Introduction
المغلف النووي (NE) يفصل جبلة النواة عن السيتوبلازم. وهي تتألف من الغشاء النووي الداخلي والخارجي (الحركة الوطنية العراقية وONM، على التوالي) التي تربط في المسام النووية. ويسمى التجويف الذي رسمه كل من الأغشية مساحة محيط بالنواة (المحيطي). وONM هو امتداد الشبكة الإندوبلازمية الخشنة (ER)، والحركة الوطنية العراقية تتمسك الصفيحة النووية، كانت شبكة من النووي نوع-V خيوط المتوسطة ممثلة A- و B-نوع lamins 1،2. LInkers من Nucleoskeleton والهيكل الخلوي (لينك) المجمعات هي المجالس الجزيئات التي تمتد المغلف النووي بأكمله للاتصال جسديا داخل نواة لخيوط هيكل الخلية والمحركات الجزيئية (الشكل 1A). وهي تتألف من التفاعلات بين الزخارف الحفاظ تطويريا التي تميز عائلتين من البروتينات الغشاء لا يتجزأ من NE: الشمس (Sad1 / Unc84) البروتينات وNesprins (النووية مغلف SPectRINS). في الثدييات، Sun1 وSun2 عالبريد البروتينات عبر الغشاء من الحركة الوطنية العراقية الذي المنطقة النواة إلى الهيولى N-محطة يتفاعل مباشرة مع A- و B-نوع lamins 3-5. على الجانب الآخر من الحركة الوطنية العراقية، في الجهاز العصبي المحيطي، والبروتينات الشمس تؤوي إمتداد التطوري-حفظها من ~ الأحماض الأمينية 150 C-محطة تدعى المجال أشعة الشمس. المجالات SUN تتفاعل مباشرة مع كاش التطوري-المحفوظة (Klarsicht / حزب المؤتمر الوطني الافريقي-1، المتزامنة التماثل) المجال، توقيع الجزيئي للNesprins. تتكون المجالات كاش من امتداد ~ 30 الأحماض الأمينية-C المحطة أن يبرز في الجهاز العصبي المحيطي تليها مجال الغشاء 6. لا يقل عن أربعة جينات Nesprin مميزة (Nesprin1-4) ترميز كاش المحتوية على البروتينات التي توطين في NE 7. المناطق حشوية من Nesprins، التي تختلف أحجام من ~ 50kDa (Nesprin4) إلى مذهل 1000 كيلو دالتون (Nesprin1 العملاقة)، تحتوي على إسبكترن متعددة يكرر وكذلك الزخارف محددة تمكن تفاعلها مع مكونات هيكل الخلية مثل الأكتين، plectin والمحركات الجزيئية 8- 13.
<ص الطبقة = "jove_content"> دراسات في الفقاريات واللافقاريات أظهرت أن لامين / الأحد / Nesprin / المحركات الجزيئية تشكل "محور" الحفظ تطويريا السيطرة على الهجرة النووية ومرسى. وقد وصفت عدة طرق المغادرة (KO) نماذج الماوس من مكونات ينك معقدة وكان أساسيا في توفير إطار لفهم أدوار الشمس وNesprin البروتينات في NE خلال تطوير الثدييات 9،14،15. ولكن هذه النماذج الحالية عدة عيوب كبيرة، أبرزها: 1) صعوبة في تفسير الظواهر المقرر أن الخلية الآثار غير المتمتعة بالحكم الذاتي، 2) صعوبة في التمييز المساهمات phenotypical من كاش المحتوية مقابل كاش أقل Nesprin إيسفورمس 16، 3) التكرار وظيفية من الشمس وNesprin البروتينات في NE في العديد من أنواع الخلايا يتطلب مخططات تربية معقدة لتعطيل جميع التفاعلات SUN-كاش في الفئران 17 و 4) من الفتك فترة ما حول الولادة من الفئران التي تعاني من نقص للكاش المجال على حد سواءNesprins1 و2 يحول دون تحليل الظواهر الكبار 18.يصف هذا البروتوكول نموذج الفأر رواية تهدف إلى تعطيل جميع التفاعلات SUN-كاش في الجسم الحي، في زنزانة بطريقة ذاتية الحكم وينظم تنمويا، وبالتالي تجاوز كثير من السلبيات المذكورة أعلاه. يعتمد هذا لجنة المساواة العرقية / القائم السلمون المدخن نموذج الفأر على مفهومين هامين: 1) المجال كاش من أي بروتين Nesprin معروفة كافية لاستهداف EGFP إلى NE في أنظمة زراعة الخلايا و2) مجالات SUN تتفاعل باباحه مع مجالات كاش، وبالتالي overexpression من وأي مجال كاش تشبع جميع المجالات SUN الداخلية ووقف نشاط المجمعات ينك بطريقة المهيمنة سلبية 17 (الشكل 1B). يصف هذا البروتوكول حصاد الأنسجة وخطوات المعالجة المستخدمة للتأكد من تعطيل جميع التفاعلات SUN-كاش في الخلايا العصبية للدماغ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
بيان الأخلاق: إجراءات التي تجرى على الحيوانات وتمت الموافقة من قبل لجنة المؤسسي رعاية الحيوان واستخدام (IACUC) في جامعة واشنطن في سانت لويس.
