Introduction
De nucleaire enveloppe (NE) scheidt de nucleoplasma van het cytoplasma. Het bestaat uit een binnenste en buitenste kernmembraan (INM en ONM, respectievelijk) die aansluiten op kernporiën. De lumen afgebakend door beide membranen heet de perinucleaire ruimte (PNS). De ONM is een uitbreiding van het ruwe endoplasmatisch reticulum (ER) en de INM hecht aan de nucleaire lamina, een maaswerk van nucleaire type V intermediaire filamenten vertegenwoordigers A- en B-type lamins 1,2. Linkers van het Nucleoskeleton cytoskelet (LINC) complexen macromoleculaire samenstellingen die de gehele kern envelop overspannen fysiek het inwendige van de kern verbinden met cytoskelet filamenten en moleculaire motoren (figuur 1A). Ze bestaan uit interacties tussen evolutionair geconserveerde motieven die twee families van integrale transmembraaneiwitten van de NE karakteriseren: Zon (Sad1 / Unc84) eiwitten en Nesprins (Nuclear Envelope SPectRINS). Bij zoogdieren, sun1 en Sun2 are transmembraaneiwitten van de INM waarvan N-terminale gebied nucleoplasmatische interageert direct met A- en B-type lamins 3-5. Aan de andere kant van de INM binnen de PNS, Zon eiwitten haven een evolutionair geconserveerde gedeelte van ~ 150 C-terminale aminozuren genoemd SUN domein. SUN domeinen interactie rechtstreeks met de evolutionaire-geconserveerde KASH (Klarsicht / Anc-1, Syne homologie) domein, de moleculaire ondertekening van Nesprins. KASH domeinen bestaan uit een stuk ~ 30 C-terminale aminozuren die uitsteekt in het PZS, gevolgd door een transmembraandomein 6. Ten minste vier verschillende Nesprin genen (Nesprin1-4) coderen KASH bevattende eiwitten die lokaliseren op de NE 7. De cytoplasmatische regio Nesprins, waarvan de afmetingen variëren van ~ 50 kDa (Nesprin4) een verbazingwekkende 1000 kDa (Nesprin1 reus), bevatten meerdere spectrin herhaald en specifieke motieven waarmee de interactie met cytoskelet componenten zoals actine, plectine en moleculaire motoren 8- 13.
<p class = "jove_content"> Studies bij gewervelde en ongewervelde dieren hebben aangetoond dat Lamin / Zon / Nesprin / moleculaire motoren vormen een evolutionair geconserveerd "as" beheersen van nucleaire migratie en verankering. Verschillende knock-out (KO) muismodellen van LINC complexe componenten zijn beschreven en waren instrumentaal in een kader om de rol van de Zon en Nesprin eiwitten in het NE begrijpen tijdens zoogdieren ontwikkeling 9,14,15. Echter, deze modellen huidige aantal belangrijke nadelen, met name: 1) moeilijkheden bij de interpretatie fenotypes als gevolg van niet-autonome effecten, 2) moeilijkheden cel onderscheiden de fenotypische bijdragen van KASH bevattende vs. KASH-less Nesprin isovormen 16, 3) het functionele redundantie van Sun en Nesprin eiwitten in het NE in talrijke celtypen vereist complexe fokprogramma's om alle SUN-KASH interacties in muizen 17 en 4) van de perinatale sterfte van muizen deficiënt voor de KASH-domein van zowel inactiverenNesprins1 en 2 zich verzet tegen de analyse van de volwassen fenotypen 18.Dit protocol beschrijft een nieuw muismodel ontworpen om alle SUN-KASH interacties in vivo te verstoren, in een cel autonome ontwikkeling gereguleerde wijze, zonder daarbij veel van de bovengenoemde nadelen. Dit Cre /-lox gebaseerde muismodel voert twee begrippen: 1) de KASH domein van elke bekende Nesprin eiwit is voldoende om EGFP richten op NO in celkweeksystemen en 2) SUN domeinen wisselwerking promiscuously met KASH domeinen, waardoor overexpressie van elke KASH domein alle endogene SUN domeinen verzadigen en inactiveren LINC complexen in een dominant-negatieve manier 17 (Figuur 1B). Dit protocol beschrijft weefsel oogsten en verwerken stappen gebruikt om de verstoring van SUN-KASH interacties in cerebellaire Purkinje cellen bevestigen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Ethiek Verklaring: Procedure waarbij proefdieren werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC) aan de Washington University in St. Louis.
