Introduction
Kernekappen (NE) adskiller nucleoplasm fra cytoplasmaet. Det består af en indre og ydre kernemembranen (INM og onm henholdsvis), der forbinder de nukleare porer. Hulrummet afgrænset af begge membraner kaldes perinukleære rum (PNS). Den onm er en udvidelse af den ru endoplasmatiske reticulum (ER) og INM klæber til den nukleare lamina, en meshwork af nuklear type V intermediære filamenter repræsenteret af A- og B-typen laminer 1,2. Linkere af Nucleoskeleton og Cytoskeleton (LINC) komplekser er makromolekylære aggregater, der spænder over hele det nukleare kuvert til fysisk at forbinde det indre af kernen til cytoskeletale filamenter og molekylære motorer (figur 1A). De består af interaktioner mellem evolutionært konserverede motiver, der karakteriserer to familier af integrerede transmembrane proteiner af NE: Sun (Sad1 / Unc84) proteiner og Nesprins (Nuclear Konvolut SPectRINS). I pattedyr, Sun1 og Sun2 are transmembrane proteiner af INM, hvis N-terminale region nucleoplasmic interagerer direkte med A- og B-typen laminer 3-5. På den anden side af INM, i PNS, Sun proteiner harbor en evolutionær-konserverede strækning af ~ 150 C-terminale aminosyrer kaldes SUN-domænet. SUN-domæner interagere direkte med den evolutionære-bevarede Kash (Klarsicht / Anc-1, Syne Homologi) domæne, den molekylære underskrift Nesprins. Kash domæner består af en strækning af ~ 30 C-terminale aminosyrer, der rager ind i PNS efterfulgt af et transmembrant domæne 6. Mindst fire distinkte Nesprin gener (Nesprin1-4) kode Kash-holdige proteiner, der lokaliserer på NE 7. De cytoplasmatiske regioner Nesprins, hvis størrelser varierer fra ~ 50 kDa (Nesprin4) til en forbløffende 1.000 kDa (Nesprin1 gigant), indeholder flere spektrin gentager samt specifikke motiver gør deres interaktion med cytoskeletale komponenter såsom actin, plectin og molekylære motorer 8- 13.
<p class = "jove_content"> Studier i hvirveldyr og hvirvelløse dyr har vist, at Lamin / Sun / Nesprin / molekylære motorer udgør en evolutionært bevaret "akse" kontrollerende nukleare migration og forankring. Adskillige knock-out (KO) musemodeller af LINC komplekse komponenter er blevet beskrevet og var medvirkende til at skabe en ramme for at forstå de roller Sun og Nesprin proteiner på NE under pattedyr udvikling 9,14,15. Men disse modeller er til stede flere væsentlige ulemper, især: 1) svært ved fortolkningen fænotyper grund til celle ikke-selvstændige effekter, 2) svært ved at adskille fænotypiske bidrag Kash-holdige vs Kash-mindre Nesprin isoformer 16, 3) funktionel redundans af Sun og Nesprin proteiner på NE i talrige celletyper kræver komplekse avl ordninger at inaktivere alle SUN-Kash interaktioner i mus 17 og 4) den perinatale dødelighed af mus mangelfulde for Kash-domænet af bådeNesprins1 og 2 udelukker analyse af voksne Fænotypers 18.Denne protokol beskriver en hidtil ukendt musemodel designet til at forstyrre alle SUN-Kash interaktioner in vivo, i en celle selvstændigt og udviklingsmæssigt reguleret måde og dermed går uden mange af de ulemper, der er skitseret ovenfor. Dette Cre / lox-baserede musemodel bygger på to vigtige begreber: 1) Kash domænet af noget kendt Nesprin protein er tilstrækkelig til at målrette EGFP til NE i cellekultursystemer og 2) SUN-domæner interagerer promiscuously med Kash-domæner, og dermed overekspression af enhver Kash domæne mætte alle endogene SUN-domæner og inaktivere LINC komplekser i en dominerende-negativ måde 17 (figur 1B). Denne protokol beskriver væv høst og forarbejdning trin, der anvendes til at bekræfte afbrydelsen af alle SUN-Kash interaktioner i cerebellare Purkinje celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Etik Statement: Procedurer, der involverer dyr forsøgspersoner blev godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg (IACUC) ved Washington University i St. Louis.
