Introduction
उपकला डिम्बग्रंथि के कैंसर (ईओसी) gynecologic द्रोह से मौत का सबसे आम कारण, 2015 में अमेरिका में एक अनुमान के अनुसार 21,290 नए निदान और एक अनुमान के अनुसार 14,180 लोगों की मृत्यु 1 के साथ है। महिलाओं की विशाल बहुमत (> 75%) देर चरण रोग के साथ का निदान कर रहे हैं (चरण तृतीय या चतुर्थ) फैलाना इंट्रा-पेरिटोनियल मेटास्टेसिस और गरीब पूर्वानुमान की विशेषता है। पहली लाइन कीमोथेरेपी के बाद पेरिटोनियल गुहा में रोग की पुनरावृत्ति भी आम है और मृत्यु दर 2,3 का एक प्रमुख कारण प्रतिनिधित्व करता है। ईओसी एक अद्वितीय पड़ोसी पेरिटोनियल अंगों को प्राथमिक ट्यूमर से और साथ ही हदबंदी से दोनों प्रत्यक्ष विस्तार या एकल कक्षों या बहु-कोशिकीय समुच्चय के रूप में प्राथमिक ट्यूमर की सतह से कोशिकाओं के बहा से जुड़े तंत्र द्वारा metastasizes। प्रकोष्ठों, पेरिटोनियल गुहा में बहा रहे हैं जिसमें वे टुकड़ी प्रेरित apoptosis 4 का विरोध। पेरिटोनियल जलोदर के buildup, आम है बहाने ट्यूमर कोशिकाओं पेरिटोनियल लसीका जल निकासी और टी ब्लॉक के रूप मेंumors वृद्धि कारक है कि संवहनी पारगम्यता में परिवर्तन का उत्पादन। शेड ट्यूमर कोशिकाओं के एक हिस्से पेरिटोनियल अंगों और आंत, लीवर, omentum और अन्त्रपेशी सहित संरचनाओं की सतह के लिए देते हैं जिस से वे लंगर और कई व्यापक रूप से प्रचारित माध्यमिक घावों 3,5 उत्पादन करने के लिए पैदा करना। Hematogenous मेटास्टेसिस असामान्य है। इस प्रकार, नैदानिक प्रबंधन सामान्यतः (कोई बात नहीं कैसे छोटे) "इष्टतम debulking" सहित साइटोरिडक्टिव शल्य-चिकित्सा, सभी दृश्य ट्यूमर की लकीर के रूप में परिभाषित होते हैं। पूरा cytoreduction समग्र अस्तित्व 6.7 में उल्लेखनीय वृद्धि के साथ जुड़ा हुआ है और पहचान और घावों को हटाने <0.5 सेमी की चुनौती के साथ जुड़ा हुआ है।
छोटे पशु मॉडल शकुन बायोमार्कर और उपन्यास कीमोथेरपी या संयोजन चिकित्सा दृष्टिकोण के परीक्षण की पहचान में रोग प्रगति के बारे में हमारी समझ में सुधार के रूप में अच्छी तरह से या गर्भाशय के कैंसर अनुसंधान के क्षेत्र में उपयोगिता सिद्ध कर दिया है। प्राथमिक के रूप मेंडिम्बग्रंथि के कैंसर के बढ़ते मामलों और मेटास्टेसिस की साइट पेरिटोनियल गुहा, ईओसी मेटास्टेसिस के ओर्थोटोपिक मॉडल विश्लेषण और intraperitoneal रोग के लक्षण वर्णन शामिल है। हालांकि वहाँ छवि ट्यूमर कोशिकाओं की क्षमता में हाल ही में सुधार किया गया है, यहां तक कि एकल कोशिका के स्तर पर, वहाँ अब भी ईओसी की metastatic ट्यूमर बोझ बढ़ाता में महत्वपूर्ण कठिनाइयों मौजूद हैं। इन चुनौतियों संख्या, आकार और मेटास्टेटिक घावों की शारीरिक स्थिति के कारण उत्पन्न होती हैं। इसके अलावा उन्हें सामान्य मेजबान कोशिकाओं से अलग करने के लेबल कैंसर की कोशिकाओं को करने की जरूरत मौजूद है। पिछले अध्ययनों एंटीबॉडी आधारित लेबलिंग प्रोटोकॉल या luciferase 8,9 के साथ ट्यूमर कोशिकाओं के अभिकर्मक का उपयोग किया है। कैंसर कोशिकाओं के प्रत्यक्ष फ्लोरोसेंट लेबलिंग पहली बार 1997 में 10 Chishima और सहकर्मियों द्वारा सूचना मिली थी। फ्लोरोसेंट लेबल बहिर्जात सब्सट्रेट के अलावा आवश्यकता नहीं है और उत्तम ट्यूमर सेल विशिष्टता प्रदान करते हैं, एक अधिक प्रभावी साधन उपलब्ध कराने के कैंसर मेटास्टेसिस 11,12 ट्रैक करने के लिए
इस के साथ साथ हम एक syngeneic ओर्थोटोपिक जेनोग्राफ्ट मॉडल लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन (आरएफपी) के शामिल का उपयोग कर मेटास्टेटिक रोग के मात्रात्मक विश्लेषण के लिए एक ऑप्टिकल इमेजिंग विधि का वर्णन -tagged murine ID8 या गर्भाशय के कैंसर की कोशिकाओं को 13 और इम्युनो-सक्षम C57 / BL6 चूहों। हम रिश्तेदार ट्यूमर बोझ गुणात्मक रूप से एक उपन्यास विधि ऊतक ऑटो प्रतिदीप्ति को हटाने के साथ विवो और पूर्व vivo इमेजिंग में संयोजन प्रदर्शित करता है। यह दृष्टिकोण या गर्भाशय के कैंसर का अंग विशेष मेटास्टेसिस पर विशिष्ट आनुवंशिक, epigenetic या सूक्ष्म पर्यावरण संशोधनों और / या इलाज के तौर तरीकों के प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए डिज़ाइन अध्ययन में संभावित उपयोगिता है।