1. Mouse Fokkerij en Genotyping
- Broeden Tg (CAG-LacZ / EGFP-KASH2) muizen met Tg (PCP2-Cre) muizen om Tg (PCP2Cre CAG-EGFP / KASH2) 19,20 produceren. Opmerking: Terwijl de rest van dit protocol is gericht op het gebruik van de Tg (PCP2-Cre) muizenlijn binnen het cerebellum EGFP-KASH2 expressie Purkinje cellen te beperken, kan een soortgelijke procedure gevolgd met andere Tg (Cre) muis ( Figuur 2A).
- Voeren genotypering om pups herbergen zowel EGFP en Cre transgenen zoals eerder beschreven 19 te identificeren.
2. Voorbereiding van de Materialen voor Dissection en Tissue Collection
- Bereid 100 ml 30% sucrose in PBS (30 g sucrose / 100 ml 1x PBS) en bewaar bij -20 ° C. De dag van weefsel harvesting, ontdooien en load ~ 30-35 ml van sucrose oplossing in een 35 ml spuit voor transcardial perfusies.
- Maak 40 ml van 4% PFA in PBS (10 ml 16% paraformaldehyde en 30 ml PBS). Load ~ 30-35 ml van 4% PFA in een 35 ml spuit voor transcardial perfusies.
- Vul een 10 cm weefsel kweekplaat met 10 ml PBS weefseldissectie.
- Bereid een ketamine / xylazine cocktail bestaande uit 16 mg / ml ketamine en 3 mg / ml xylazine.
- Bereid een oplossing van 70% ethanol voor de dissectie.
3. Dissection en Tissue Collection
- Met behulp van een injectiespuit 1 ml, injecteer 500 ul van ketamine / xylazine cocktail per 25 gram lichaamsgewicht en wacht ~ 15 min. U kunt ook gebruik maken van een ander institutioneel goedgekeurd sedatie methode die geschikt is voor het biologische systeem van belang is.
- Bij sedatie, zacht knijpen de achterpoot van het ontbreken van pijnreactie bevestigen pin alle poten op piepschuim lade met de dorsale zijde van demuis naar beneden.
- Spuit de buik met 70% ethanol en een insnijding van de onderbuik naar de top van de ribbenkast voor de toegang tot het hart te krijgen.
- Maak een kleine incisie in het rechter atrium van het hart en plaats de spuit met de 30% sucrose oplossing in het linkerventrikel van het hart.
- Perfuseren de oplossing bij een snelheid van ~ 2-5 ml per minuut. Wanneer leeg, verwijder de spuit en herhaal met de 4% PFA-oplossing.
- Losmaken van de muis van het piepschuim lade en onthoofden toegang tot de hersenen.
- Verwijder de huid rond de kop van het dier met behulp van pincet en een schaar. Porren een gat in het achterste deel van de schedel met een naald en verwijder voorzichtig de schedel met een schaar en ontleden tang.
- Zodra de hersenen duidelijk toegankelijk, een tang om het cerebellum te verwijderen en deze in PBS. Bisect het cerebellum in het sagittale vlak met een scalpel en overbrengen naar de 30% sucrose oplossing overnacht bij 4 ° C. Opmerking: Om prepzijn paraffinecoupes, bevestig het cerebellum overnacht bij 4 ° C in 4% PFA vóór tissue inbedding en snijden.
4. Tissue Verwerking en Sectioning
- Bereid een suspensie van droog ijs en 2-methyl- butaan. Laat de temperatuur van het bad equilibreren 5 min.
- Vul een cryomold met oktober verbinding en zet de helft van de doorgesneden cerebellum in de mal.
- Met behulp van een dissectiemicroscoop en een pincet standpunt van de kleine hersenen zodat de doorgesneden oppervlak (nabij de middellijn van het cerebellum) naar boven.
- Breng de cryomold om het droogijs slurry gedurende 5 minuten tot de verbinding oktober een stevige witte matrix rond het weefsel specimen heeft gevormd. Opmerking: Het bevroren monster kan nu worden opgeslagen bij -20 ° C indien nodig.
- Label voorbehandeld poly-lysine dia's voor het verzamelen van weefsel secties en de voorbereiding van de cryostaat volgens de instructies van de fabrikant om 15 micrometer secties van de cere verzamelenbellum. Om de secties verzamelen, voorzichtig contact opnemen met de afdeling oktober met de poly-lysine gecoate zijde van de dia. Om de oriëntatie van de punt te bewaren, moet de schuif tijdens deze stap niet roteren.
- WINKEL weefselcoupes bij -20 ° C tot verder gaat met kleuring en beeldvorming.
