Whisker-signalerade frånEyeblinks Classical Conditioning i Head fixerade möss
Summary
The preparation presented here for whisker-signaled eyeblink conditioning in head-fixed mice precisely stimulates specific whiskers while allowing mice to ambulate on a cylindrical treadmill. A whisker stimulation conditioned stimulus (CS) paired with a periorbital shock unconditioned stimulus (US) results in reliable associative learning on this apparatus.
Abstract
Eyeblink conditioning is a common paradigm for investigating the neural mechanisms underlying learning and memory. To better utilize the extensive repertoire of scientific techniques available to study learning and memory at the cellular level, it is ideal to have a stable cranial platform. Because mice do not readily tolerate restraint, they are usually trained while moving about freely in a chamber. Conditioned stimulus (CS) and unconditioned stimulus (US) information are delivered and eyeblink responses recorded via a tether connected to the mouse’s head. In the head-fixed apparatus presented here, mice are allowed to run as they desire while their heads are secured to facilitate experimentation. Reliable conditioning of the eyeblink response is obtained with this training apparatus, which allows for the delivery of whisker stimulation as the CS, a periorbital electrical shock as the US, and analysis of electromyographic (EMG) activity from the eyelid to detect blink responses.
Introduction
FrånEyeblinks konditioneringen är en form av Pavlovian konditionering och ett modellsystem för att undersöka neurala mekanismerna för associativ inlärning och minne. Det har undersökts i olika arter, inklusive människa, kaniner, katter, råttor och möss. Paradigm innebär presentation av två parade stimuli: en neutral betingad stimulus (CS, till exempel, en ton, en ljusblixt, eller morrhår stimulering), och en framträdande obetingat stimulus (US, t.ex. en luft puff för ögat, eller periorbitalt chock). USA framkallar ett obetingat, reflexiv frånEyeblinks svar (dvs UR). Till slut, efter flera presentationer av den parade CS-USA, lär motivet att associera CS med USA. Detta lärande yttrar sig i form av en betingad respons (CR), en frånEyeblinks framkallad av CS ensam som föregår presentationen av USA.
FrånEyeblinks konditionering i spår Formuläret innehåller en stimulans fritt intervall på några timmarundred millisekunder som skiljer CS och USA (Figur 1). Trace konditioneringen är en form av deklarativ lärande eftersom det kräver medvetenhet om stimulansoförutsedda 1. Den tidsmässiga klyftan kräver att djuret att hålla ett neuralt "spår" av CS i framhjärnan regioner som hippocampus för att USA och CS att bli associerade 1-6. Tillsammans med framhjärnan regioner, är spårkonditionering också beroende av cerebellum 7.
FrånEyeblinks Konditioneringen är därför en användbar paradigm för undersökning av flera olika typer av minne, inklusive förvärv, konsolidering och hämtning. Under frånEyeblinks luftkonditionering, en kontrollgrupp av djur presenteras med oparade stimuli i slumpmässig ordning för att testa pseudoconditioning eller sensibiliserade svar på CS som kan orsakas av amerikanska presentation ensam snarare än en lärd CS-amerikanska föreningen.
En vanligen använd apparatus för undersökning av frånEyeblinks konditionering hos gnagare är en kammare i vilken gnagare tillåts röra sig fritt under träningsprocessen 8-10. Med denna typ av anordning, är ett tjuder normalt fäst vid en huvudstycke som är fäst på gnagare skalle. Förankringstrossen möjliggör leverans av USA (och ibland det CS) och för överföring av djurets svar på dessa stimuli (dvs., den frånEyeblinks respons) 10. Tjudret i sig kan modifieras baserat på den typ av stimuli levereras och hur den frånEyeblinks svaret registreras.
Anledningen till att "fritt rörliga" bundna möss för frånEyeblinks konditione är att möss kämpa mot återhållsamhet. Även andra arter kan vara mer mottagliga för återhållsamhet, är den största fördelen med att använda möss i frånEyeblinks experiment konditione att majoriteten av genetiskt modifierade mutantstammar är musstammar. Förutom att kämpa, komplett restraint av möss resulterar i akut nöd. Ett huvud-fast mus preparat som minimerar belastningen skulle öka fysiologisk information som kan erhållas under frånEyeblinks konditionering. Till exempel skulle detta system tillåter avbildning av kortikala neuron med två-foton mikroskopi 11.
Head-fasta beredningar har använts i tidigare experiment för optisk avbildning av hjärnbarken genom flytt kraniella implantat in vivo elektrofysiologiska inspelningar av gnagare hjärnan med tetrode arrayer, två-foton kalcium avbildning, och även som en plattform för frånEyeblinks konditionering hos möss 11 -16.
