Introduction
Epiteliale ovariecancer (EOC) er den mest almindelige dødsårsag fra gynækologisk malignitet, med en anslået 21,290 nye diagnoser i USA i 2015 og en anslået 14,180 dødsfald 1. Langt de fleste (> 75%) af kvinderne er diagnosticeret med sene sygdom (fase III eller IV) kendetegnet ved diffus intraperitoneal metastaser og dårlig prognose. Sygdom tilbagefald i bughulen efter første-line kemoterapi er også almindeligt, og udgør en væsentlig årsag til dødelighed 2,3. EOC metastasizes ved en unik mekanisme, der involverer både direkte forlængelse fra den primære tumor til tilstødende peritoneale organer samt ved dissociation eller udgydelse af celler fra den primære tumor overflade som enkelte celler eller flercellede aggregater. Celler kaste ind i bughulen, hvorved de modstår løsrivelse apoptose 4. Ophobning af peritoneal ascites er fælles, som kaste tumorceller blokere peritoneal lymfedrænage og tumors producerer vækstfaktorer, der ændrer vaskulær permeabilitet. En portion af stald tumorceller vedhæfte til overfladen af peritoneale organer og strukturer, herunder tarm, lever, omentum og mesenterium, hvorefter de forankres og prolifererer til at producere flere udbredte disseminerede sekundære læsioner 3,5. Hæmatogen metastaser er ualmindeligt. Således kliniske behandling almindeligvis består af cytoreduktive kirurgi herunder "optimale debulking", defineret som resektion af alle synlige tumor (uanset hvor lille). Komplet cytoreduktion er forbundet med en betydelig stigning i samlet overlevelse 6,7 og er forbundet med den udfordring, identifikation og fjernelse af læsioner <0,5 cm.
Små dyremodeller har vist anvendelighed i æggestokkene kræftforskning i at forbedre vores forståelse af sygdomsprogression samt i identifikation af prognostiske biomarkører og afprøvning af nye kemoterapi eller kombinationsterapi tilgange. Da det primæresite af ovariecancer forekomst og metastase er bughulen, ortotopisk modeller af EOC metastase bestå i en analyse og karakterisering af intraperitoneal sygdom. Selv om der har været de seneste forbedringer i evnen til billedet tumorceller, selv på enkelt celle niveau, der stadig betydelige problemer med at kvantificere metastatiske tumor byrde af EOC. Disse udfordringer opstår på grund af antallet, størrelsen og anatomiske placering af metastatiske læsioner. Endvidere er der et behov for etiket kræftceller til at skelne dem fra normale værtsceller. Tidligere undersøgelser har anvendt antistof-baserede protokoller eller transfektion af tumorceller med luciferase 8,9 mærkning. Direkte fluorescerende mærkning af cancerceller blev først rapporteret af Chishima og medarbejdere i 1997 10. Fluorescerende mærker kræver ikke tilsætning af eksogent substrat og tilvejebringe udsøgt tumorcellespecificitet, leverer et mere effektivt middel til at spore cancermetastase 11,12
Heri beskrives en optisk billeddannelse fremgangsmåde til kvantitativ analyse af metastatisk sygdom under anvendelse af en syngen ortotopisk xenograftmodel består af rødt fluorescerende protein (RFP) -mærket murine ID8 ovariecancerceller 13 og immunkompetente C57 / BL6-mus. Vi demonstrerer en ny fremgangsmåde til relativ tumorbyrde kvantificering kombinere in vivo og ex vivo-billeddannelse med fjernelse af væv autofluorescens. Denne tilgang kan potentielt anvendes i undersøgelser for at vurdere effekten af specifikke genetiske, epigenetiske eller mikro-miljø ændringer og / eller behandlingsmodaliteter på orgel-specifikke metastaser af kræft i æggestokkene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle in vivo studier blev godkendt af University of Notre Dame Animal Care og brug Udvalg og brugte kvindelige C57 / BL6J mus.
1. Muse kræft i æggestokkene Cell Culture
- Gøre ID8 murine ovariecancer celledyrkningsmedium som følger: 1 I Dulbeccos modificerede Eagle-medium (DMEM) suppleret med 4% kalvefosterserum (FBS), 1% Penicillin / Streptomycin, 5 ug / ml insulin, 5 pg / ml transferrin og 5 ng / ml natriumselenit.