1. Mus Avl og Genotypebestemmelse
- Race Tg (CAG-LacZ / EGFP-KASH2) mus med Tg (PCP2-Cre) mus til at producere Tg (PCP2Cre CAG-EGFP / KASH2) 19,20. Bemærk: Mens den resterende del af denne protokol fokuserer på anvendelsen af Tg (PCP2-Cre) muse linje for at begrænse EGFP-KASH2 udtryk for Purkinje celler i cerebellum, kan en lignende fremgangsmåde følges med andre Tg (CRE) mus ( Figur 2A).
- Udfør genotypebestemmelse at identificere unger huser både EGFP og Cre transgener som tidligere beskrevet 19.
2. Forberedelse af materialer til Dissektion og Tissue Collection
- Fremstilling af 100 ml 30% saccharose i PBS (30 g sucrose / 100 ml 1x PBS) og opbevares ved -20 ° C. Dagen af væv harvesting, tø og belastning ~ 30-35 ml saccharose opløsning i en 35 ml sprøjte til transcardial perfusioner.
- Forbered 40 ml 4% PFA i PBS (10 ml 16% paraformaldehyd og 30 ml PBS). Load ~ 30-35 ml 4% PFA i en 35 ml sprøjte til transcardial perfusioner.
- Fyld en 10 cm vævskulturplade med 10 ml PBS for væv dissektion.
- Forbered en ketamin / xylazin cocktail bestående af 16 mg / ml ketamin og 3 mg / ml xylazin.
- Forbered en opløsning af 70% ethanol til dissektion.
3. Dissektion og Tissue Collection
- Anvendelse af en 1 ml sprøjte, injiceres 500 pi af ketamin / xylazin cocktail pr 25 gram legemsvægt og vente på ~ 15 min. Alternativt kan du bruge et andet institutionelt godkendt sedation metode, der er passende for det biologiske system af interesse.
- Ved sedation, forsigtigt klemme den bageste pote at bekræfte den manglende smerte respons, pin alle poter på en Styrofoam bakke med den dorsale side afmusen nedad.
- Spray maven med 70% ethanol og lave et snit fra den nedre abdomen til toppen af brystkassen for at få adgang til hjertet.
- Lave et lille snit i højre atrium af hjertet og indsætte sprøjten med 30% saccharoseopløsning i den venstre ventrikel af hjertet.
- Perfundere opløsningen ved en hastighed på ~ 2-5 ml pr min. Når den er tom, fjern sprøjten og gentag med 4% PFA løsning.
- Frigøre musen fra Styrofoam bakken, og halshugge at få adgang til hjernen.
- Fjern skindet omkring hovedet af dyret ved hjælp af pincet og saks. Stikke et hul i den bageste del af kraniet med en nål og forsigtigt fjerne skallen med en saks og pincet dissekere.
- Når hjernen er klart tilgængelig, skal du bruge pincet til at fjerne lillehjernen og placere den i PBS. Gennemskære lillehjernen i det sagittale plan med en skalpel og overføre til 30% saccharose-opløsning natten over ved 4 ° C. Bemærk: For at preper paraffinsnit fastsætte lillehjernen natten over ved 4 ° C i 4% PFA før væv indlejring og sektionering.
4. Tissue Forarbejdning og Sektionsinddeling
- Der fremstilles en opslæmning af tøris og 2-methylbutan. Lad temperaturen af badet ækvilibrere i 5 min.
- Fyld en kryoformen med OCT-forbindelse og placere den ene halvdel af det halverede lillehjernen i formen.
- Anvendelse af et dissektionsmikroskop og et par tænger position lillehjernen, så det halverede overflade (nær midterlinjen af cerebellum) vender opad.
- Overfør kryoformen til tøris gylle i 5 min, indtil OLT forbindelsen har dannet en solid hvid matrix omkring vævsprøve. Bemærk: De frosne prøve kan nu opbevares ved -20 ° C, hvis det kræves.
- Label forbehandlede poly-lysin objektglas til opsamling vævssnit og forberede kryostaten ifølge producentens instruktioner med henblik på at indsamle 15 um sektioner af cerebellum. At indsamle sektionerne, omhyggeligt kontakte OLT sektion med poly-lysin coatede side af slæden. For at bevare orienteringen af afsnittet, ikke rotere slide under dette trin.