I huvudet fixerade systemet, är tillförlitliga stimulering och inspelningar säkerställas utan fullständig begränsning av musen (Figur 2). Ett huvudstycke som den som används i det fritt rörliga systemet är fäst till musens skalle. Under träning är huvudbonaden fäst vid en kontakt som är ansluten till barer överen cylindrisk löpband för att stabilisera gnagare huvud (Figur 2A). Den cylindriska löpband gör musen för att vila bekvämt, men om musen så önskar, kan det också att springa eller gå. Med hjälp av detta system kan möss tränas med ett morrhår vibrationer som CS och en mild periorbitalt elektriska stötar som USA (Figur 1). USA levereras genom ledningar kirurgiskt placeras under huden lateralt till ögat. CS levereras via en kam som är fäst vid en två-lagers rektangulär böjning ställdon (Figur 2B). Kammen och bock ställdon fästs sedan en magnetisk bas som flyttas till rätt position under träning och justeras för optimal leverans för varje enskilt djur. Kammen är placerad för att grensla de valda whiskers. Under leverans av CS, sänds en signal till den bockningsmanövreringsorgan som förskjuter kammen och leder till vibrationer av de whiskers 17.
<p class= "jove_content"> Andra stimuli såsom en ton eller en ljusblixt har använts som effektiva betingade stimuli hos möss i det förflutna 16,18,19. Anledningen morrhår stimulering väljs för CS i denna experimentella paradigm är beroende av murina djur på deras vibrissae för somatosensoriska informationsinmatning under utforskning. Morrhår stimulering har visat sig vara en pålitlig och effektiv CS 20. Med tanke på den väletablerade och organiserade kortikala substrat vibrissae systemet (dvs. pipan cortex), morrhår stimulering som CS ger en elegant verktyg för att kartlägga kortikala förändringar och plasticitet i samband med att lära frånEyeblinks konditione 20,21. Ett huvud-fast system möjliggör exakt stimulering av valda whiskers att jämföra svaren mellan stimulerade neuroner och neuroner som får insignaler från icke-stimulerade whiskers. Slutligen många stammar av möss uppvisar åldersrelaterad hörselnedsättning som relativt unga vuxna <sup> 22, och ögonlocks nedläggning under rade blink förändrar en visuell CS (även en visuell CS gör förbättra problem med skrämma svar 16). Whisker stimulering påverkas inte av något av dessa komplikationer.Presenteras här är unika och viktiga ändringar vid andra huvudfixerade preparat för frånEyeblinks konditionering, inklusive metoder för CS och US leverans, och förvärvet av frånEyeblinks svaret. Tillförlitligheten i denna apparat och utbildning paradigm i frånEyeblinks konditione demonstreras genom att lära kurvor från rade möss och en relativt platt inlärningskurva från pseudoconditioned kontrolldjur (Figur 7A).
Protocol
Representative Results
Discussion
Klassisk frånEyeblinks konditioneringen är en form av associativ inlärning som är ett användbart verktyg för att förstå de neurala substrat underliggande inlärning och minne. Tidigare metoder som används för frånEyeblinks konditionering hos gnagare såsom möss involverade en kammare som tillät för djuret att röra sig fritt. Ett huvud-fast beredning för frånEyeblinks konditioneringen i möss med användning av anordningen som beskrivs av Chettih et Heiney et al. Och senast utnyttjade <…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete har finansierats av Department of Defense (W81XWH-13-01-0243) och National Institutes of Health (R37 AG008796). Vi tackar Alan Baker i Northwestern University s verkstad för att bygga huvud fast cylinderapparat. Vi tackar Dr Shoai Hattori för hans vägledning i MATLAB och Solidworks. Vi tackar Dr. John Ström för den LabView mjukvara som kontrollerade experiment.