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Protocol
सभी vivo अध्ययन में नोट्रे डेम पशु की देखभाल और उपयोग समिति के विश्वविद्यालय द्वारा अनुमोदित और महिला C57 / BL6J चूहों का इस्तेमाल किया गया था।
1. Murine डिम्बग्रंथि के कैंसर कोशिका संस्कृति
- इस प्रकार के रूप ID8 murine या गर्भाशय के कैंसर सेल संस्कृति के माध्यम बनाओ: Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम (DMEM) के 1 एल के साथ 4% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS), 1% पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन, 5 माइक्रोग्राम / एमएल इंसुलिन, 5 माइक्रोग्राम / एमएल Transferrin पूरक और 5 एनजी / एमएल सोडियम Selenite।
- लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन (आरएफपी) व्यावसायिक रूप से खरीद की lentiviral कणों आरएफपी और एक चयन मार्कर (जीन blasticidin) व्यक्त उपयोग करते हुए व्यक्त करने के लिए ID8 murine या गर्भाशय के कैंसर की कोशिकाओं को 13 transduce। ध्यान दें कि हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन का इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन एक कमजोर प्रतिदीप्ति संकेत देता है।
- पारगमन के लिए तुरंत पहले, संस्कृति कोशिकाओं से 50 - 70% संगम और ताजा मध्यम (बिना पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन) जोड़ने है कि 1 मिलीलीटर Polybrene (5 माइक्रोग्राम / एमएल अंतिम शामिलएकाग्रता)।
- धीरे पिपेट आरएफपी lentivirus (20 μl) डिश में dropwise और 72 घंटे के लिए 37 ओ सी पर सेते हैं। मध्यम निकालें और 24 घंटे के लिए ताजा माध्यम के साथ सेते हैं। संस्कृति के माध्यम से (5 माइक्रोग्राम / एमएल) के लिए blasticidin जोड़कर transduced कोशिकाओं के चयन के शुरू और प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी (Figure1) का उपयोग कर लाल कोशिकाओं के लिए निगरानी।
- संस्कृति एक टिशू कल्चर डिश में लगभग 10 6 कोशिकाओं बोने और दैनिक visualizing एक प्रकाश माइक्रोस्कोप का उपयोग कर जब तक सेल monolayer मिला हुआ है द्वारा ID8 माध्यम में आरएफपी टैग कोशिकाओं।
- जब मिला हुआ है, कोशिकाओं trypsin (0.25%, 3 मिनट) का उपयोग कर फसल और 37 ओ सी इनक्यूबेटर कुप्पी वापस जब तक कोशिकाओं को अलग कर रहे हैं।
- ID8 संस्कृति सीरम युक्त मध्यम के 6 मिलीलीटर के साथ trypsin बेअसर। ऊपर पिपेट और डिश के तल के खिलाफ नीचे है, तो एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब को हस्तांतरण। 2 मिनट के लिए 1200 rpm पर अपकेंद्रित्र, तो एक जीएल का उपयोग कर मध्यम aspirateगधा पिपेट।
- धीरे गर्म पीबीएस 6 मिलीलीटर में resuspending और ऊपर 1.5 में के रूप में centrifuging द्वारा फॉस्फेट खारा बफर (पीबीएस) के साथ कोशिकाओं को धो लें। 5 एक्स 10 6 कोशिकाओं / एमएल के एक अंतिम एकाग्रता के लिए पीबीएस में फिर से निलंबित। इंजेक्शन तक गर्म कोशिकाओं (37 ओ सी) रखें।
2. ID8 प्रकोष्ठों के अंतर peritoneal इंजेक्शन और vivo इमेजिंग में
- अंतर peritoneal इंजेक्शन (आईपी) के माध्यम से 10 लाख की कोशिकाओं की कुल के लिए गर्म ID8 पीबीएस समाधान के 2 एमएल के साथ प्रत्येक माउस इंजेक्षन। ट्यूमर कोशिकाओं साप्ताहिक रहते इमेजिंग के साथ लगभग 10 सप्ताह के लिए विवो में विकसित करने के लिए अनुमति दें।