- Transducere ID8 murine ovariecancerceller 13 at udtrykke Red fluorescerende protein (RFP) ved hjælp af kommercielt indkøbt lentivirale partikler, der udtrykker RFP og et udvalg markør (blasticidingenet). Bemærk, at grønt fluorescerende protein kan anvendes, men giver en svagere fluorescens-signal.
- Umiddelbart før transduktion, dyrke celler til 50 - 70% konfluens og tilsæt frisk medium (uden penicillin / streptomycin), der indeholder 1 ml polybren (5 ug / ml endeligkoncentration).
- Forsigtigt pipette RFP-lentivirus (20 pi) dråbevis i skålen og inkuberes ved 37 ° C i 72 timer. Fjern mediet og inkuberes med frisk medium i 24 timer. Begynd selektion af transducerede celler ved at tilsætte blasticidin til dyrkningsmediet (5 ug / ml) og overvåge for røde celler ved anvendelse af fluorescensmikroskopi (Figure1).
- Kultur RFP-mærkede celler i ID8 medium ved podning ca. 10 6 celler i en vævskulturskål og visualisere dagligt ved anvendelse af et lysmikroskop indtil cellemonolaget er sammenflydende.
- Når sammenflydende, høste cellerne ved anvendelse af trypsin (0,25%, 3 min) og kolben tilbage til 37 ° C inkubator indtil cellerne er fritliggende.
- Neutraliser trypsinet med 6 ml ID8 dyrkningsmedium indeholdende serum. Pipettere op og ned mod bunden af skålen, derefter overføre til et 15 ml konisk rør. Centrifuger ved 1.200 RPM i 2 min, derefter aspireres mediet under anvendelse af en glrøv pipette.
- Vask cellerne med phosphatpufret saltvand (PBS) ved forsigtigt at resuspendere i 6 ml varm PBS og centrifugering som i 1.5 ovenfor. Resuspender i PBS til en slutkoncentration på 5 x 10 6 celler / ml. Hold celler varme (37 ° C) indtil injektion.
2. intraperitoneal Injektion af ID8 Cells og in vivo Imaging
- Injicere hver mus med 2 ml af varm ID8-PBS-opløsning til i alt 10 millioner celler gennem intraperitoneal (ip) injektion. Tillad tumorceller til at vokse in vivo i ca. 10 uger med ugentlige direkte billedvisning.
- Umiddelbart efter injektionen og hver uge derefter afveje mus og derefter bedøver hver mus ved hjælp isofluoran (2,5% flow i 0,5 l / min O 2 flow). Bemærk: Musene blev vejet, ikke som et kvantitativt mål for tumorbyrde, men snarere et mere generelt mål for individuel mus fysisk progression gennem hele undersøgelsen. Mus vejerts blev sammenlignet med deres egne tidligere vægtværdier.
- Bedøver mus ved at placere i en isofluoran kammer. Oprethold konstant anæstesi under scanning ved at placere musen hovedet i næse-keglen for eksponering for 2,5% flow isofluoran hele proceduren.
- Brug hårfjerningsmiddel at fjerne hår på torso og maven på hver mus, som den sorte hår vil forårsage dæmpning af fluorescenssignalet. Mus bades med varmt vand efter påføring af hårfjerningsmiddel og tørret med RT papirhåndklæder.
- Mens bedøvet, scanne hele kroppen på hver mus under anvendelse af et lille dyr optisk billeddannelsessystem. Scan alle mus i en kohorte på hvert tidspunkt. Brug følgende totrins-protokol (Figur 2A):
- I trin 1, for at observere fluorescens-mærkede (RFP) tumorceller, udføre multispektral erhvervelse til at indsamle i alt 5 billeder ved hjælp af excitation filtre af 440 nm, 460 nm, 480 nm, 520 nm og 540 nm, og en emission filter på 600 nm. Brug følgende erhvervelse parametre: en standard eksponering på 15 sek, 2 x 2 binning, FOV på 160 mm, og f-stop på 1,1.
- I trin 2, at observere hele dyret, erhverve en reflektans billedet ved hjælp af en åben exciteringsfilter (hvidt lys), en åben emission filter, en standard eksponering på 0,2 sek med 2 x 2 Binning og et FOV på 16 cm. Bemærk: Den egentlige billedbehandling tid er ~ 1 min.