1. ماوس تربية والتنميط الجيني
- تولد تيراغرام (CAG-LacZ / EGFP-KASH2) الفئران مع تيراغرام (PCP2-لجنة المساواة العرقية) الفئران لانتاج تيراغرام (PCP2Cre CAG-EGFP / KASH2) 19،20. ملاحظة: في حين أن ما تبقى من هذا البروتوكول تركز على استخدام خط تيراغرام (PCP2-لجنة المساواة العرقية) الماوس لتقييد EGFP-KASH2 التعبير إلى الخلايا العصبية في المخيخ، يمكن اتباع إجراء مماثل مع أي تيراغرام (لجنة المساواة العرقية) الماوس الأخرى ( الشكل 2A).
- أداء التنميط الجيني لتحديد الجراء إيواء كل من EGFP والجينات المحورة لجنة المساواة العرقية كما هو موضح سابقا (19).
2. إعداد مواد للتشريح والأنسجة مجموعة
- إعداد 100 مل من السكروز 30٪ في برنامج تلفزيوني (30 ز السكروز / 100 مل من 1X PBS) وتخزينها في -20 ° C. يوم الأنسجة حarvesting، ذوبان الجليد وتحميل ~ 30-35 مل من محلول السكروز إلى حقنة 35 مل لperfusions transcardial.
- إعداد 40 مل من 4٪ PFA في برنامج تلفزيوني (10 مل 16٪ امتصاص العرق و 30 مل PBS). تحميل ~ 30-35 مل من 4٪ PFA إلى حقنة 35 مل لperfusions transcardial.
- ملء 10 سم نسيج لوحة الثقافة مع 10 مل من برنامج تلفزيوني لتشريح الأنسجة.
- إعداد كوكتيل الكيتامين / زيلازين تتكون من 16 ملغ / مل الكيتامين و 3 ملغ / مل زيلازين.
- إعداد محلول من الايثانول 70٪ للتشريح.
3. تشريح والأنسجة مجموعة
- باستخدام حقنة 1 مل، وضخ 500 ميكرولتر من كوكتيل الكيتامين / زيلازين لكل 25 غرام من وزن الجسم وانتظر ~ 15 دقيقة. بدلا من ذلك، استخدام أسلوب التخدير أخرى وافق مؤسسيا الذي يتناسب مع النظام البيولوجي للاهتمام.
- على التخدير، قرصة بلطف مخلب الخلفي لتأكيد عدم استجابة الألم، ويعلقون كل الكفوف على صينية الستايروفوم مع الجانب الظهري للالماوس لأسفل.
- رش البطن مع الايثانول 70٪ وإجراء شق من أسفل البطن إلى أعلى القفص الصدري للوصول إلى القلب.
- إجراء شق صغير في الأذين الأيمن من القلب وإدراج حقنة تحتوي على محلول السكروز 30٪ إلى البطين الأيسر من القلب.
- يروي حل بمعدل ~ 2-5 مل لكل دقيقة. عندما تكون فارغة، وإزالة حقنة وتكرار مع 4٪ PFA حل.
- بفصل الماوس من علبة الستايروفوم وقطع رأس للوصول إلى الدماغ.
- إزالة الجلد حول الرأس من الحيوان باستخدام ملقط ومقص. كزة حفرة في الجزء الخلفي من الجمجمة مع إبرة وإزالة بعناية الجمجمة مع مقص وملقط تشريح.