- इसके तत्काल बाद इंजेक्शन और प्रत्येक सप्ताह के बाद, चूहों का वजन और उसके बाद (0.5 एल / मिनट हे 2 प्रवाह में 2.5% प्रवाह की दर) isofluorane का उपयोग कर प्रत्येक माउस anesthetize। नोट: चूहों नहीं ट्यूमर बोझ का एक मात्रात्मक उपाय है, बल्कि अध्ययन के दौरान अलग-अलग माउस भौतिक प्रगति की एक अधिक सामान्य उपाय के रूप में, तौला गया। चूहे तौलनाटीएस अपने खुद के पिछले वजन मूल्यों के साथ तुलना की गई।
- एक isofluorane कक्ष में रखकर चूहों anesthetize। प्रक्रिया के दौरान 2.5% प्रवाह की दर isofluorane के लिए जोखिम के लिए नाक शंकु में स्थिति माउस सिर से जबकि स्कैनिंग निरंतर संज्ञाहरण बनाए रखें।
- लोमनाशक क्रीम का प्रयोग करें, धड़ और प्रत्येक माउस के पेट पर बालों को हटाने के रूप में काले बाल प्रतिदीप्ति संकेत के क्षीणन का कारण होगा। चूहे लोमनाशक क्रीम के आवेदन के बाद गर्म पानी के साथ स्नान किया और आरटी कागज तौलिये के साथ सूख रहे हैं।
- anesthetized है, जबकि एक छोटे जानवर ऑप्टिकल इमेजिंग प्रणाली का उपयोग करते हुए प्रत्येक माउस के पूरे शरीर को स्कैन। हर समय बिंदु पर एक पलटन में सभी चूहों को स्कैन। निम्नलिखित दो कदम प्रोटोकॉल (2A चित्रा) का उपयोग करें:
- चरण 1 में, fluorescently लेबल (आरएफपी) ट्यूमर कोशिकाओं को निरीक्षण करने के लिए, 440 एनएम, 460 एनएम, 4 की उत्तेजना फिल्टर का उपयोग कर 5 छवियों की कुल इकट्ठा करने के लिए multispectral अधिग्रहण को अंजाम80 एनएम, 520 एनएम और 540 एनएम और 600 एनएम के एक उत्सर्जन फिल्टर। 15 सेकंड का एक मानक प्रदर्शन, 2 एक्स 2 binning, 160 मिमी FOV, और 1.1 की एफ स्टॉप: निम्नलिखित अधिग्रहण पैरामीटर का प्रयोग करें।
- चरण 2 में, पूरे जानवर निरीक्षण करने के लिए, एक खुला उत्तेजना फिल्टर (सफेद प्रकाश), एक खुला उत्सर्जन फिल्टर, के साथ 2 एक्स 2 binning 0.2 सेकंड का एक मानक जोखिम और 16 सेमी की एक FOV का उपयोग कर एक reflectance छवि अधिग्रहण। नोट: वास्तविक समय इमेजिंग ~ 1 मिनट है।
3. माउस विच्छेदन और छवि अधिग्रहण
- लाइव इमेजिंग जलोदर का व्यापक अंतर peritoneal रोग या जानवरों प्रदर्शनी संचय (के रूप में पेट बढ़ाव इसका सबूत), हानि या शरीर के वजन को 20% से अधिक, सुस्ती या संकट के अन्य लक्षण के लाभ की मौजूदगी से पता चलता है, सीओ 2 का उपयोग प्रत्येक माउस euthanize संज्ञाहरण ग्रीवा अव्यवस्था द्वारा पीछा किया।
- पूर्व माउस के उदर midline के साथ त्वचा में कटौती, बताया dissectio का उपयोग करn कैंची, रिब पिंजरे के नीचे करने के लिए जांघों के ऊपर से। केवल त्वचा की परत (चित्रा 2Bi) के माध्यम से चरम देखभाल में कटौती करने के लिए ले लो। धीरे पेरिटोनियल ऊतक से त्वचा को अलग, पेरिटोनियल दीवार पंचर नहीं करना न भूलें।
- (चित्रा 2 बी द्वितीय, तृतीय) बताया विच्छेदन कैंची, laterally कटौती दोनों रिब पिंजरे के नीचे और जांघों के शीर्ष के साथ त्वचा के दो फ्लैप बनाने के लिए उपयोग करना।
- (पेरिटोनियल गुहा नीचे का सामना करना पड़) त्वचा फ्लैप के साथ अपने उदर पक्ष पर प्रत्येक माउस प्लेस खींच लिया खुला और छोटे जानवर ऑप्टिकल इमेजिंग प्रणाली का उपयोग कर बगल में अपने अंगों के साथ प्रत्येक माउस स्कैन (चित्रा 3 ए, बी)।
- 2.4.1.-2.4.2 में वर्णित के रूप में एक ही छवि अधिग्रहण पैरामीटर का प्रयोग करें।
- जिगर, omentum / अग्न्याशय, पेट, डायाफ्राम, छोटी आंत, बड़ी आंत, बाएँ और दाएँ पेरिटोनियम, अंडाशय, kidne सहित अलग-अलग अंगों पेरिटोनियल निकालने के द्वारा माउस विदारक जारीवाईएस, अन्त्रपेशी और वसा पैड।
- निरीक्षण गिनना, और प्रत्येक अंग पर दिखाई ट्यूमर रिकॉर्ड है। प्रत्येक ट्यूमर के व्यास को मापने के लिए एक कैलीपर का प्रयोग करें।
- ट्यूमर व्यास में 2 मिमी से भी कम समय में छोटे रूप में, माध्यम के रूप में 2 और 5 मिमी और अधिक से अधिक से अधिक 5 मिमी के रूप में बड़ी के बीच में नामित।