3. Mouse Dissektion og Image Acquisition
- Når direkte billedvisning viser tilstedeværelsen af omfattende intraperitoneal sygdom eller dyr udviser ophobning af ascites (som det fremgår af abdominal udspiling), tab eller gevinst på kropsvægt på mere end 20%, sløvhed eller andre tegn på nød, aflive hver mus ved hjælp af CO 2 anæstesi efterfulgt af cervikal dislokation.
- Skære huden anteriort langs den ventrale midterlinjen af mus, under anvendelse af spidse dissection saks, fra toppen af lårene til bunden af brystkassen. Tag ekstrem omhu at skære igennem kun huden lag (figur 2Bi). Forsigtigt adskille huden fra det peritoneale væv, er sikker på ikke at punktere den peritoneale væg.
- Anvendelse af spidse dissektion saks, skåret lateralt både langs bunden af brystkassen og toppen af lårene til at oprette to flapper af hud (figur 2B ii, iii).
- Placer hver mus på dens ventrale side (bughulen vender nedad) med hudlapper trukket åben og scanne hver mus med dens organer in situ ved anvendelse af små dyr optiske afbildningssystem (figur 3A, B).
- Brug de samme billedoptagelse parametre som beskrevet i 2.4.1.-2.4.2.
- Fortsæt dissekere musen ved at ekstrahere enkelte peritoneale organer, herunder lever, omentum / bugspytkirtel, mave, mellemgulv, tyndtarm, tyktarm, venstre og højre peritoneum, æggestokke, kidneys, mesenterium og fedt pad.
- Observere, optælle og registrere synlige tumorer på hvert organ. Brug en skydelære til måling af diameteren af hver tumor.
- Udpeg tumorer mindre end 2 mm i diameter så lille, mellem 2 og 5 mm som medium og større end 5 mm så stor.
- Placer organer på orgel scanning skabelon (figur 4), der identificerer en forudbestemt sted for hvert organ. Brug PBS at holde organerne fugtig.
- Scan hvert ark af organer ved hjælp af små dyr optiske afbildningssystem (figur 3C, D).
- Brug de samme billedoptagelse parametre som beskrevet i trin 2.4.
- Efter scanning, at placere organer i 10% formaldehyd muliggøre efterfølgende behandling for histologi.
4. Kvantificering af Tumor Burden i the fluorescensbilleder
- For at reducere mængden af auto-fluorescens i hver multispektral skanning, første unmix filerne ved hjælp af software til rådighed med den lille dyr imaging system.
- Indlæs først RFP: In Vivo spektral fil, efterfulgt af Autofluor: In Vivo Red fil i vinduet ublandede billeder og vælg Unmix.
- Eksporter de .bip filer som 16 bit .tiff (uskaleret) format.
- Brug ImageJ software (ex vivo organer og så det fulde mus krop med organer i situ).
- Brug Filer> Åbn for at åbne de 16 bit .tiff filer af orgel scanning skabelon filer i ImageJ.
- Under Image> Juster> Lysstyrke / Kontrast, vælge at Indstil Mindste viste værdi til 0 og den maksimale viste værdi til 35.353 og derefter underBillede> opslagstabeller, vælg Red Hot. Bemærk: Forskellige dyremodeller vil kræve forskellige lysstyrkeniveauer, men det er vigtigt at holde lysstyrken konsekvent gennem en given undersøgelse.
- Brug af Freehand Selection værktøjet, tegne en free-form område af interesse valg (ROI) omkring hvert organ og bruge måleværktøjet (CTRL + M) til at beregne overfladearealet af hvert organ; optage overfladearealet af hvert organ i et regneark.
- Med ROI trukket omkring hvert organ, højreklik i ROI, og vælg Duplicate til kun at omfatte orglet.
- Mens du ser på det enkelte organ, under Image> Juster> Threshold, vælge at Indstil tærsklen til billedet til en lavere tærskel niveau af + 1200 og en øvre niveau af + 1700 for at vælge only de mest lyst fluorescerende regioner og tjek at vælge Mørk baggrund; vælg OK. Bemærk: Billederne kan kræve manuel manipulation af de tærskelværdier skydere i ImageJ så de tidligere lyseste områder er udvalgt til analyse trin, som vist ovenfor. Forskellige sygdomsmodeller vil kræve forskellige tærskel begrænsninger, men det er vigtigt at holde tærskelværdier konsistente gennem en given undersøgelse.