- مرة واحدة في الدماغ يمكن الوصول إليها بشكل واضح، واستخدام ملقط لإزالة المخيخ ووضعه في برنامج تلفزيوني. شطر المخيخ في المستوى السهمي مع مشرط ونقل إلى حل السكروز 30٪ بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. ملاحظة: لالإعداديةهي أقسام البارافين، إصلاح المخيخ بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية في 4٪ PFA قبل تضمين الأنسجة وباجتزاء.
4. معالجة الأنسجة وباجتزاء
- إعداد الطين من الثلج الجاف وغاز البوتان 2-الميثيل. السماح لدرجة حرارة الحمام لكي تتوازن لمدة 5 دقائق.
- ملء cryomold مع أكتوبر المجمع ووضع نصف من المخيخ شطر في القالب.
- باستخدام مجهر تشريح وزوج من ملقط موقف المخيخ بحيث سطح شطر (بالقرب من خط الوسط من المخيخ) هو مواجهة.
- نقل cryomold إلى الطين الجليد الجاف لمدة 5 دقائق حتى شكلت مجمع أكتوبر مصفوفة صلبة بيضاء حول عينة الأنسجة. ملاحظة: يمكن الآن أن يتم تخزين العينات المجمدة في -20 ° C إذا لزم الأمر.
- التسمية مسبقا المعاملة الشرائح بولي يسين لجمع أقسام الأنسجة وإعداد ناظم البرد وفقا لتعليمات الشركة الصانعة من أجل جمع 15 ميكرون أقسام قيراللجوء إلى الحرب. لجمع المقاطع، اتصل بعناية القسم أكتوبر مع الجانب بولي يسين المغلفة للشريحة. للحفاظ على التوجه للقسم، لا تدوير الشريحة خلال هذه الخطوة.
- أقسام تخزين الأنسجة في -20 درجة مئوية حتى الشروع في تلطيخ والتصوير.
5. تلطيخ والتصوير من أقسام المخيخ
- إعداد الحلول التالية قبل تلطيخ الأنسجة:
~ 50 مل من برنامج تلفزيوني
~ 5-10 مل من 4٪ PFA في برنامج تلفزيوني
~ 10-20 مل من 0.5٪ تريتون X-100، و 10٪ المصل حمار في برنامج تلفزيوني - أقسام المخيخ ذوبان الجليد. الأهم من ذلك، تقليل تعرضهم إلى أي مصدر ضوء مستمر ومكثف لمنع يتلاشى من EGFP.
- بمانع القلم مسعور، رسم مستطيل حول أقسام الأنسجة.
- بعد إصلاح الأجزاء مع 4٪ PFA لمدة 5 دقائق. استخدام ما يكفي من السوائل لتغطية المنطقة بأكملها حددتها حاجز مسعور (عادة ~ 500 ميكرولتر). باستخدام فراغ أو ماصة، وإعادةنقل تثبيتي يجري الحذر بشكل خاص على عدم تعكير صفو أقسام الأنسجة.
- مع ماصة، وتطبيق بلطف PBS على الشريحة دون إزعاج أقسام الأنسجة. بعد 5 دقائق استخدام الفراغ أو ماصة لإزالة بعناية السائل. كرر PBS شطف ما مجموعه ثلاث مرات.
- باستخدام ماصة، وتطبيق بعناية التخفيف المناسبة من الأجسام المضادة الأولية (3 ميكرولتر Calbindin و / أو Nesprin2 الأجسام المضادة في 900 ميكرولتر من الحل) 0.5٪ تريتون X-100، و 10٪ مصل حمار في برنامج تلفزيوني. احتضان لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة في الظلام.
ملاحظة: سوف EGFP-KASH2 تكون مرئية بواسطة المجهر مضان مباشر على الأبواب المجمدة، وأنه ليس من الضروري استخدام أجسام مضادة لمكافحة EGFP. ومع ذلك، إذا تم إعداد أقسام البارافين، تصوير EGFP-KASH2 يتطلب مناعي مع الأجسام المضادة لمكافحة EGFP. - إزالة حل الأجسام المضادة وشطف مع PBS ثلاث مرات.
- إعداد 1: 1000 التخفيفات الأجسام المضادة الثانوية اليكسا فلور 0.5٪ تريتون X-100،10٪ مصل حمار في برنامج تلفزيوني وتخزينها في الظلام.