- अंग स्कैनिंग टेम्पलेट (चित्रा 4) के लिए प्रत्येक अंग के लिए एक पूर्व निर्धारित स्थान पर पहचानती अंगों रखें। अंगों नम रखने के लिए पीबीएस का प्रयोग करें।
- छोटे जानवर ऑप्टिकल इमेजिंग प्रणाली (चित्रा -3 सी, डी) का उपयोग करते हुए अंगों के प्रत्येक शीट स्कैन करें।
- 2.4 चरण में वर्णित के रूप में एक ही छवि अधिग्रहण पैरामीटर का प्रयोग करें।
- स्कैनिंग के बाद, 10% formaldehyde में जगह अंगों ऊतक विज्ञान के लिए बाद के प्रसंस्करण सक्षम करने के लिए।
4. वीं में ट्यूमर बोझ की मात्राई प्रतिदीप्ति छवियों
- क्रम में प्रत्येक multispectral स्कैन में ऑटो प्रतिदीप्ति की मात्रा को कम करने के लिए, पहली फ़ाइलों सॉफ्टवेयर छोटे पशु इमेजिंग सिस्टम के साथ उपलब्ध का उपयोग कर unmix।
- विवो वर्णक्रम फाइल में, Autofluor के द्वारा पीछा: पहले आरएफपी लोड अमिश्रित छवियाँ खिड़की इन विवो लाल फ़ाइल और Unmix का चयन करें।
- के रूप में 16 बिट झगड़ा (unscaled) प्रारूप .bip फ़ाइलें निर्यात करें।
- ImageJ सॉफ्टवेयर (पूर्व vivo अंगों और बगल में अंगों के साथ तो पूरा माउस शरीर) का प्रयोग करें।
- ImageJ में अंग स्कैनिंग टेम्पलेट फ़ाइलों के 16 बिट झगड़ा फाइलों को खोलने के लिए फ़ाइल> प्रयोग खोलें।
- छवि के तहत> समायोजित> चमक / विपरीत, न्यूनतम 0 से मूल्य का प्रदर्शन किया और अधिकतम 35,353 करने के लिए मूल्य का प्रदर्शन किया और उसके बाद के तहत स्थापित करने के लिए चुनछवि> देखने सारणी, रेड हॉट चयन करें। नोट: विभिन्न पशु मॉडलों अलग चमक स्तर की आवश्यकता होगी, लेकिन यह चमक एक दिया अध्ययन भर में लगातार रखने के लिए महत्वपूर्ण है।
- मुक्तहस्त चयन उपकरण का उपयोग, ब्याज चयन (आरओआई) प्रत्येक अंग के आसपास के एक मुक्त रूप क्षेत्र को आकर्षित और प्रत्येक अंग की सतह क्षेत्र की गणना के लिए माप उपकरण (Ctrl + एम) का उपयोग करें; रिकॉर्ड एक स्प्रेडशीट के प्रत्येक अंग की सतह क्षेत्र।
- रॉय प्रत्येक अंग के चारों ओर खींचा साथ, सही रॉय के भीतर क्लिक करें और डुप्लिकेट का चयन केवल अंग शामिल करने के लिए।
- छवि के तहत> समायोजित> थ्रेसहोल्ड, अलग-अलग अंग पर देख रहे हैं, वहीं onl का चयन करने के लिए + 1200 की एक सीमा से कम स्तर और + 1700 एक ऊपरी सीमा के स्तर के लिए छवि की सीमा निर्धारित करने के लिए चुनY सबसे चमकते fluorescing क्षेत्रों और अंधेरे पृष्ठभूमि का चयन करने के लिए जाँच; ठीक चुनें। नोट: छवियों ImageJ में सीमा sliders के मैनुअल हेरफेर के रूप में ऊपर दिखाए गए आवश्यकता हो सकती है इतना है कि पहले से छात्रों के क्षेत्रों विश्लेषण कदम के लिए चुने गए हैं। विभिन्न रोग मॉडल अलग दहलीज की कमी की आवश्यकता होगी, लेकिन यह सीमा का स्तर एक अध्ययन दी भर में लगातार रखने के लिए महत्वपूर्ण है।
- विश्लेषण के तहत> कणों का विश्लेषण करें, बदलने का आकार (पिक्सल ^ 2) 10-अनंत, को दिखाएँ चुनें: रूपरेखा, केवल "प्रदर्शन के परिणाम" का चयन करें और दोनों क्षेत्रों और इन चमकदार क्षेत्रों के कच्चे एकीकृत घनत्व को मापने के लिए क्लिक करें ठीक करने के लिए जाँच, समझा ट्यूमर।
- रिकॉर्ड की सतह क्षेत्र के मूल्यों और प्रत्येक ट्यूमर चयन कच्चा एकीकृत घनत्व में दिखाया गया है
- विश्लेषण के तहत> उपकरण> कैलिब्रेशन बार, एक अंशांकन पैमाने पर पट्टी अंगों की छवियों को जोड़ सकते हैं। नोट: इस उदाहरण में, यह ऊपरी दाएँ, काले को भरने के रंग, सफेद लेबल रंग, लेबल की संख्या 5, 0 करने के लिए दशमलव स्थान, 12 के लिए फ़ॉन्ट आकार और ज़ूम करने के लिए स्थान बदलने के द्वारा किया गया था 4.0 के लिए फैक्टर और बोल्ड पाठ सक्षम करने से।
- फ़ाइल के तहत> इस रूप में सहेजें ..., एक झगड़ा और को .jpeg के रूप में असेंबल बचाने के लिए।
- अंगों की को .jpeg फ़ाइल और तब सम्मिलित तहत> पाठ बॉक्स खोलने के लिए फ़ाइल> ओपन का प्रयोग