- Under Analyser> Analyser Partikler, ændre størrelse (pixels ^ 2) til 10-Infinity, vælge at vise: Outlines, check for at vælge kun "Vis resultaterne" og klik OK for at måle både de områder og rå integrerede tætheder af disse lyse områder, anses tumorer.
- Optag værdierne af overfladearealet og Raw Integreret Density af hver tumor valg vises i
- Under Analyser> Værktøjer> Kalibrering Bar, tilføje en kalibrering skala bar til billederne af organer. Bemærk: I dette eksempel, dette blev gjort ved at ændre placering til Upper Right, Fyld farve til sort, Label Farve til White, det antal etiketter til 5, decimalerne til 0, skriftstørrelsen til 12 og zoom faktor til 4,0 og muliggør Fed tekst.
- Under Filer> Gem som ..., gemme montage som .tiff og .Jpeg.
- Brug Filer> Åbn for at åbne .jpeg fil af organer og derefter under Indsæt> Tekstboks
- Brug Filer> Åbn for at åbne hver enkelt af de 16 bit .tiff filer af hele kroppen scanninger i ImageJ i rækkefølge mus nummer.
- Under Image> Juster> Lysstyrke / Kontrast, vælge at Indstil Mindste viste værdi til 0 og den maksimale viste værdi til + 35.353 og derefter under Image> opslagstabeller, vælg Red Hot.
- Under Filer> Gem som ..., gemme montage som en. Tiff og .Jpeg.
5. Data Analysis
- Tilsæt tumor markeringsområder og rå integrerede tætheder, henholdsvis for hvert organ i hver mus og registrere den samlede organ tumorområdet for hver mus.
- Normalisere indspillede område og rå inteed density værdier for størrelsen af hvert organ ved at dividere det samlede tumor område og rå integrerede tæthedsværdier alt ved det tilsvarende organ overfladeareal (Tabel 1).
- Beregne og plotte gennemsnittet af både de normaliserede tumor arealer og de normaliserede rå integrerede densitetsværdier (figur 5A, B).
- Sammenlign disse middelværdier til dem, der opnås ved visuelt at tælle de tumorer, der var synlige med det blotte øje under inspektionen af hvert organ for metastatiske læsioner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den metastatiske mekanisme for kræft i æggestokkene er karakteriseret ved meget diffus intraperitoneal metastaser består af talrige læsioner af varierende størrelse, herunder flere små (<2mm) læsioner. Således brug af RFP-mærkede tumorceller (figur 1) og optisk billeddannelse tilvejebringer en alternativ metode til manuel tælling og måling af læsionens størrelse. Udviklingen af tumorbelastning over tid kan bestemmes ved ugentlig vejning af mus og måling af abdominal omkreds at måle potentiel forekomst af ascites. In vivo optisk afbildning giver en supplerende fremgangsmåde til vurdering tumorbelastning (figur 2). Kræft i æggestokkene metastaserer til flere steder i bughulen og molekylære førere af stedspecifikke metastaser er i øjeblikket ukendte. Ud over bestemmelse af den samlede tumorbyrde, kan efter aflivning omhyggelig dissektion udføres for at vurdere og kvantificere stedspecifik patterns af metastase. Således kan optisk billeddannelse af peritoneale organer in situ (figur 3A, B) kombineret med ex vivo vurdering af individuelle organer (figur 3C, D) giver nyttige data om den samlede vs orgel-specifikke tumor byrde. Scanningerne præsenteret i figur 3 repræsenterer resultaterne af scanne bughule og individuelle organer af mus med varierende grad af tumorbyrde. F.eks Figur 3C viser den mest tumorbelastning i omentum / bugspytkirtel, æggestokke og mesenterium fra mus A. Ved sammenligning med de samme organer i Mouse B, en væsentlig forskel i signal ses (figur 3D). Brugen af orglet scanning skabelon (figur 4) hjælper i identifikation af organspecifik tumor byrde. Observationen af differentiel tumorbyrde bekræftes kvantitativt både med hensyn til tumor overfladeareal og tumor signalintensitet (tabel 1, figur 5).
figur 2 og 3 illustrerer den brede vifte af tumorbyrde, der kan afbildes og kvantificeres ved hjælp af denne metode. Dataene i tabel 1 illustrerer dette store udvalg af anvendelighed i kvantificere både tumor overfladeareal og signalintensitet af tumoren. For eksempel når man ser på omentum / bugspytkirtel af mus A sammenlignet med den for Mouse B, den normaliserede tumor overfladearealet er 26 gange større i mus A end mus B. Endvidere lang række signalintensiteten er også eksemplificeret i omentum / bugspytkirtel af mus A og B; den normaliserede rå integrerede tæthed af Mouse A er 56 gange større end for mus B. Disse resultater viser gyldigheden af Comparing tumorbyrden af flere testpersoner i forhold til hinanden, både hvad angår tumor overfladeareal og tumor signalintensitet, ved hjælp af denne hurtig metode, som ikke kræver yderligere histologisk analyse.