- إزالة بلطف PBS شطف النهائي وتطبيق التخفيف الضد الثانوية لمدة ساعة واحدة في الظلام.
- إزالة حل الأجسام المضادة الثانوية، وشطف وغسل القسم ثلاث مرات. إذا لزم الأمر، وتطبيق وصمة عار النووية، مثل دابي (~ 300nM)، أثناء تطبيق برنامج تلفزيوني الأول.
- تماما إزالة حل PBS من جميع أنحاء الأنسجة ومكان ~ 5-7 ميكرولتر من تصاعد وسائل الإعلام على قسم الأنسجة. وضع ساترة الزجاج على رأس قسم الأنسجة وتوضع جانبا ل~ 15-30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الظلام.
- استخدام المجهر مضان مجهزة مرشحات مناسبة لتصور EGFP وأي موجات أخرى مناسبة لالأجسام المضادة الثانوية المستخدمة في الخطوات 5.8 / 5.9. في شرائح للدماغ، واستخدام الهدف 20X لعرض الحافات النووية EGFP-KASH2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يوضح هذا البروتوكول فائدة (/ EGFP-KASH2 CAG-LacZ) نموذج الفأر تيراغرام لتقييد EGFP-KASH2 التعبير إلى الخلايا العصبية للدماغ باستخدام تيراغرام (PCP2-لجنة المساواة العرقية) الفئران. في تيراغرام (PCP2Cre CAG-EGFP / KASH2) ذرية، يتم استئصاله وLacZ / V5 إطار القراءة المفتوحة في P6 قبل recombinase لجنة المساواة العرقية مما يؤدي إلى التعبير عن EGFP-KASH2 تستهدف على وجه التحديد إلى خلايا العصبية (الشكل 2A). كما هو متوقع، والتي تستهدف EGFP-KASH2 إلى الغلاف النووي كما يدل على ذلك نمط تشبه حافة EGFP الايجابي الملحوظ حول النواة (الشكل 2B). لتعظيم أي النمط الظاهري الفسيولوجية، من المهم للتأكد من أن أعرب EGFP-KASH2 في معظم الخلايا المستهدفة عن طريق حساب النسبة المئوية للخلايا إيجابية EGFP-KASH2 التي يشترك الملون مع الأجسام المضادة علامة خلية محددة. في هذا المثال، تم الكشف عن EGFP-KASH2 التعبير في أكثر من 70٪ من الخلايا العصبية Calbindin إيجابية (الشكل 2B). في هذه كونديستعقد، ونحن لم نلاحظ أي الظواهر النسيجية أو سلوكية كبيرة في تيراغرام من العمر 10 شهرا (PCP2Cre CAG-EGFP / KASH2) الفئران 20. فمن المهم التأكد من أن أي النمط الظاهري المورفولوجية أو السلوكي لا يعود الى التعبير خارج الرحم من EGFP-KASH2 في نوع من الخلايا / الأنسجة غير مقصودة. لهذا الشأن، لم يكن لوحظ EGFP-KASH2 في طبقة الخلايا الحبيبية أو طبقة الجزيئية من تيراغرام (PCP2Cre CAG-EGFP-KASH2) مخيخات (الشكل 2B).
وأخيرا، من المهم جدا للتأكد من مدى ينك اضطراب معقد في الخلايا معربا عن EGFP-KASH2. ويمكن تحقيق ذلك باستخدام عالية الجودة أضداد Nesprin التأكيد على نزوحهم من NE الخلايا معربا عن EGFP-KASH2. كما هو مبين في الشكل (3)، والنازحين الذاتية Nesprin2 من الغلاف النووي للخلايا العصبية التي تعبر عن EGFP-KASH2 (الشكل 3 اللوحة العلوية، الأسهم الصفراء) في حين أن الخلايا العصبية التي لا تعبر عن EGFP-KASH2 ريتافي Nesprin2 الذاتية في الغلاف النووي (الشكل 3 لوحة العلوي، السهم الأبيض). كما هو متوقع، تتزاحم السيطرة، والتي لا تعبر عن لجنة المساواة العرقية-recombinase، عرض Nesprin2 في الغلاف النووي للخلية العصبية كله السكان (الشكل 3 السهام البيضاء أسفل). وقد أكدت العديد من التقارير الآن التعبير عن EGFP-KASH2، يرافقه تشريد Nesprins الذاتية، في أنسجة إضافية وأنواع الخلايا مثل ألياف العضلات الهيكلية ومبصرات مخروط 19،21.
