i eyeblink condition er demonstrert ved å lære kurver fra klimaanlegg mus og en relativt flat læringskurve fra pseudoconditioned kontrolldyrene (figur 7a).
Classical eyeblink condition er en form for assosiativ læring som er et nyttig verktøy for å forstå nevrale underlag underliggende læring og hukommelse. Tidligere metoder som benyttes for eyeblink kondisjonering på gnagere som mus involvert et kammer som er tillatt for dyret å bevege seg fritt. Et hode-fast preparat for eyeblink kondisjonering på mus, ved bruk av apparatet beskrevet av Chettih et al. Og Heiney et al., Og mest nylig brukt i lys-fremkalt spor eyeblink ring på Siegel et al.,<…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble finansiert av Department of Defense (W81XWH-13-01-0243) og National Institutes of Health (R37 AG008796). Vi takker Alan Baker i Northwestern University maskinverksted for å bygge head-fast sylinder apparat. Vi takker Dr. Shoai Hattori for hans veiledning i MATLAB og Solidworks. Vi takker Dr. John Strøm for LabView programvare som kontrollerte eksperimentet.
Exervo TeraNova Foam Roller 36" x 6" | Amazon | B002ONUM0E | For cylinder |
Plexiglas | Custom-made; 1 cm thick | ||
Metal Rods (12.7mm diameter) | Custom-made | ||
4-40 machine screw (.25 in long) | Amazon Supply | B00F33Q8QO | For cylinder |
Classic Design Hair Comb | Conair | 93505WG-320 | For whisker stimulation |
2-Layer Rectangular Bending Actuator | Piezo Systems | T220-A4-303X | For whisker stimulation |
Solder and Flux Kit | Piezo Systems | MSF-003-NI | For whisker stimulation |
Magnetic Base | Thor Labs | MB175 | For whisker stimulation |
Threaded rod for magnetic base | Custom-made | ||
Strips based on 221 series nylon strip connectors from Electronic Connector Corp. | Custom-made, based on Weiss and Disterhoft, 2008 | ||
TO-220 Style Transistor | Amazon Supply | B0002ZPZYO | For connector; for the wings |
Relia-Tac Sockets | Electronic Connector Corp. | 220-S02 | For connector |
Relia-Tac Pins | Electronic Connector Corp. | 220-P02 | For headpiece |
0-80 stainless steel machine screw (1 in. long) | Amazon Supply | B000FN68EE | Locking Screw |
0-80 stainless steel machine screw hex nut (5/32 in. thick) | Amazon Supply | B000N2TK7Y | Locking Screw Head |
Loctite Super Glue-Liquid | Loctite | 1365896 | Cyanoacrylic glue; for the locking screw |
Quick Setting Epoxy | Ace Hardware | 18613 | For connector and whisker stimulation system |
Ethernet Cable Wires | Ethernet cable can be taken apart to use the individual wires for the connector | ||
Polyimide coated stainless steel wires (2 in. long, .005 in. diameter) | PlasticsOne | 005sw/2.0 37365 S-S | For headpiece, EMG and shock wires |
Stainless steel uncoated wire (.005 in. diameter) | AM Systems | 792800 | For headpiece, ground wires |
Tenma Variable Autotransformer | Tenma | 72-110 | For the whisker stimulation; rheostat to adjust current to the bending actuator |
Amplifier | A-M Systems | 1700 | Amplifier for filtering and amplifying EMG signals |
WPI A385R stimulus isolator | World Precision Instruments | 31405 | For the electrical shock |
Isothesia (Isoflurane) | Henry Schein: Animal Health | 50031 | For surgery; anesthesia |
Buprenex Injectable CIII | Reckett Benckiser Pharmaceuticals Inc | NDC 12496-0757-1 | For surgery; analgesic |
Akwa Tears: Lubricant Ophthalmic Ointment | Akorn | NDC 17478-062-35 | Artificial tear ointment to prevent dry eyes while under anesthesia |
Povidine-Iodine Prep Pads | PDI | NDC 10819-3883-1 | For surgery; antiseptic |
Alcohol Prep Pads | May be purchased from any standard pharmacy | ||
Stainless steel surgical scalpel handles (no.3) | Integra Miltex | 4-7. | For surgery |
Stainless steel surgical scalpel blades | Integra Miltex | 4-310 or 4-315 | For surgery; number 10 or 15 scalpel blade |
3% Hydrogen Peroxide | May be purchased from any standard pharmacy | ||
Micro Clip | Roboz | RS-5459 | For surgery, to hold back skin |
00-90 stainless steel machine screw (0.0625 in. long) | Amazon Supply | B002SG89X4 | For surgery, to wrap ground wire around |
Professional Rotary Tool | Walnut Hollow | 29637 | Hand drill for surgery, to drill holes in skull |
Inverted Cone Burr | Roboz | RS-6282C-34 | Inverted cone burr size 34; for surgery, to drill holes in skull |
Engraving Cutter Drill Bit | Dremel | 106 | Engraving cutter; 1.6 mm bit; for surgery, to drill holes in skull |
C&B Metabond-Quick! Cement System "B" Quick Base | Parkell | S398 | For surgery; adhesive luting cement system; important to prevent headpiece avulsion |
C&B Metabond-Quick! Cement System Clear L-Powder | Parkell | S399 | For surgery; adhesive luting cement system; important to prevent headpiece avulsion |
C&B Metabond-Quick! Cement System "C" Universal TBB Catalyst 0.7 ml | Parkell | S371 | For surgery; adhesive luting cement system; important to prevent headpiece avulsion |
C&B Metabond-Quick! Cement System Ceramic Mixing Dish with temperature strip | Parkell | S387 | For surgery; adhesive luting cement system; important to prevent headpiece avulsion |
Swiss Tweezers, style #5 | World Precision Instruments | 504506 | For surgery |
Puritan Cotton-Tipped Applicators | VWR International | 10806-005 | For surgery |
Dental Caulk Grip Cement Kit | Dentsply | 675570 | For surgery; dental cement |