- Store vævssnit ved -20 ° C indtil videre med farvning og billedbehandling.
5. Farvning og Imaging af lillehjernen Sektioner
- Forbered følgende løsninger før vævsfarvning:
~ 50 ml PBS
~ 5-10 ml 4% PFA i PBS
~ 10-20 ml 0,5% Triton X-100, 10% donkey serum i PBS - Optø cerebellare sektioner. Vigtigere er det, minimere deres eksponering for enhver kilde til vedvarende og intense lys for at forhindre fading af EGFP.
- Ved hjælp af en hydrofob barriere pen, tegne et rektangel rundt om vævssnit.
- Post-fastsætte sektioner med 4% PFA i 5 min. Brug tilstrækkelig væske til at dække hele området afgrænset af den hydrofobe barriere (normalt ~ 500 pi). Ved hjælp af et vakuum eller pipette, reflytte fiksativ er særlig omhyggelig med ikke at forstyrre vævssnit.
- Med en pipette forsigtigt anvende PBS på diaset uden at forstyrre vævssnit. Efter 5 min bruge vakuum eller pipette til forsigtigt at fjerne væsken. Gentag PBS skylles i alt tre gange.
- Ved hjælp af en pipette forsigtigt anvende en passende fortynding af primære antistoffer (3 pi calbindin og / eller Nesprin2 antistof pr 900 pi opløsning) i 0,5% Triton X-100, 10% æsel serum i PBS. Pladen inkuberes i en time ved stuetemperatur i mørke.
Bemærk: EGFP-KASH2 vil være synlig ved direkte fluorescensmikroskopi på frosne sektioner, og det er ikke nødvendigt at anvende et anti-EGFP-antistof. Men hvis paraffinsnit er udarbejdet, billeddannelse af EGFP-KASH2 kræver immundetektion med et anti-EGFP antistof. - Fjern antistofopløsning og skyl med PBS tre gange.
- Forbered 1: 1000 fortyndinger af Alexa Fluor-sekundære antistoffer i 0,5% Triton X-100,10% æsel serum i PBS og opbevares i mørke.
- Fjern forsigtigt den endelige PBS skylning og anvende det sekundære antistof fortynding i en time i mørke.
- Fjern det sekundære antistof opløsning, skylles og vaskes sektionen tre gange. Hvis det er nødvendigt, anvende en nuklear farvning, såsom DAPI (~ 300 nM), under den første PBS ansøgning.
- Helt fjerne PBS-opløsning fra hele vævet og sted ~ 5-7 pi montering medier på vævssnittet. Placer et dækglas på toppen af vævssnittet og der er afsat til ~ 15-30 minutter ved stuetemperatur i mørke.
- Brug et fluorescensmikroskop udstyret med passende filtre for at visualisere EGFP og alle andre bølgelængder er egnede til de sekundære antistoffer anvendes i trin 5.8 / 5.9. I cerebellare skiver, brug en 20X målsætning at se EGFP-KASH2 nukleare fælge.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne protokol illustrerer nytten af Tg (CAG-LacZ / EGFP-KASH2) musemodel for at begrænse EGFP-KASH2 udtryk for cerebellare Purkinje celler ved hjælp Tg (PCP2-CRE) mus. I Tg (PCP2Cre CAG-EGFP / KASH2) afkom, er LacZ / V5 åbne læseramme udskåret på P6 af Cre-rekombinase hvilket fører til ekspression af EGFP-KASH2 specifikt rettet mod Purkinje-celler (figur 2A). Som forventet er EGFP-KASH2 målrettet til kernekappen som angivet ved EGFP-positive rim-lignende mønster observeret omkring kernen (figur 2B). For at maksimere en hvilken som helst fysiologisk fænotype, er det vigtigt at sikre, at EGFP-KASH2 udtrykkes i de fleste målrettede celler ved at beregne procentdelen af EGFP-KASH2 positive celler, der co-farvet med en celle-specifikt antistof markør. I dette eksempel blev EGFP-KASH2 ekspression påvist i mere end 70% af calbindin-positive Purkinjeceller (figur 2B). I disse betintioner, vi ikke observere nogen signifikante histologiske eller adfærdsmæssige fænotyper 10 måneder gamle Tg (PCP2Cre CAG-EGFP / KASH2) mus 20. Det er vigtigt at sikre, at enhver morfologiske eller adfærdsmæssige fænotype ikke skyldes ektopisk ekspression af EGFP-KASH2 i en utilsigtet celletype / væv. Til den forbindelse blev EGFP-KASH2 ikke observeret i granulatet cellelag eller den molekylære lag af Tg (PCP2Cre CAG-EGFP-KASH2) cerebella (figur 2B).