الشكل 1. المجمعات ينك ربط النواة إلى الهيكل الخلوي وعطلت من قبل overexpression من EGFP-KASH2. (A) تصوير المجمعات ينك التي تربط المناطق الداخلية من النواة إلى الهيكل الخلوي حشوية. لاحظ أن المجالات SUN تتفاعل مع باباحه المجالات كاشمن كل Nesprins (Nesprins 1-4). (B) overexpression من EGFP-KASH2 يزيح Nesprins الذاتية من الغلاف النووي لER، بطريقة السلبي السائد، وبالتالي فصل النواة من الهيكل الخلوي حشوية المحيطة بها.
الشكل 2. overexpression من EGFP-KASH2 تستهدف على وجه التحديد إلى الخلايا العصبية للدماغ. (A) تربية تيراغرام (CAG-LacZ / EGFP-KASH2) لتيراغرام (PCP2-لجنة المساواة العرقية) النتائج الفئران في تيراغرام (PCP2Cre CAG-EGFP-KASH2) ذرية وهو ما يعبر عنه في لجنة المساواة العرقية recombinase تحديدا في الخلايا العصبية للدماغ. على التعبير (P6)، لجنة المساواة العرقية recombinase translocates داخل النواة حيث المكوس وLacZ ORF ويؤدي EGFP-KASH2 التعبير. (B) تيراغرام (PCP2Cre CAG-EGFP-KASH2) الفئران التعبير على وجه التحديد EGFP-KASH2 في الخلايا العصبية للدماغ identifالعبوات الناسفة مع Calbindin (الملونة باللون الأحمر). لاحظ أن كل من الخلايا العصبية الحبيبية للدماغ وinterneurons طبقة الجزيئية سلبية لEGFP-KASH2 التعبير. الاختصارات: وزارة العمل: طبقة الجزيئية، PCL: طبقة الخلايا العصبية وGCL: طبقة الخلايا الحبيبية.
الشكل 3. تعطيل المجمعات ينك الذاتية في الخلايا العصبية للدماغ. واحد متحد البؤر الطائرة التعبير تبين من EGFP-KASH2 أن يزيح الذاتية Nesprin2 (الملونة باللون الأحمر) من الغلاف النووي للخلايا العصبية (الأسهم الصفراء العليا). لاحظ أن الخلايا العصبية التي تفتقر إلى EGFP-KASH2 التعبير الحفاظ Nesprin2 الذاتية في محيطهما النووي (أبيض رأس السهم). في تيراغرام (CAG-LacZ / EGFP-KASH2) تتزاحم السيطرة، لوحظ عدم وجود إشارة EGFP والكشف عن Nesprin2 في الغلاف النووي من جميع Purki
يوضح هذا البروتوكول فائدةتيراغرام (CAG-LacZ / EGFP-KASH2) نموذج الفأر لتقييد EGFP-KASH2 التعبير إلى الخلايا العصبية للدماغ باستخدام تيراغرام (PCP2-لجنة المساواة العرقية) الفئران. في تيراغرام (PCP2Cre CAG-EGFP / KASH2) ذرية، يتم استئصاله وLacZ / V5 إطار القراءة المفتوحة في P6 قبل recombinase لجنة المساواة العرقية مما يؤدي إلى التعبير عن EGFP-KASH2 تستهدف على وجه التحديد إلى خلايا العصبية (الشكل 2A). كما هو متوقع، والتي تستهدف EGFP-KASH2 إلى الغلاف النووي كما يدل على ذلك نمط تشبه حافة EGFP الايجابي الملحوظ حول النواة (الشكل 2B). لتعظيم أي النمط الظاهري الفسيولوجية، من المهم للتأكد من أن أعرب EGFP-KASH2 في معظم الخلايا المستهدفة عن طريق حساب النسبة المئوية للخلايا إيجابية EGFP-KASH2 التي يشترك الملون مع الأجسام المضادة علامة خلية محددة. في هذا المثال، تم الكشف عن EGFP-KASH2 التعبير في أكثر من 70٪ من الخلايا العصبية Calbindin إيجابية (الشكل 2B). في هذه الظروف، ونحن لم نلاحظ أي النسيجية كبيرة أو behavioraالظواهر لتر في القديم أشهر 10 تيراغرام (PCP2Cre CAG-EGFP / KASH2) الفئران 20. فمن المهم التأكد من أن أي النمط الظاهري المورفولوجية أو السلوكي لا يعود الى التعبير خارج الرحم من EGFP-KASH2 في نوع من الخلايا / الأنسجة غير مقصودة. لهذا الشأن، لم يكن لوحظ EGFP-KASH2 في طبقة الخلايا الحبيبية أو طبقة الجزيئية من تيراغرام (PCP2Cre CAG-EGFP-KASH2) مخيخات (الشكل 2B).