Figur 1. ID8 Murine ovariecancerceller Express RFP. (A) Fase billede af ID8 celler. (B) Fluorescence billede af ID8 celler. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Levende optisk afbildning af C56 / BL6 Mouse med intraperitoneal tumorbelastning. (A) Hårfjerningscreme blev anvendt til at fjerne hai r fra den ventrale overflade før scanning musen. (B) Diagram viser indledende ventral midterlinjen og laterale indsnit. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Endpoint Scanning af intraperitoneal tumorbelastning. (A, B) Mus først afbildes med organer in situ (ventrale side nedad) efter åbning af den ventrale overflade af musen. (C, D) Billeddannelse af individuelle organer. Hvert organ dissekeres, indspillet visuel tumor byrde, og placeret på orgel scanning skabelon til analyse.target = "_ blank"> Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4. Organ Scanning skabelon. Dissekerede organer er placeret på orglet scanning skabelon til at opretholde positionelle identifikation af enkelte organer under scanningen.
.. Figur 5. Normalized Kvantitative data for omentum / Pancreas, æggestokke og mesenterium Data blev analyseret som beskrevet i protokollen og som vist i tabel 1 Mouse A refererer til muse scannes i panelet 3A; muse B refererer til musen scannes i panelet 3B. (A) Normalized tumor område. Fluorescens signal kvantificering analyse af disse tre organer blev gennemført og kvantificeret i form af et forholdtumor overfladeareal helorgan areal for begge mus. (B) Normalized rå integreret tæthed. Fluorescenssignal kvantificering analyse af disse tre organer blev udført og kvantificeret i form af et forhold mellem råt integrerede tæthed til helorgan areal for begge mus.
| Omentum / Pancreas | |||
| Normaliseret Tumor Area | Normaliseret Raw Integreret Density | ||
| mus A | 0,5346 | 5.11E + 07 | |
| Mouse B | 0,0203 | 8.97E + 05 | |
| æggestokke | |||
| Normaliseret Tumor Area | Normaliseret Raw Integreret Density | ||
| mus A | 4.79E + 07 | ||
| Mouse B | 0,0123 | ||
| tarmkrøs | |||
| Normaliseret Tumor Area | Normaliseret Raw Integreret Density | ||
| mus A | 0,2951 | 2.22E + 07 | |
| Mouse B | 0,0098 | 4.15E + 05 | |
Tabel 1. Normaliseret Tumor Area og Normalized RawIntegrerede Density værdier i omentum / bugspytkirtel, æggestokke og mesenterium fra både mus A og mus B. Undersøgelse efter dissektion og scanning blev hvert organ segmenteret og dens fluorescens kvantificeret at bestemme andelen af tumorområdet til samlede organ overfladeareal og intensiteterne af den fluorescens til disse tumor områder. Omentum / bugspytkirtel, æggestokke og mesenterium blev udvalgt som de havde de stærkeste fluorescenssignaler inden for både de positive og negative kontrolgrupper.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I modsætning til undersøgelser med humane ovarie kræftceller, der skal gennemføres i immunkompromitterede mus, beskrev protokollen ovenfor udnytter immunkompetente C57 / BL6 mus og syngene murine æggestokkene cancerceller. Mens dette muliggør vurdering af den potentielle rolle af immune infiltrater i tumorudvikling og metastase, tilstedeværelsen af mørkt hår på den abdominale overflade gør billeddannelse mindre følsomme. Anvendelse af en rigtige spørgsmål at fjerne hår før billeddannelse forbedrer erhvervelse billede, men er tidskrævende, især for eksperimenter, der kræver langsgående billeddannelse. Hårløse 'nude' mus kan bruges i denne protokol og ikke kræver rigtige spørgsmål-baserede hårfjerning. Endvidere nøgne mus mangler et fungerende immunsystem, så kan også anvendes til at vurdere væksten af humane ovariecancerceller i forsøg, hvor bidraget fra immunsystemet ikke er under analyse.