Endelig er det vigtigt at bekræfte omfanget af LINC komplekse forstyrrelser i celler, der udtrykker EGFP-KASH2. Dette kan opnås ved hjælp af høj kvalitet anti-Nesprin antistoffer for at understrege deres forskydning fra NØ for celler, der udtrykker EGFP-KASH2. Som vist i figur 3, er endogent Nesprin2 fortrænges fra kernekappen af Purkinje celler, der udtrykker EGFP-KASH2 (figur 3 toppanelet, gule pile), mens Purkinjeceller som ikke udtrykker EGFP-KASH2 retaendogen Nesprin2 ved kernemembranen (figur 3 øverste panel, hvid pil). Som forventet kontroldyr fra samme kuld, som ikke udtrykker Cre-rekombinase, vise Nesprin2 ved kernekappen af hele Purkinje cellepopulationen (figur 3 nederste hvide pile). Adskillige rapporter har nu bekræftet udtryk for EGFP-KASH2, ledsaget af forskydningen af endogene Nesprins, i yderligere væv og celletyper såsom skelet muskelfibre og kegle fotoreceptorer 19,21.
Figur 1. LINC komplekser forbinde kernen til cytoskelettet og er forstyrret af overekspression af EGFP-KASH2. (A) Afbildning af LINC komplekser, der forbinder det indre af kernen til den cytoplasmatiske cytoskelettet. Bemærk, at SUN-domæner interagerer promiscuously med Kash domænerfra alle Nesprins (Nesprins 1-4). (B) Overekspression af EGFP-KASH2 fortrænger endogene Nesprins fra det nukleare kuvert til skadestuen, i en dominerende negativ måde, således at frakoble kernen fra den omgivende cytoplasmatiske cytoskeleton.
Figur 2. Overekspression af EGFP-KASH2 specifikt målrettet til cerebellare Purkinje celler. (A) Avl af Tg (CAG-LacZ / EGFP-KASH2) til Tg (PCP2-Cre) mus resulterer i Tg (PCP2Cre CAG-EGFP-KASH2) afkom hvor Cre-rekombinase udtrykkes specifikt i cerebellare Purkinje celler. Efter ekspression (P6), Cre-rekombinase translokerer i kernen, hvor det exciserer LacZ ORF og inducerer EGFP-KASH2 ekspression. (B) Tg (PCP2Cre CAG-EGFP-KASH2) mus specifikt udtrykker EGFP-KASH2 i cerebellare Purkinje celler IDENTIFIED med calbindin (farvet røde). Bemærk, at begge cerebellare granulneuroner neuroner og interneuroner af den molekylære lag er negative for EGFP-KASH2 ekspression. Forkortelser: Mol: Molecular lag, PCL: Purkinje cellelag og GCL: Granule cellelag.