وأخيرا، من المهم جدا للتأكد من مدى ينك اضطراب معقد في الخلايا معربا عن EGFP-KASH2. ويمكن تحقيق ذلك باستخدام عالية الجودة أضداد Nesprin التأكيد على نزوحهم من NE الخلايا معربا عن EGFP-KASH2. كما هو مبين في الشكل (3)، والنازحين الذاتية Nesprin2 من الغلاف النووي للخلايا العصبية التي تعبر عن EGFP-KASH2 (الشكل 3 اللوحة العلوية، الأسهم الصفراء) في حين أن الخلايا العصبية التي لا تعبر عن EGFP-KASH2 الاحتفاظ الذاتية Nesprin2 في الغلاف النووي (الشكل 3 (الشكل 3 السهام البيضاء أسفل). وقد أكدت العديد من التقارير الآن التعبير عن EGFP-KASH2، يرافقه تشريد Nesprins الذاتية، في أنسجة إضافية وأنواع الخلايا مثل ألياف العضلات الهيكلية ومبصرات مخروط 19،21.
الشكل 1. المجمعات ينك ربط النواة إلى الهيكل الخلوي وعطلت من قبل overexpression من EGFP-KASH2. (A) تصوير المجمعات ينك التي تربط المناطق الداخلية من النواة إلى الهيكل الخلوي حشوية. لاحظ أن المجالات SUN تتفاعل مع باباحه المجالات كاش من جميع Nesprins (Nesprins 1-4). (B) Overexpression سو EGFP-KASH2 يزيح Nesprins الذاتية من الغلاف النووي لER، بطريقة السلبي السائد، وبالتالي فصل النواة من الهيكل الخلوي حشوية المحيطة بها. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2. overexpression من EGFP-KASH2 تستهدف على وجه التحديد إلى الخلايا العصبية للدماغ. (A) تربية تيراغرام (CAG-LacZ / EGFP-KASH2) لتيراغرام (PCP2-لجنة المساواة العرقية) النتائج الفئران في تيراغرام (PCP2Cre CAG-EGFP-KASH2) ذرية وهو ما يعبر عنه في لجنة المساواة العرقية recombinase تحديدا في الخلايا العصبية للدماغ. على التعبير (P6)، لجنة المساواة العرقية recombinase translocates داخل النواة حيث المكوس وLacZ ORF ويؤدي EGFP-KASH2 التعبير. (B) تيراغرام (PCP2Cre CAG-EGFP-KASH2) الفئران التعبير على وجه التحديد EGFP-KASH2 في الخلايا العصبية للدماغ التي تم تحديدها مع Calbindin (الملونة باللون الأحمر). لاحظ أن كل من الخلايا العصبية الحبيبية للدماغ وinterneurons طبقة الجزيئية سلبية لEGFP-KASH2 التعبير. الاختصارات: وزارة العمل: طبقة الجزيئية، PCL: طبقة الخلايا العصبية وGCL: طبقة الخلايا الحبيبية الرجاء النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3. تعطيل المجمعات ينك الذاتية في الخلايا العصبية للدماغ. واحد متحد البؤر الطائرة التعبير تبين من EGFP-KASH2 أن يزيح الذاتية Nesprin2 (الملونة باللون الأحمر) من الغلاف النووي للخلايا العصبية (الأسهم الصفراء العليا). لاحظ أن الخلايا العصبية التي تفتقر إلى EGFP-KASH2 التعبير الحفاظ على الذاتية Nesprin2 في محيطهما النووي (مثقال ذرةالبريد السهم أعلى). في تيراغرام (CAG-LacZ / EGFP-KASH2) تتزاحم السيطرة، لوحظ عدم وجود إشارة EGFP والكشف عن Nesprin2 في الغلاف النووي لجميع الخلايا العصبية (السهام البيضاء أسفل). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