Materials
| Exervo TeraNova Foam Roller 36" x 6" | Amazon | B002ONUM0E | For cylinder |
| Plexiglas | Custom-made; 1 cm thick | ||
| Metal Rods (12.7mm diameter) | Custom-made | ||
| 4-40 machine screw (.25 in long) | Amazon Supply | B00F33Q8QO | For cylinder |
| Classic Design Hair Comb | Conair | 93505WG-320 | For whisker stimulation |
| 2-Layer Rectangular Bending Actuator | Piezo Systems | T220-A4-303X | For whisker stimulation |
| Solder and Flux Kit | Piezo Systems | MSF-003-NI | For whisker stimulation |
| Magnetic Base | Thor Labs | MB175 | For whisker stimulation |
| Threaded rod for magnetic base | Custom-made | ||
| Strips based on 221 series nylon strip connectors from Electronic Connector Corp. | Custom-made, based on Weiss and Disterhoft, 2008 | ||
| TO-220 Style Transistor | Amazon Supply | B0002ZPZYO | For connector; for the wings |
| Relia-Tac Sockets | Electronic Connector Corp. | 220-S02 | For connector |
| Relia-Tac Pins | Electronic Connector Corp. | 220-P02 | For headpiece |
| 0-80 stainless steel machine screw (1 in. long) | Amazon Supply | B000FN68EE | Locking Screw |
| 0-80 stainless steel machine screw hex nut (5/32 in. thick) | Amazon Supply | B000N2TK7Y | Locking Screw Head |
| Loctite Super Glue-Liquid | Loctite | 1365896 | Cyanoacrylic glue; for the locking screw |
| Quick Setting Epoxy | Ace Hardware | 18613 | For connector and whisker stimulation system |
| Ethernet Cable Wires | Ethernet cable can be taken apart to use the individual wires for the connector | ||
| Polyimide coated stainless steel wires (2 in. long, .005 in. diameter) | PlasticsOne | 005sw/2.0 37365 S-S | For headpiece, EMG and shock wires |
| Stainless steel uncoated wire (.005 in. diameter) | AM Systems | 792800 | For headpiece, ground wires |
| Tenma Variable Autotransformer | Tenma | 72-110 | For the whisker stimulation; rheostat to adjust current to the bending actuator |
| Amplifier | A-M Systems | 1700 | Amplifier for filtering and amplifying EMG signals |
| WPI A385R stimulus isolator | World Precision Instruments | 31405 | For the electrical shock |
| Isothesia (Isoflurane) | Henry Schein: Animal Health | 50031 | For surgery; anesthesia |
| Buprenex Injectable CIII | Reckett Benckiser Pharmaceuticals Inc | NDC 12496-0757-1 | For surgery; analgesic |
| Akwa Tears: Lubricant Ophthalmic Ointment | Akorn | NDC 17478-062-35 | Artificial tear ointment to prevent dry eyes while under anesthesia |
| Povidine-Iodine Prep Pads | PDI | NDC 10819-3883-1 | For surgery; antiseptic |
| Alcohol Prep Pads | May be purchased from any standard pharmacy | ||
| Stainless steel surgical scalpel handles (no.3) | Integra Miltex | 4-7. | For surgery |
| Stainless steel surgical scalpel blades | Integra Miltex | 4-310 or 4-315 | For surgery; number 10 or 15 scalpel blade |
| 3% Hydrogen Peroxide | May be purchased from any standard pharmacy | ||
| Micro Clip | Roboz | RS-5459 | For surgery, to hold back skin |
| 00-90 stainless steel machine screw (0.0625 in. long) | Amazon Supply | B002SG89X4 | For surgery, to wrap ground wire around |
| Professional Rotary Tool | Walnut Hollow | 29637 | Hand drill for surgery, to drill holes in skull |
| Inverted Cone Burr | Roboz | RS-6282C-34 | Inverted cone burr size 34; for surgery, to drill holes in skull |
| Engraving Cutter Drill Bit | Dremel | 106 | Engraving cutter; 1.6 mm bit; for surgery, to drill holes in skull |
| C&B Metabond-Quick! Cement System "B" Quick Base | Parkell | S398 | For surgery; adhesive luting cement system; important to prevent headpiece avulsion |
| C&B Metabond-Quick! Cement System Clear L-Powder | Parkell | S399 | For surgery; adhesive luting cement system; important to prevent headpiece avulsion |
| C&B Metabond-Quick! Cement System "C" Universal TBB Catalyst 0.7 ml | Parkell | S371 | For surgery; adhesive luting cement system; important to prevent headpiece avulsion |
| C&B Metabond-Quick! Cement System Ceramic Mixing Dish with temperature strip | Parkell | S387 | For surgery; adhesive luting cement system; important to prevent headpiece avulsion |
| Swiss Tweezers, style #5 | World Precision Instruments | 504506 | For surgery |
| Puritan Cotton-Tipped Applicators | VWR International | 10806-005 | For surgery |
| Dental Caulk Grip Cement Kit | Dentsply | 675570 | For surgery; dental cement |
References
- Clark, R. E., Squire, L. R. Classical conditioning and brain systems: the role of awareness. Science. 280 (5360), 77-81 (1998).
- Thompson, R. F., Kim, J. J. Memory systems in the brain and localization of a memory. PNAS. 93 (24), 13438-13444 (1996).
- Solomon, P. R., Vander Schaaf, E. R., Thompson, R. F., Weisz, D. J. Hippocampus and trace conditioning of the rabbit’s classically conditioned nictitating membrane response. Behav Neurosci. 100 (5), 729-744 (1986).
- Moyer, J. R., Deyo, R. A., Disterhoft, J. F. Hippocampectomy disrupts trace eye-blink conditioning in rabbits. Behav Neurosci. 104 (2), 243-252 (1990).
- Weiss, C., Bouwmeester, H., Power, J. M., Disterhoft, J. F. Hippocampal lesions prevent trace eyeblink conditioning in the freely moving rat. Behav Brain Res. 99 (2), 123-132 (1999).