Figur 3. Forstyrrelse af endogene LINC komplekser i cerebellare Purkinje celler. Enkelt konfokal planet viser ekspressionen af EGFP-KASH2 der fortrænger endogene Nesprin2 (farvet i rødt) fra det nukleare rammebeløb på Purkinjeceller (gule pile top). Bemærk at Purkinjeceller mangler EGFP-KASH2 udtryk opretholde endogene Nesprin2 på deres nukleare kuvert (hvid pil øverst). I Tg (CAG-LacZ / EGFP-KASH2) kontrol søskende, der ikke observeres EGFP signal og Nesprin2 opdages ved den nukleare rammebeløb på alle Purki
Denne protokol illustrerer nytten afTg (CAG-LacZ / EGFP-KASH2) musemodel for at begrænse EGFP-KASH2 udtryk for cerebellare Purkinje celler under anvendelse af TG (PCP2-CRE) mus. I Tg (PCP2Cre CAG-EGFP / KASH2) afkom, er LacZ / V5 åbne læseramme udskåret på P6 af Cre-rekombinase hvilket fører til ekspression af EGFP-KASH2 specifikt rettet mod Purkinje-celler (figur 2A). Som forventet er EGFP-KASH2 målrettet til kernekappen som angivet ved EGFP-positive rim-lignende mønster observeret omkring kernen (figur 2B). For at maksimere en hvilken som helst fysiologisk fænotype, er det vigtigt at sikre, at EGFP-KASH2 udtrykkes i de fleste målrettede celler ved at beregne procentdelen af EGFP-KASH2 positive celler, der co-farvet med en celle-specifikt antistof markør. I dette eksempel blev EGFP-KASH2 ekspression påvist i mere end 70% af calbindin-positive Purkinjeceller (figur 2B). Under disse omstændigheder har vi ikke observere nogen væsentlig histologiske eller behavioral fænotyper af 10 måneder gamle Tg (PCP2Cre CAG-EGFP / KASH2) mus 20. Det er vigtigt at sikre, at enhver morfologiske eller adfærdsmæssige fænotype ikke skyldes ektopisk ekspression af EGFP-KASH2 i en utilsigtet celletype / væv. Til den forbindelse blev EGFP-KASH2 ikke observeret i granulatet cellelag eller den molekylære lag af Tg (PCP2Cre CAG-EGFP-KASH2) cerebella (figur 2B).
Endelig er det vigtigt at bekræfte omfanget af LINC komplekse forstyrrelser i celler, der udtrykker EGFP-KASH2. Dette kan opnås ved hjælp af høj kvalitet anti-Nesprin antistoffer for at understrege deres forskydning fra NØ for celler, der udtrykker EGFP-KASH2. Som vist i figur 3, er endogent Nesprin2 fortrænges fra kernekappen af Purkinje celler, der udtrykker EGFP-KASH2 (figur 3 toppanelet, gule pile), mens Purkinje celler, der ikke udtrykker EGFP-KASH2 bevarer endogene Nesprin2 ved kernekappen (figur 3 (figur 3 nederste hvide pile). Adskillige rapporter har nu bekræftet udtryk for EGFP-KASH2, ledsaget af forskydningen af endogene Nesprins, i yderligere væv og celletyper såsom skelet muskelfibre og kegle fotoreceptorer 19,21.
Figur 1. LINC komplekser forbinde kernen til cytoskelettet og er forstyrret af overekspression af EGFP-KASH2. (A) Afbildning af LINC komplekser, der forbinder det indre af kernen til den cytoplasmatiske cytoskelettet. Bemærk, at SUN-domæner interagerer promiscuously med Kash domæner fra alle Nesprins (Nesprins 1-4). (B) Overekspression of EGFP-KASH2 fortrænger endogene Nesprins fra det nukleare kuvert til skadestuen, i en dominerende negativ måde, således at frakoble kernen fra den omgivende cytoplasmatiske cytoskeleton. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Overekspression af EGFP-KASH2 specifikt målrettet til cerebellare Purkinje celler. (A) Avl af Tg (CAG-LacZ / EGFP-KASH2) til Tg (PCP2-Cre) mus resulterer i Tg (PCP2Cre CAG-EGFP-KASH2) afkom hvor Cre-rekombinase udtrykkes specifikt i cerebellare Purkinje celler. Efter ekspression (P6), Cre-rekombinase translokerer i kernen, hvor det exciserer LacZ ORF og inducerer EGFP-KASH2 ekspression. (B) Tg (PCP2Cre CAG-EGFP-KASH2) Mus specifikt udtrykker EGFP-KASH2 i cerebellare Purkinje celler identificeret med calbindin (farvet røde). Bemærk, at begge cerebellare granulneuroner neuroner og interneuroner af den molekylære lag er negative for EGFP-KASH2 ekspression. Forkortelser: Mol: Molekylær lag, PCL: Purkinje cellelag og GCL:. Granule cellelag Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Forstyrrelse af endogene LINC komplekser i cerebellare Purkinje celler. Enkelt konfokal planet viser ekspressionen af EGFP-KASH2 der fortrænger endogene Nesprin2 (farvet i rødt) fra det nukleare rammebeløb på Purkinjeceller (gule pile top). Bemærk at Purkinjeceller mangler EGFP-KASH2 udtryk opretholde endogene Nesprin2 på deres nukleare kuvert (pinsemandage pil øverst). I Tg (CAG-LacZ / EGFP-KASH2) kontrol søskende, der ikke observeres EGFP signal og Nesprin2 opdages ved kernekappen af alle Purkinje celler (hvide pile nederst). Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det mest kritiske trin at kunne undersøge den rolle, LINC komplekser in vivo ved hjælp af Tg (CAG-LacZ / EGFP-KASH2) model er at identificere en egnet Cre mus (r). Ja, hvis Cre er aktiv i andre celletyper er involveret i lignende veje, kan det komplicere fortolkningen af resultaterne. Derfor er det vigtigt at undersøge nærliggende celler, som vist her i de molekylære og granula-cellelag i cerebellum (figur 2B). Ligeledes for at maksimere alle fysiologisk relevante fænotyper er det vigtigt at identificere en Cre-stamme med udbredt Cre-ekspression på tværs af celletypen af interesse. Det er også vigtigt at foretage en grundig karakterisering af ekspressionen mønster af LINC komplekse komponenter under udviklingen af systemet af interesse. Faktisk er en ulempe ved Tg (CAG-LacZ / EGFP-KASH2) musemodel er, at det ikke giver nogen oplysninger om, hvilke Sun proteiner eller Nesprins varianter er involveret i det biologiske system under overvejelse. Dog kan dette problem løses ved at foretage en streng karakteristik på både udskrift og protein niveauer. Faktisk har sådanne undersøgelser er foretaget ved flere lejligheder, som førte til vigtige resultater om betydningen af specifikke LINC komplekse komponenter under CNS udvikling og homeostase 21,22.
Endelig medens denne protokol er fokuseret på anvendelsen af faste CNS væv, Tg (CAG-LacZ / EGFP-KASH2) mus kan anvendes til at isolere og kultur primære celler for at studere virkningen af at forstyrre LINC komplekser in vitro. Ved hjælp af denne ordning, er det muligt at isolere og oprense primære kulturer af EGFP-KASH2-positive celler til applikationer såsom time-lapse video mikroskopi. Dette går uden lave transfektionseffektiviteter eller lentiviral produktion kræves for dyrkningssystemer primære, såsom neuroner.
Sammenfattende Tg (CAG-LacZ / EGFP-KASH2) mus åbner nye og spændende muligheder for at studere det sjovektion af LINC komplekser in vivo under embryonale og postnatale pattedyr udviklingsprocesser i en lang række forskellige væv og celletyper til at løse basale celle biologi spørgsmål.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Forfatterne takker personalet på morfologi og Imaging kerne, for Molekylær Genetik kerne (Institut for Oftalmologi og Visual Sciences) og Mouse Genetik Core på Washington University i St. Louis School of Medicine. Forfatterne er understøttet af den lille tilskud programmet fra McDonnell Center for Cellulær og Molekylær neurobiologi, Hope Center for Neurologiske, National Eye Institute (# R01EY022632 til DH), et nationalt Eye Institute center Core Grant (# P30EY002687) og en ubegrænset bevilling fra forskning at forebygge blindhed til Department of Ophthalmology og Visual Sciences.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S0389 | |
| 10x PBS | Gibco | 14200-075 | |
| 16% Paraformaldehyde Solution | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| OCT Compound | Tissue-Tek | 4583 | |
| Adhesion Slides | StatLab | M1000W | |
| Donkey Serum | Sigma Aldrich | D9663 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T9284 | |
| ImmuEdge Pen | Vector Laboratories | H-4000 | |
| Anti-Calbindin Antibody | Sigma Aldrich | C9848 | |
| Anti-EGFP Antibody | Abcam | ab13970 | |
| Anti-Nesprin2 Antibody | Previously described in Ref. 21 | ||
| Fluorescent Mounting Media | Dako | S3023 | |
| 2-methyl butane | Sigma Aldrich | O3551 |
References
- Hutchison, C. J. Lamins: building blocks or regulators of gene expression? Nature reviews. Molecular cell biology. 3, 848-858 (2002).