الخطوة الأكثر أهمية للدراسة بنجاح دور المجمعات ينك في الجسم الحي باستخدام (/ EGFP-KASH2 CAG-LacZ) نموذج تيراغرام هو تحديد خط الماوس لجنة المساواة العرقية مناسب (ق). في الواقع، إن لجنة المساواة العرقية تنشط في غيرها من أنواع الخلايا المشاركة في مسارات مشابهة، يمكن أن تعقد تفسير النتائج. وبالتالي، فمن المهم دراسة الخلايا المجاورة، كما هو موضح هنا في طبقات الخلية الجزيئية والحبيبية في المخيخ (الشكل 2B). وبالمثل، لتعظيم أي الظواهر ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية من المهم التعرف على سلالة لجنة المساواة العرقية مع نطاق واسع التعبير لجنة المساواة العرقية عبر نوع من الخلايا في المصالح. ومن المهم أيضا أن يجري توصيف متعمق لنمط التعبير عن مكونات ينك المعقدة خلال تطوير نظام الفائدة. في الواقع، عيب واحد من (/ EGFP-KASH2 CAG-LacZ) نموذج الفأر تيراغرام هو أنه لا يقدم أي معلومات على النحو الذي تشارك البروتينات الشمس أو المتغيرات Nesprins في النظام البيولوجي شنظر التانجو. ومع ذلك، يمكن التغلب على هذه المشكلة عن طريق إجراء توصيف دقيق على المستويين نص والبروتين. في الواقع، لقد تم إجراء مثل هذه الدراسات في عدة مناسبات مما أدى إلى نتائج هامة حول دور مكونات معقدة لينك محددة خلال تطوير الجهاز العصبي المركزي والتوازن 21،22.
وأخيرا، في حين يركز هذا البروتوكول على استخدام أنسجة الجهاز العصبي المركزي ثابتة، تيراغرام (CAG-LacZ / EGFP-KASH2) الفئران يمكن أن تستخدم لعزل الخلايا والثقافة الابتدائي إلى دراسة تأثير تعطيل المجمعات ينك في المختبر. باستخدام هذا المخطط، فمن الممكن لعزل وتنقية الثقافات الأولية من الخلايا EGFP-KASH2 الإيجابية لتطبيقات مثل الوقت الفاصل بين الفيديو المجهري. هذا يتجاوز الكفاءة ترنسفكأيشن منخفضة أو إنتاج lentiviral اللازمة لأنظمة الثقافة الأولية، مثل الخلايا العصبية.
وباختصار، فإن تيراغرام (CAG-LacZ / EGFP-KASH2) الفئران تفتح آفاقا جديدة ومثيرة لدراسة المرحction المجمعات ينك في الجسم الحي أثناء العمليات التنموية الثدييات الجنينية وبعدها في طائفة واسعة من الأنسجة وأنواع الخلايا لمعالجة المسائل بيولوجيا الخلية الأساسية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لديهم ما يكشف.
Acknowledgments
شكرا المؤلفين موظفي الصرف والتصوير الأساسية، من صميم علم الوراثة الجزيئي (قسم طب وجراحة العيون والعلوم البصرية) والفأر علم الوراثة الأساسية في جامعة واشنطن في سانت لويس مدرسة الطب. معتمدة على الكتاب من قبل برنامج المنح الصغيرة من مركز ماكدونيل لالخلوية والجزيئية بيولوجيا الأعصاب، مركز الأمل للاضطرابات العصبية، والمعهد الوطني للعيون (# R01EY022632 إلى DH)، مركز المعهد الوطني للعيون الأساسية غرانت (# P30EY002687) و منحة غير المقيد من البحوث للوقاية من العمى إلى قسم العيون والعلوم البصرية.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S0389 | |
| 10x PBS | Gibco | 14200-075 | |
| 16% Paraformaldehyde Solution | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| OCT Compound | Tissue-Tek | 4583 | |
| Adhesion Slides | StatLab | M1000W | |
| Donkey Serum | Sigma Aldrich | D9663 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T9284 | |
| ImmuEdge Pen | Vector Laboratories | H-4000 | |
| Anti-Calbindin Antibody | Sigma Aldrich | C9848 | |
| Anti-EGFP Antibody | Abcam | ab13970 | |
| Anti-Nesprin2 Antibody | Previously described in Ref. 21 | ||
| Fluorescent Mounting Media | Dako | S3023 | |
| 2-methyl butane | Sigma Aldrich | O3551 |
References
- Hutchison, C. J. Lamins: building blocks or regulators of gene expression? Nature reviews. Molecular cell biology. 3, 848-858 (2002).