Det skal også bemærkes, at dybden af intraperitoneal tumorer præsenterer også tekniske udfordringer, som optisk fluorescens billeddannelse generelt ikke vil detektere tumorer på dybder over 5 mm. Endvidere forekomsten af ascitesvæske og tilstedeværelsen af ascites tumorceller giver yderligere komplikationer. Vi har observeret betydelig muse-til-mus variabilitet i dannelsen af ascitesvæske, selv når de injiceres med samme cellelinie. Således i nærvær af ascites, denne metode er at foretrække i slutpunktsanalyse af organspecifikke tumorbyrde snarere end rutinemæssig langsgående billeddannelse af progression. I det aktuelle tilfælde blev dramatiske ændringer i tumorbyrde noteret mellem eksempel mus, således at kohorter af fire til fem mus sædvanligvis vil være tilstrækkelig til statistisk analyse. I tilfælde af mindre dramatiske forskelle i tumorbyrde, vil yderligere forsøgspersoner være nødvendige for at nå statistisk styrke. Mens de heri viste eksempler afviger betydeligt i tumorvolumen, kan optisk fluorescens billeddannelse anvendes tildetektere meget mindre forskelle i organspecifik tumorbyrde, især sammenlignet med vægt eller caliper-baserede målinger på små læsioner (ikke vist) .Resolution og følsomhed varierer med cellelinie og billedbehandlingssystem. I det foreliggende tilfælde, kan metastatiske implantater så små som 400 um i diameter løses og kvantificeres. Alternative metoder, herunder kontrast-forstærket computertomografi (CT), magnetisk resonans (MR) billeddannelse, og positronemissionstomografi (PET) er blevet beskrevet til langsgående billeddannelse 14,15. Retningslinjer herunder kombineret anatomisk og funktionel billeddannelse er også under udvikling 16.
I forhold til denne foreslåede metode til kvantificering af tumorbelastning, skal det bemærkes, at bestemmelsen af fluorescens tærskler [Trin 4.3.5.] Er baseret på intensiteten af fluorescensen set i organet billeder [Trin 4.3.2.] og er valgt af brugeren til at omfatte kun de mest fluorescerende regioner vedrøive til resten af organet. Varierende tærskelværdier blev anvendt i analysen og derefter fastlægge endelige tærskelværdier, der benyttes i denne undersøgelse. Når bestemt, blev disse samme tærskler anvendes til alle analyseret for at sikre sammenhæng i kvantificering af, hvad der anses for metastatisk væv ved den indledende visuel analyse udført af forskeren orgel. Bestemmelsen af disse tærskler er et afgørende skridt i proceduren og potentielt kan variere fra det ene projekt til det andet, som bestemmes af den enkelte forsker. I dette tilfælde blev en stor lavere tærskel anvendes, således at kun fange de højeste intensitet fluorescenssignaler. Ved at bruge denne samme tærskel for hver analyserede organ, analysen og resultaterne tilbyde sammenlignende kvantitative resultater inden for rammerne af denne kohorte af mus. Selv om denne fremgangsmåde er begrænset i kvantificering af absolutte værdier af tumor areal, det giver forskerne mulighed for at sammenligne relative normaliseret tumor byrde blandt de samme ennd forskellige organer inden for kohorter af mus. Det skal bemærkes, at denne fremgangsmåde omfatter kvantificering af tumorer, der ikke er synlige for det blotte øje.