5. kleuring en beeldvorming van kleine hersenen secties
- Bereid de volgende oplossingen vóór weefselkleuring:
~ 50 ml PBS
~ 5-10 ml van 4% PFA in PBS
~ 10-20 ml 0,5% Triton X-100, 10% donkey serum in PBS - Dooi cerebellaire secties. Belangrijker nog, het minimaliseren van hun blootstelling aan een bron van voortdurende en intens licht te vervagen van EGFP voorkomen.
- Met behulp van een hydrofobe barrière pen, trek een rechthoek rond het weefsel secties.
- Post-fix de secties met 4% PFA gedurende 5 min. Gebruik voldoende vloeistof om het hele gebied afgebakend door de hydrofobe barrière (meestal ~ 500 pi) te dekken. Met behulp van een vacuüm of pipet, reBeweeg de fixerende is bijzonder voorzichtig het weefsel secties niet te verstoren.
- Met een pipet voorzichtig toepassing PBS op de dia zonder verstoring van het weefsel secties. Na 5 min met de stofzuiger of pipet om de vloeistof voorzichtig verwijderen. Herhaal de PBS spoelen in totaal drie keer.
- Met behulp van een pipet voorzichtig toepassing van de juiste verdunning van primaire antilichamen (3 ul Calbindin en / of Nesprin2 antilichaam per 900 ul oplossing) in 0,5% Triton X-100, 10% ezel serum in PBS. Incubeer gedurende één uur bij kamertemperatuur in het donker.
Opmerking: EGFP-KASH2 zichtbaar door directe fluorescentie microscopie op bevroren secties, en het is niet nodig om een anti-EGFP-antilichaam te gebruiken. Indien paraffine secties zijn opgesteld, beeldvorming van EGFP-KASH2 vereist immunodetectie met een anti-EGFP-antilichaam. - Verwijder de antilichaam-oplossing en spoelen met PBS driemaal.
- Bereid 1: 1000 verdunningen van Alexa-Fluor secundaire antilichamen in 0,5% Triton X-100,10% ezel serum in PBS en op te slaan in het donker.
- Verwijder voorzichtig de laatste PBS spoelen en toepassen van de secundaire antilichaam verdunning gedurende een uur in het donker.
- Verwijder de tweede antilichaam oplossing, spoelen en wassen de sectie drie keer. Indien nodig, breng dan een nucleaire vlek, zoals DAPI (~ 300 nM) gedurende de eerste PBS toepassing.
- Volledig te verwijderen van de PBS-oplossing uit de hele weefsel en plaats ~ 5-7 ul van montage media op de sectie weefsel. Plaats een glazen dekglaasje bovenop de weefselsectie en gereserveerd voor ~ 15-30 min bij kamertemperatuur in het donker.
- Gebruik een fluorescentiemicroscoop uitgerust met de juiste filters voor EGFP en andere golflengten geschikt voor het secundaire antilichamen die in stappen 5,8 / 5,9 visualiseren. In cerebellaire plakjes, gebruik dan een 20X doelstelling EGFP-KASH2 nucleaire velgen bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dit protocol illustreert de bruikbaarheid van de Tg (CAG-LacZ / EGFP-KASH2) muismodel voor EGFP-expressie KASH2 cerebellaire Purkinje-cellen middels Tg (PCP2-Cre) muizen beperken. In Tg (PCP2Cre CAG-EGFP / KASH2) nakomelingen, het LacZ / V5 open leeskader wordt uitgesneden op P6 door het Cre recombinase hetgeen leidt tot de expressie van EGFP-KASH2 specifiek gericht op Purkinje cellen (Figuur 2A). Zoals verwacht, wordt EGFP-KASH2 gericht op de nucleaire enveloppe aangegeven door de EGFP-positieve rim-achtig patroon waargenomen rond de kern (figuur 2B). Om fysiologische fenotype te maximaliseren is belangrijk dat EGFP-KASH2 tot expressie in de meeste doelcellen door berekening van het percentage EGFP-KASH2 positieve cellen die co-gekleurd met een cel-specifiek antilichaam marker. In dit voorbeeld werd EGFP-KASH2 expressie gedetecteerd in meer dan 70% van Calbindin-positieve Purkinje-cellen (Figuur 2B). In deze Condities, we hebben geen significante histologische of gedragsproblemen fenotypes observeren in 10 maanden oude Tg (PCP2Cre CAG-EGFP / KASH2) muizen 20. Het is belangrijk om ervoor te zorgen dat alle morfologische of gedragsfenotype is niet te wijten aan ectopische expressie van EGFP-KASH2 in een onbedoelde celtype / weefsel. Om dat verband werd EGFP-KASH2 niet waargenomen in de korrel cellaag of de moleculaire laag van Tg (PCP2Cre CAG-EGFP-KASH2) cerebella (Figuur 2B).