- माउस संख्या के क्रम में ImageJ में पूर्ण शरीर स्कैन की 16 बिट झगड़ा फ़ाइलों में से प्रत्येक को खोलने के लिए फ़ाइल> प्रयोग खोलें।
- छवि के तहत>, समायोजित> चमक / विपरीत न्यूनतम सेट करने के लिए चुन 0 से मूल्य का प्रदर्शन किया और अधिकतम 35,353 + के लिए मूल्य का प्रदर्शन किया और उसके बाद छवि के तहत> देखने सारणी, रेड हॉट चयन करें।
- फ़ाइल के तहत> इस रूप में सहेजें ..., के रूप में एक। झगड़ा और असेंबल को .jpeg बचाने के लिए।
5. डेटा विश्लेषण
- प्रत्येक माउस के प्रत्येक अंग के लिए, ट्यूमर चयन क्षेत्रों और कच्चे एकीकृत घनत्व मे क्रमश: और प्रत्येक माउस के लिए कुल अंग ट्यूमर क्षेत्र रिकॉर्ड है।
- दर्ज की गई है क्षेत्र और कच्चे एकीकृत मानक के अनुसारइसी अंग सतह क्षेत्र (तालिका 1) द्वारा कुल ट्यूमर क्षेत्र और कुल कच्चे एकीकृत घनत्व मूल्यों को विभाजित करके प्रत्येक अंग के आकार के लिए एड घनत्व मूल्यों।
- गणना और दोनों सामान्यीकृत ट्यूमर सतह क्षेत्रों और सामान्यीकृत कच्चे एकीकृत घनत्व मूल्यों की औसत साजिश (चित्रा 5 ए, बी)।
- नेत्रहीन ट्यूमर है कि मेटास्टेटिक घावों के लिए प्रत्येक अंग के निरीक्षण के दौरान नंगी आंखों से दिखाई दे रहे थे की गणना के द्वारा प्राप्त उन लोगों के लिए इन औसत मूल्यों की तुलना करें।
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Representative Results
डिम्बग्रंथि के कैंसर के मेटास्टेटिक तंत्र अत्यधिक फैलाना इंट्रा-पेरिटोनियल मेटास्टेसिस आकार बदलती, कई छोटे (<2mm) के घावों को शामिल करने की कई घावों के शामिल की विशेषता है। इस प्रकार, (चित्रा 1) आरएफपी लेबल ट्यूमर कोशिकाओं के उपयोग और ऑप्टिकल इमेजिंग मैनुअल गिनती और घाव आकार की माप के लिए एक वैकल्पिक तरीका प्रदान करता है। समय के साथ ट्यूमर के बोझ के विकास के साप्ताहिक जलोदर की संभावित उपस्थिति गेज करने चूहों और पेट की परिधि की माप का वजन द्वारा निर्धारित किया जा सकता है। विवो में ऑप्टिकल इमेजिंग एक पूरक दृष्टिकोण ट्यूमर बोझ (चित्रा 2) का आकलन करने के लिए प्रदान करता है। डिम्बग्रंथि के कैंसर पेरिटोनियल गुहा में कई साइटों और साइट विशेष मेटास्टेसिस के आणविक चालकों के लिए metastasizes वर्तमान में अज्ञात हैं। समग्र ट्यूमर बोझ के निर्धारण के अलावा, निम्न बलिदान सावधान विच्छेदन का मूल्यांकन करने और साइट विशेष देहात यों तो किया जा सकता हैमेटास्टेसिस के tterns। इस प्रकार, सीटू पेरिटोनियल अंगों (चित्रा 3 ए, बी) के अलग-अलग अंगों के पूर्व vivo मूल्यांकन (चित्रा -3 सी, डी) के साथ संयुक्त ऑप्टिकल इमेजिंग समग्र बनाम अंग विशेष ट्यूमर बोझ पर उपयोगी डेटा प्रदान कर सकते हैं। चित्रा 3 में प्रस्तुत स्कैन ट्यूमर बोझ की डिग्री बदलती के साथ पेट cavities और चूहों के अलग-अलग अंगों पर नजर डालने के परिणाम दर्शाते हैं। उदाहरण के लिए, चित्रा -3 सी omentum / अग्न्याशय, अंडाशय और माउस ए के अन्त्रपेशी में सबसे ट्यूमर बोझ से पता चलता माउस बी, संकेत में एक महत्वपूर्ण अंतर देखा जाता है (चित्रा 3 डी) में उन्हीं अंगों की तुलना में। अंग स्कैनिंग टेम्पलेट (चित्रा 4) के उपयोग के अंग विशेष ट्यूमर बोझ की पहचान करने में मदद करता है। अंतर ट्यूमर बोझ के अवलोकन के ट्यूमर सतह क्षेत्र और ट्यूमर संकेत तीव्रता (तालिका 1, चित्रा 5) के संदर्भ में मात्रात्मक दोनों की पुष्टि की है।