- Weiss, C., Disterhoft, J. F. Exploring prefrontal cortical memory mechanisms with eyeblink conditioning. Behav Neurosci. 125 (3), 318-326 (2011).
- Aiba, A., et al. Deficient cerebellar long-term depression and impaired motor learning in mGluR1 mutant mice. Cell. 79 (2), 377-388 (1994).
- Skelton, R. W. Bilateral cerebellar lesions disrupt conditioned eyelid responses in unrestrained rats. Behav Neurosci. 102 (4), 586-590 (1988).
- Takehara, K., Kawahara, S., Takatsuki, K., Kirino, Y. Time-limited role of the hippocampus in the memory for trace eyeblink conditioning in mice. Brain Res. 951 (2), 183-190 (2002).
- Weiss, C., Disterhoft, J. F. Evoking blinks with natural stimulation and detecting them with a noninvasive optical device: A simple, inexpensive method for use with freely moving animals. J Neurosci Meth. 173, 108-113 (2008).
- Royer, S., et al. Control of timing, rate and bursts of hippocampal place cells by dendritic and somatic inhibition. Nature. 15 (5), 769-775 (2012).
- Goldey, G. J., et al. Removable cranial windows for long-term imaging in awake mice. Nature Protoc. 9 (11), 2515-2538 (2014).
- Lovett-Barron, M., et al. Dendritic inhibition in the hippocampus supports fear learning. Science. 343 (6173), 857-863 (2014).
- Chettih, S. N., McDougle, S. D., Ruffolo, L. I., Medina, J. F. Adaptive timing of motor output in the mouse: the role of movement oscillations in eyelid conditioning. Front in Integ Neurosci. 5 (72), (2011).
- Heiney, S. A., Wohl, M. P., Chettih, S. N., Ruffolo, L. I., Medina, J. F. Cerebellar-Dependent Expression of Motor Learning during Eyeblink Conditioning in Head-Fixed Mice. J Neurosci. 34 (45), 14845-14853 (2014).
- Siegel, J. J., et al. Trace Eyeblink Conditioning in Mice is Dependent upon the Dorsal Medial Prefrontal Cortex, Cerebellum, and Amygdala: Behavioral Characterization and Functional Circuity. eNeuro. , (2015).
- Galvez, R., Weiss, C., Cua, S., Disterhoft, J. A novel method for precisely timed stimulation of mouse whiskers in a freely moving preparation: application for delivery of the conditioned stimulus in trace eyeblink conditioning. J Neurosci Meth. 177 (2), 434-439 (2009).
- Gruart, A., Sánchez-Campusano, R., Fernández-Guizán, A., Delgado-Garcìa, J. M. A Differential and Timed Contribution of Identified Hippocampal Synapses to Associative Learning in Mice. Cereb Cortex. , (2014).
- Weiss, C., et al. Impaired Eyeblink Conditioning and Decreased Hippocampal Volume in PDAPP V717F Mice. Neurobiol Dis. 11 (3), 425-433 (2002).
- Galvez, R., Weiss, C., Weible, A. P., Disterhoft, J. F. Vibrissa-signaled eyeblink conditioning induces somatosensory cortical plasticity. J Neurosci. 26 (22), 6062-6068 (2006).
- Galvez, R., Weible, A. P., Disterhoft, J. F. Cortical barrel lesions impair whisker-CS trace eyeblink conditioning. Learn & Memory. 14 (1), 94-100 (2007).
- Johnson, K. R., Zheng, Q. Y., Erway, L. C. A Major Gene Affecting Age-Related Hearing Loss Is Common to at Least Ten Inbred Strains of Mice. Genomics. 70 (2), 171-180 (2000).
- Tseng, W., Guan, R., Disterhoft, J. F., Weiss, C. Trace eyeblink conditioning is hippocampally dependent in mice. Hippocampus. 14 (1), 58-65 (2004).
- Joachimsthaler, B., Brugger, D., Skodras, A., Schwarz, C. Spine loss in primary somatosensory cortex during trace eyeblink conditioning. J Neurosci. 35 (9), 3772-3781 (2015).
- Boele, H. J. Cerebellar and extracerebellar involvement in mouse eyeblink conditioning: the ACDC model. Front in Cell Neurosci. 3 (19), (2010).
- Koekkoek, S. K. E., Den Ouden, W. L., Perry, G., Highstein, S. M., De Zeeuw, C. I. Monitoring kinetic and frequency-domain properties of eyelid responses in mice with magnetic distance measurement technique. J Neurophysiol. 88 (4), 2124-2133 (2002).
- Ward, R. L., Flores, L. C., Disterhoft, J. F. Infragranular barrel cortex activity is enhanced with learning. J Neurophysiol. 108 (5), 1278-1287 (2012).