- Stuurman, N., Heins, S., Aebi, U. Nuclear lamins: their structure, assembly, and interactions. Journal of structural biology. 122, 42-66 (1998).
- Crisp, M., et al. Coupling of the nucleus and cytoplasm: role of the LINC complex. The Journal of cell biology. 172, 41-53 (2006).
- Haque, F., et al. SUN1 interacts with nuclear lamin A and cytoplasmic nesprins to provide a physical connection between the nuclear lamina and the cytoskeleton. Molecular and cellular biology. 26, 3738-3751 (2006).
- Hodzic, D. M., Yeater, D. B., Bengtsson, L., Otto, H., Stahl, P. D. Sun2 is a novel mammalian inner nuclear membrane protein. The Journal of biological chemistry. 279, 25805-25812 (2004).
- Starr, D. A.
- Mellad, J. A., Warren, D. T., Shanahan, C. M. Nesprins LINC the nucleus and cytoskeleton. Current opinion in cell biology. 23, 47-54 (2011).
- Fridolfsson, H. N., Starr, D. A. Kinesin-1 and dynein at the nuclear envelope mediate the bidirectional migrations of nuclei. The Journal of cell biology. 191, 115-128 (2010).
- Meyerzon, M., Fridolfsson, H. N., Ly, N., McNally, F. J., Starr, D. A. UNC-83 is a nuclear-specific cargo adaptor for kinesin-1-mediated nuclear migration. Development. 136, 2725-2733 (2009).
- Padmakumar, V. C., et al. Enaptin, a giant actin-binding protein, is an element of the nuclear membrane and the actin cytoskeleton. Experimental cell research. 295, 330-339 (2004).
- Roux, K. J., et al. Nesprin 4 is an outer nuclear membrane protein that can induce kinesin-mediated cell polarization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 2194-2199 (2009).
- Wilhelmsen, K., et al. a novel outer nuclear membrane protein, associates with the cytoskeletal linker protein plectin. The Journal of cell biology. 171, 799-810 (2005).
- Wilson, M. H., Holzbaur, E. L. Nesprins anchor kinesin-1 motors to the nucleus to drive nuclear distribution in muscle cells. Development. 142, 218-228 (2015).
- Yu, J., et al. KASH protein Syne-2/Nesprin-2 and SUN proteins SUN1/2 mediate nuclear migration during mammalian retinal development. Human molecular genetics. 20, 1061-1073 (2011).
- Zhang, X., et al. Syne-1 and Syne-2 play crucial roles in myonuclear anchorage and motor neuron innervation. Development. 134, 901-908 (2007).
- Zhang, J., et al. Nesprin 1 is critical for nuclear positioning and anchorage. Human molecular genetics. 19, 329-341 (2010).
- Stewart-Hutchinson, P. J., Hale, C. M., Wirtz, D., Hodzic, D. Structural requirements for the assembly of LINC complexes and their function in cellular mechanical stiffness. Experimental cell research. 314, 1892-1905 (2008).
- Zhang, X., et al. SUN1/2 and Syne/Nesprin-1/2 complexes connect centrosome to the nucleus during neurogenesis and neuronal migration in mice. Neuron. 64, 173-187 (2009).
- Razafsky, D., Hodzic, D. Temporal and tissue-specific disruption of LINC complexes in vivo. Genesis. 52, 359-365 (2014).
- Razafsky, D., Hodzic, D. A variant of Nesprin1 giant devoid of KASH domain underlies the molecular etiology of autosomal recessive cerebellar ataxia type I. Neurobiology of disease. 78, 57-67 (2015).
- Razafsky, D., Blecher, N., Markov, A., Stewart-Hutchinson, P. J., Hodzic, D. LINC complexes mediate the positioning of cone photoreceptor nuclei in mouse retina. PloS one. 7, e47180 (2012).
- Razafsky, D. S., Ward, C. L., Kolb, T., Hodzic, D. Developmental regulation of linkers of the nucleoskeleton to the cytoskeleton during mouse postnatal retinogenesis. Nucleus. 4, 399-409 (2013).