Den unikke metastatisk mekanisme EOC resultater i udbredes intraperitoneal carcinomatose involverer flere væv og organer, rendering optimal cytoreduktive kirurgi teknisk udfordrende. Som komplet cytoreduktion positivt korrelerer med samlet overlevelse, følger det, at udviklingen af nye terapeutiske strategier til bekæmpelse af intraperitoneal metastaser er berettiget. Vurdering af terapeutisk virkning er imidlertid afhængig af nøjagtig kvantificering af tumorbelastning, herunder vurdering af organspecifikke metastase. Brug af optisk billeddannelse af RFP-mærkede tumorceller in situ korrigeret for orgel autofluorescens, kombineret med omhyggelig ex vivo organ billeddannelse, har vi udviklet en fremgangsmåde til kvantificering intraperitoneal organspecifik tumorbyrde. Interessant, vores analyser viserdette foretrukne lokaliteter af metastase i denne model, som defineret af tumorbelastning / overfladeareal, ligner dem, der findes hos kvinder med ovariecancer (omentum, ovarie, tarm, mesenterium) 2,4,5. Derfor bør denne tilgang have fremtidige anvendelighed i evaluering af eksperimentelle lægemidler designet til at målrette metastatisk sygdom.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Denne artikel er en del af et særnummer om multimodal Pre-Clinical Imaging, sponsoreret af Bruker BioSpin.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Corning | 10-014-CM | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 10437-028 | |
| penicillin/streptomycin | |||
| Insulin-transferrin-sodium selenite media supplement | Sigma | I-1884 | |
| Bruker Xtreme small animal imaging system | Bruker Corp. | ||
| Bruker Multispectral software | Bruker Corp | ||
| lentiviral particles with Red fluorescent protein | GenTarget, Inc. | LVP023 | |
| trypsin for cell culture | Corning | 25-053-CI | |
| PBS | Corning | 21-040-CM | |
| depilatory cream (such as Nair Hair Remover Lotion) | purchases from drugstore | n/a | |
| ImageJ software | http://imagej.nih.gov/ij/ | free download | |
| dissecting tools (forceps) | Roboz Surgical Instrument | RS 5130 | |
| dissecting tools (Scissors) | Roboz Surgical Instrument | RS 5910 |
References
- American Cancer Society. , Available from: http://www.cancer.org/cancer/ovariancancer/overviewguide/ovarian-cancer-overview-key-statistics (2015).
- Lengyel, E. Ovarian cancer development and metastasis. American Journal of Pathology. 177 (3), 1053-1064 (2010).
- Halkia, E., Spiliotis, J., Sugarbaker, P. Diagnosis and management of peritoneal metastases from ovarian cancer. Gastroenterology Research and Practice. 2012, 541842-541854 (2012).
- Barbolina, M. V., et al. Microenvironmental regulation of ovarian cancer metastasis. Cancer Treatment and Research. 149, 319-334 (2009).
- Lengyel, E., et al. Epithelial ovarian cancer experimental models. Oncogene. 33 (28), 3619-3633 (2014).
- Harter, P., duBois, A. The role of surgery in ovarian cancer with special emphasis on cytoreductive surgery for recurrence. Current Opinion in Oncology. 17 (5), 505-514 (2005).
- Bristow, R. E., Puri, I., Chi, D. S. Cytoreductive surgery for recurrent ovarian cancer: a meta-analysis. Gynecologic Oncology. 112 (1), 265-274 (2009).
- Hoffman, R. M. In vivo imaging of metastatic cancer with fluorescent proteins. Cell Death and Differentiation. 9, 786-789 (2002).
- Sweeney, T. J., et al. Visualizing the kinetics of tumor-cell clearance in living animals. Proceedings of the National Academy of Science USA. 96, 12044-12049 (1999).
- Chishima, T., et al. Cancer invasion and micrometastasis visualized in live tissue by green fluorescent protein expression. Cancer Research. 57, 2042-2047 (1997).
- Bouvet, M., et al. Real-time optical imaging of primary tumor growth and multiple metastatic events in a pancreatic cancer orthotopic model. Cancer Research. 62, 1534-1540 (2002).
- Hoffman, R. M. The Multiples Uses of Fluorescent Proteins to Visualize Cancer in vivo. Nature Reviews. 5, 796-806 (2005).
- Roby, K. F., et al. Development of a syngeneic mouse model for events related to ovarian cancer. Carcinogenesis. 21 (4), 585-591 (2000).
- Rampurwala, M., Ravoori, M. K., Wei, W., Johnson, V. E., Vikram, R., Kundra, V. Visualization and quantification of intraperitoneal tumors by in vivo computed tomography using negative contrast enhancement strategy in a mouse model of ovarian cancer. Translational Oncology. 2 (2), 96-106 (2009).
- Kim, T. J., et al. Antitumor and antivascular effects of AVE8062 in ovarian carcinoma. Cancer Research. 67, 9337-9345 (2007).
- Picchio, M., et al. Advanced ovarian carcinoma: usefulness of [(18)F]FDG-PET in combination with CT for lesion detection after primary treatment. Quarterly Journal of Nuclear Medicine. 47, 77-84 (2003).