चित्रा 2 और 3 में देखा ट्यूमर बोझ है कि imaged किया जा सकता है और इस विधि का उपयोग मात्रा की बड़ी रेंज को दर्शाते हैं। तालिका 1 में डेटा दोनों ट्यूमर सतह क्षेत्र और ट्यूमर के संकेत तीव्रता बढ़ाता में प्रयोज्यता की इस बड़ी रेंज को दिखाता है। उदाहरण के लिए, जब omentum पर देख / माउस एक के अग्न्याशय माउस बी की तुलना में, सामान्यीकृत ट्यूमर सतह क्षेत्र माउस एक में 26 गुना अधिक है की तुलना में माउस बी इसके अलावा, संकेत तीव्रता की बड़ी रेंज भी omentum में उदाहरण है चूहे / ए और बी के अग्न्याशय; माउस एक की सामान्यीकृत कच्चे एकीकृत घनत्व 56 बार माउस बी की तुलना में अधिक है ये परिणाम compari की वैधता का प्रदर्शनएनजी कई परीक्षण के ट्यूमर बोझ एक दूसरे के सापेक्ष विषयों, दोनों ट्यूमर सतह क्षेत्र और ट्यूमर संकेत तीव्रता के मामले में, इस त्वरित तरीका है कि आगे histologic विश्लेषण की आवश्यकता नहीं है का उपयोग कर।
चित्रा 1. ID8 Murine डिम्बग्रंथि के कैंसर कोशिकाओं एक्सप्रेस आरएफपी। (ए) चरण ID8 कोशिकाओं की छवि। (बी) ID8 कोशिकाओं के प्रतिदीप्ति छवि। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 2. लाइव ऑप्टिकल अंतर peritoneal ट्यूमर बोझ के साथ C56 / BL6 माउस की इमेजिंग। (ए) लोमनाशक क्रीम hai दूर करने के लिए इस्तेमाल किया गया था माउस स्कैनिंग से पहले के उदर सतह से आर। (बी) के प्रारंभिक उदर midline और पार्श्व चीरों दिखा आरेख। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 3। समापन बिंदु स्कैनिंग अंतर peritoneal ट्यूमर बोझ। (ए, बी) चूहे पहले माउस के उदर सतह के उद्घाटन के बाद (नीचे उदर की ओर) (सी, डी) अलग-अलग अंगों की इमेजिंग बगल में अंगों के साथ imaged हैं।। प्रत्येक अंग, विच्छेदित दृश्य ट्यूमर बोझ दर्ज की गई, और विश्लेषण के लिए अंग स्कैनिंग टेम्पलेट पर रखा गया है।लक्ष्य = "_blank"> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 4. अंग स्कैनिंग खाका। विच्छेदित अंगों स्कैनिंग के दौरान अलग-अलग अंगों के स्थितीय पहचान बनाए रखने के लिए अंग स्कैनिंग टेम्पलेट पर रखा जाता है।
।। प्रोटोकॉल में वर्णित और तालिका 1 में दिखाया गया के रूप में omentum / अग्न्याशय, अंडाशय और अन्त्रपेशी डेटा के लिए चित्रा 5. सामान्यीकृत मात्रात्मक डेटा का विश्लेषण किया गया माउस एक माउस पैनल 3 ए में स्कैन करने के लिए संदर्भित करता है; माउस बी माउस पैनल 3 बी में स्कैन करने के लिए (ए) सामान्यीकृत ट्यूमर क्षेत्र संदर्भित करता है।। इन तीनों अंगों के प्रतिदीप्ति संकेत मात्रा का ठहराव विश्लेषण का आयोजन किया और एक अनुपात के मामले में मात्रा निर्धारित किया गया थादोनों चूहों के लिए पूरे अंग सतह क्षेत्र के ट्यूमर की सतह क्षेत्र के। (बी) सामान्यीकृत कच्चे एकीकृत घनत्व। प्रतिदीप्ति इन तीनों अंगों के संकेत मात्रा का ठहराव विश्लेषण का आयोजन किया और दोनों चूहों के लिए कच्चे एकीकृत घनत्व के अनुपात के पूरे अंग सतह क्षेत्र के लिए के मामले में मात्रा निर्धारित किया गया था।
| Omentum / अग्न्याशय | |||
| सामान्यीकृत ट्यूमर क्षेत्र | सामान्यीकृत कच्चे एकीकृत घनत्व | ||
| माउस एक | 0.5346 | 5.11E + 07 | |
| माउस बी | 0.0203 | 8.97E + 05 | |
| अंडाशय | |||
| सामान्यीकृत ट्यूमर क्षेत्र | सामान्यीकृत कच्चे एकीकृत घनत्व | ||
| माउस एक | 4.79E + 07 | ||
| माउस बी | 0.0123 | ||
| अन्त्रपेशी | |||
| सामान्यीकृत ट्यूमर क्षेत्र | सामान्यीकृत कच्चे एकीकृत घनत्व | ||
| माउस एक | 0.2951 | 2.22E + 07 | |
| माउस बी | 0.0098 | 4.15E + 05 | |
तालिका 1 सामान्यीकृत ट्यूमर क्षेत्र और सामान्यीकृत कच्चेOmentum / अग्न्याशय, अंडाशय और दोनों माउस ए और बी माउस पोस्ट विच्छेदन और स्कैनिंग की अन्त्रपेशी में एकीकृत घनत्व मूल्यों, प्रत्येक अंग खंडित किया गया था और इसकी प्रतिदीप्ति कुल अंग सतह क्षेत्र के ट्यूमर क्षेत्र के अनुपात में और तीव्रता का निर्धारण करने के लिए मात्रा निर्धारित इन ट्यूमर क्षेत्रों के लिए प्रतिदीप्ति। के रूप में वे दोनों सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण समूहों के भीतर सबसे मजबूत संकेतों प्रतिदीप्ति था omentum / अग्न्याशय, अंडाशय और अन्त्रपेशी चयन किया गया था।
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Discussion