- Stuurman, N., Heins, S., Aebi, U. Nuclear lamins: their structure, assembly, and interactions. Journal of structural biology. 122, 42-66 (1998).
- Crisp, M., et al. Coupling of the nucleus and cytoplasm: role of the LINC complex. The Journal of cell biology. 172, 41-53 (2006).
- Haque, F., et al. SUN1 interacts with nuclear lamin A and cytoplasmic nesprins to provide a physical connection between the nuclear lamina and the cytoskeleton. Molecular and cellular biology. 26, 3738-3751 (2006).
- Hodzic, D. M., Yeater, D. B., Bengtsson, L., Otto, H., Stahl, P. D. Sun2 is a novel mammalian inner nuclear membrane protein. The Journal of biological chemistry. 279, 25805-25812 (2004).
- Starr, D. A.
- Mellad, J. A., Warren, D. T., Shanahan, C. M. Nesprins LINC the nucleus and cytoskeleton. Current opinion in cell biology. 23, 47-54 (2011).
- Fridolfsson, H. N., Starr, D. A. Kinesin-1 and dynein at the nuclear envelope mediate the bidirectional migrations of nuclei. The Journal of cell biology. 191, 115-128 (2010).
- Meyerzon, M., Fridolfsson, H. N., Ly, N., McNally, F. J., Starr, D. A. UNC-83 is a nuclear-specific cargo adaptor for kinesin-1-mediated nuclear migration. Development. 136, 2725-2733 (2009).
- Padmakumar, V. C., et al. Enaptin, a giant actin-binding protein, is an element of the nuclear membrane and the actin cytoskeleton. Experimental cell research. 295, 330-339 (2004).
- Roux, K. J., et al. Nesprin 4 is an outer nuclear membrane protein that can induce kinesin-mediated cell polarization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 2194-2199 (2009).
- Wilhelmsen, K., et al. a novel outer nuclear membrane protein, associates with the cytoskeletal linker protein plectin. The Journal of cell biology. 171, 799-810 (2005).
- Wilson, M. H., Holzbaur, E. L. Nesprins anchor kinesin-1 motors to the nucleus to drive nuclear distribution in muscle cells. Development. 142, 218-228 (2015).
- Yu, J., et al. KASH protein Syne-2/Nesprin-2 and SUN proteins SUN1/2 mediate nuclear migration during mammalian retinal development. Human molecular genetics. 20, 1061-1073 (2011).
- Zhang, X., et al. Syne-1 and Syne-2 play crucial roles in myonuclear anchorage and motor neuron innervation. Development. 134, 901-908 (2007).
- Zhang, J., et al. Nesprin 1 is critical for nuclear positioning and anchorage. Human molecular genetics. 19, 329-341 (2010).
- Stewart-Hutchinson, P. J., Hale, C. M., Wirtz, D., Hodzic, D. Structural requirements for the assembly of LINC complexes and their function in cellular mechanical stiffness. Experimental cell research. 314, 1892-1905 (2008).
- Zhang, X., et al. SUN1/2 and Syne/Nesprin-1/2 complexes connect centrosome to the nucleus during neurogenesis and neuronal migration in mice. Neuron. 64, 173-187 (2009).
- Razafsky, D., Hodzic, D. Temporal and tissue-specific disruption of LINC complexes in vivo. Genesis. 52, 359-365 (2014).
- Razafsky, D., Hodzic, D. A variant of Nesprin1 giant devoid of KASH domain underlies the molecular etiology of autosomal recessive cerebellar ataxia type I. Neurobiology of disease. 78, 57-67 (2015).
- Razafsky, D., Blecher, N., Markov, A., Stewart-Hutchinson, P. J., Hodzic, D. LINC complexes mediate the positioning of cone photoreceptor nuclei in mouse retina. PloS one. 7, e47180 (2012).
- Razafsky, D. S., Ward, C. L., Kolb, T., Hodzic, D. Developmental regulation of linkers of the nucleoskeleton to the cytoskeleton during mouse postnatal retinogenesis. Nucleus. 4, 399-409 (2013).