मानव डिम्बग्रंथि के कैंसर कोशिकाओं है कि immunocompromised चूहों में आयोजित किया जाना चाहिए का उपयोग अध्ययन के विपरीत, प्रोटोकॉल ऊपर वर्णित असुरक्षित C57 / BL6 चूहों और syngeneic murine या गर्भाशय के कैंसर की कोशिकाओं का इस्तेमाल करता है। इस ट्यूमर प्रगति और मेटास्टेसिस में प्रतिरक्षा पैठ की संभावित भूमिका के मूल्यांकन के लिए सक्षम बनाता है, वहीं पेट की सतह पर काले बालों की उपस्थिति इमेजिंग कम संवेदनशील बना देता है। बाल इमेजिंग के लिए पहले छवि अधिग्रहण को बढ़ाता है निकालने के लिए एक लोमनाशक का प्रयोग करें, लेकिन समय लेने वाली है, विशेष रूप से अनुदैर्ध्य इमेजिंग की आवश्यकता के प्रयोगों के लिए है। गंजा 'नग्न' चूहों इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल किया जा सकता है और लोमनाशक आधारित बालों को हटाने की आवश्यकता नहीं है। इसके अलावा, नग्न चूहों एक प्रतिरक्षा प्रणाली के कामकाज की कमी है, तो भी प्रयोगों में मानव डिम्बग्रंथि के कैंसर कोशिकाओं के विकास का आकलन करने के लिए जिसमें प्रतिरक्षा प्रणाली का योगदान विश्लेषण के तहत नहीं है उपयोग किया जा सकता है।
यह भी कि intraper की गहराई ध्यान दिया जाना चाहिएitoneal ट्यूमर भी, तकनीकी चुनौतियां प्रस्तुत के रूप में ऑप्टिकल प्रतिदीप्ति इमेजिंग आम तौर पर 5 मिमी से अधिक गहराई में ट्यूमर का पता नहीं लगा होगा। इसके अलावा, जलोदर द्रव की व्यापकता और जलोदरग्रस्त ट्यूमर कोशिकाओं की उपस्थिति अतिरिक्त जटिलताओं प्रदान करते हैं। हम जलोदर तरल पदार्थ के गठन में महत्वपूर्ण माउस के लिए माउस परिवर्तनशीलता मनाया है, तब भी जब एक ही सेल लाइन के साथ इंजेक्शन। इस प्रकार जलोदर की उपस्थिति में, इस विधि के बजाय प्रगति की दिनचर्या अनुदैर्ध्य इमेजिंग अंग विशेष ट्यूमर बोझ से अंत बिंदु विश्लेषण के लिए बेहतर है। वर्तमान मामले में, ट्यूमर बोझ में नाटकीय परिवर्तन उदाहरण चूहों के बीच में उल्लेख किया गया है, जैसे कि चार से पांच चूहों के साथियों आमतौर पर सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए पर्याप्त होगा। ट्यूमर बोझ में कम नाटकीय मतभेद के मामले में, अतिरिक्त प्रायोगिक विषयों सांख्यिकीय सत्ता तक पहुंचने के लिए आवश्यक हो जाएगा। इस के साथ साथ दिखाया उदाहरण ट्यूमर की मात्रा में काफी अलग है, जबकि ऑप्टिकल प्रतिदीप्ति इमेजिंग के लिए इस्तेमाल किया जा सकता, अंग विशेष ट्यूमर बोझ में बहुत छोटे मतभेदों का पता लगाने के लिए विशेष रूप से जब वजन करने के लिए या .Resolution तुलना में छोटे घावों पर कैलीपर आधारित माप (नहीं दिखाया गया है) और संवेदनशीलता सेल लाइन और इमेजिंग प्रणाली के साथ अलग अलग होंगे। वर्तमान मामले में, व्यास में 400 माइक्रोन के रूप में छोटे मेटास्टेटिक प्रत्यारोपण का संकल्प लिया और मात्रा निर्धारित किया जा सकता है। विपरीत बढ़ाकर कंप्यूटेड टोमोग्राफी (सीटी), चुंबकीय अनुनाद (एमआर) इमेजिंग, और पोजीट्रान एमिशन टोमोग्राफी (पीईटी) सहित वैकल्पिक तरीकों अनुदैर्ध्य इमेजिंग 14,15 के लिए वर्णित किया गया है। संयुक्त शारीरिक और कार्यात्मक इमेजिंग सहित तौर तरीकों विकास 16 के तहत भी कर रहे हैं।
ट्यूमर बोझ की मात्रा का ठहराव के लिए इस प्रस्तावित विधि के संबंध में, यह है कि प्रतिदीप्ति थ्रेसहोल्ड [चरण 4.3.5।] का दृढ़ संकल्प प्रतिदीप्ति अंग छवियों में देखा की तीव्रता के आधार पर किया जाता है ध्यान दिया जाना चाहिए [चरण 4.3.2।] और उपयोगकर्ता द्वारा चुना जाता है relat केवल सबसे फ्लोरोसेंट क्षेत्रों को शामिल करने केअंग के आराम करने के ive। परिवर्तनीय दहलीज मूल्यों इस अध्ययन में इस्तेमाल अंतिम सीमा मूल्यों को निर्धारित करने से पहले विश्लेषण में इस्तेमाल किया गया। एक बार चुना गया, ये वही थ्रेसहोल्ड का विश्लेषण के रूप में तो क्या शोधकर्ता द्वारा किया जाता प्रारंभिक दृश्य विश्लेषण द्वारा मेटास्टेटिक ऊतक समझा जाता है की मात्रा का ठहराव में स्थिरता सुनिश्चित करने के हर अंग के लिए इस्तेमाल किया गया। इन थ्रेसहोल्ड के निर्धारण के रूप में व्यक्तिगत शोधकर्ता द्वारा निर्धारित एक परियोजना से दूसरे से भिन्न हो सकता प्रक्रिया में एक महत्वपूर्ण कदम है और संभवतः। इस मामले में, एक बड़े कम सीमा के रूप में तो केवल उच्चतम तीव्रता प्रतिदीप्ति संकेतों पर कब्जा करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। विश्लेषण किया हर अंग के लिए यह एक ही सीमा का उपयोग करके, विश्लेषण और परिणाम चूहों के इस पलटन के संदर्भ में तुलनात्मक मात्रात्मक परिणाम प्रदान करते हैं। इस विधि में ट्यूमर की सतह क्षेत्र के निरपेक्ष मूल्यों की मात्रा का ठहराव में सीमित है, वहीं यह शोधकर्ताओं ही एक रिश्तेदार के बीच सामान्यीकृत ट्यूमर बोझ की तुलना करने की क्षमता देता हैएन डी चूहों के साथियों के भीतर विभिन्न अंगों। यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि इस दृष्टिकोण ट्यूमर है कि नग्न आंखों को दिखाई नहीं कर रहे हैं की मात्रा का ठहराव भी शामिल है।
व्यापक रूप से प्रचारित intraperitoneal carcinomatosis में ईओसी परिणाम कई ऊतकों और अंगों, इष्टतम साइटोरिडक्टिव शल्य-चिकित्सा प्रतिपादन तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण को शामिल करने की अनोखी मेटास्टेटिक तंत्र। पूरा cytoreduction सकारात्मक समग्र अस्तित्व के साथ संबद्ध के रूप में, यह है कि नई चिकित्सकीय रणनीति के विकास इंट्रा-पेरिटोनियल मेटास्टेसिस warranted है मुकाबला करने के लिए इस प्रकार है। चिकित्सीय प्रभावकारिता का आकलन है, तथापि, ट्यूमर बोझ की सटीक quantitation, अंग विशेष मेटास्टेसिस के मूल्यांकन सहित पर निर्भर है। अंग autofluorescence के लिए सही बगल में आरएफपी टैग ट्यूमर कोशिकाओं, सावधान पूर्व vivo इमेजिंग अंग के साथ संयुक्त ऑप्टिकल इमेजिंग का उपयोग करना, हम intraperitoneal अंग विशेष ट्यूमर बोझ यों के लिए एक दृष्टिकोण विकसित किया है। दिलचस्प है, हमारे विश्लेषण दिखानेइस मॉडल में मेटास्टेसिस की है कि पसंदीदा साइटों, के रूप में ट्यूमर बोझ / सतह क्षेत्र द्वारा परिभाषित, डिम्बग्रंथि के कैंसर (omentum, अंडाशय, आंत, अन्त्रपेशी) 2,4,5 के साथ महिलाओं में पाए जाने वाले के समान हैं। इसलिए इस दृष्टिकोण प्रयोगात्मक मेटास्टेटिक रोग को लक्ष्य बनाया गया चिकित्सा विज्ञान के मूल्यांकन में भविष्य उपयोगिता होनी चाहिए।
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Disclosures
यह लेख मल्टीमॉडल पूर्व नैदानिक इमेजिंग पर एक विशेष अंक, BRUKER BIOSPIN द्वारा प्रायोजित का हिस्सा है।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Corning | 10-014-CM | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 10437-028 | |
| penicillin/streptomycin | |||
| Insulin-transferrin-sodium selenite media supplement | Sigma | I-1884 | |
| Bruker Xtreme small animal imaging system | Bruker Corp. | ||
| Bruker Multispectral software | Bruker Corp | ||
| lentiviral particles with Red fluorescent protein | GenTarget, Inc. | LVP023 | |
| trypsin for cell culture | Corning | 25-053-CI | |
| PBS | Corning | 21-040-CM | |
| depilatory cream (such as Nair Hair Remover Lotion) | purchases from drugstore | n/a | |
| ImageJ software | http://imagej.nih.gov/ij/ | free download | |
| dissecting tools (forceps) | Roboz Surgical Instrument | RS 5130 | |
| dissecting tools (Scissors) | Roboz Surgical Instrument | RS 5910 |
References
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