Tenslotte is het belangrijk te bevestigen dat de mate van verstoring LINC complex in cellen die EGFP-KASH2. Dit kan worden bereikt met behulp van hoogwaardige anti-Nesprin antilichamen tegen verplaatsing NO van cellen die EGFP-KASH2 benadrukken. Zoals getoond in figuur 3, wordt endogene Nesprin2 verplaatst van de kernenvelop van Purkinje cellen die EGFP-KASH2 expressie (Figuur 3 bovenste paneel, gele pijlen), terwijl Purkinje cellen die niet tot expressie EGFP-KASH2 retain endogene Nesprin2 op de nucleaire envelop (Figuur 3 bovenste paneel, witte pijl). Zoals verwacht, de controle nestgenoten die niet tot expressie Cre-recombinase, geven Nesprin2 de kern envelop van het gehele Purkinje celpopulatie (figuur 3 onderste witte pijlen). Verscheidene rapporten hebben nu bevestigd de expressie van EGFP-KASH2, vergezeld van de verdringing van endogene Nesprins, extra weefsels en celtypen zoals skeletspier vezels en conus fotoreceptoren 19,21.
Figuur 1. LINC complexen sluit de kern naar het cytoskelet en worden verstoord door de overexpressie van EGFP-KASH2. (A) Afbeelding van LINC complexen die het inwendige van de kern verbinden met het cytoplasmatische cytoskelet. Merk op dat SUN domeinen interageren promiscue met KASH domeinenuit alle Nesprins (Nesprins 1-4). (B) Overexpressie van EGFP-KASH2 verdringt endogene Nesprins van de nucleaire envelop naar de ER, in een dominante negatieve manier, dus de kern van de omringende cytoplasma cytoskelet loskoppelen.
Figuur 2. Overexpressie van EGFP-KASH2 specifiek gericht op cerebellaire Purkinje cellen. (A) Het fokken van Tg (CAG-LacZ / EGFP-KASH2) naar Tg (PCP2-Cre) muizen resulteert in Tg (PCP2Cre CAG-EGFP-KASH2) nakomelingen waarbij Cre recombinase specifiek cerebellaire Purkinje-cellen tot expressie wordt gebracht. Bij expressie (P6), Cre recombinase transloceert naar de kern waar het accijns het LacZ ORF en induceert EGFP-KASH2 expressie. (B) Tg (PCP2Cre CAG-EGFP-KASH2) muizen specifiek uiten EGFP-KASH2 in cerebellaire Purkinje cellen identified met Calbindin (rood gekleurd). Merk op dat beide cerebellaire korrel neuronen en interneuronen van de moleculaire laag zijn negatief voor EGFP-KASH2 expressie. Afkortingen: MoL: Molecular laag, PCL: Purkinje cellaag en GCL: Korrel cellaag.
Figuur 3. Verstoring van endogene LINC complexen in cerebellaire Purkinje cellen. Single confocale vlak toont expressie van EGFP-KASH2 dat endogene Nesprin2 (gekleurd in rood) van de nucleaire enveloppe van Purkinje cellen (gele pijlen boven) verdringt. Merk op dat Purkinjecellen ontbreekt EGFP-KASH2 expressie behouden endogene Nesprin2 op hun nucleaire envelop (witte pijl boven). In Tg (CAG-LacZ / EGFP-KASH2) controle nestgenoten wordt geen EGFP signaal waargenomen en Nesprin2 wordt gedetecteerd bij de nucleaire envelop van alle Purki
Dit protocol illustreert de bruikbaarheid vande Tg (CAG-LacZ / EGFP-KASH2) muismodel voor EGFP-KASH2 uitdrukking aan cerebellaire Purkinje cellen met behulp van Tg (PCP2-Cre) muizen te beperken. In Tg (PCP2Cre CAG-EGFP / KASH2) nakomelingen, het LacZ / V5 open leeskader wordt uitgesneden op P6 door het Cre recombinase hetgeen leidt tot de expressie van EGFP-KASH2 specifiek gericht op Purkinje cellen (Figuur 2A). Zoals verwacht, wordt EGFP-KASH2 gericht op de nucleaire enveloppe aangegeven door de EGFP-positieve rim-achtig patroon waargenomen rond de kern (figuur 2B). Om fysiologische fenotype te maximaliseren is belangrijk dat EGFP-KASH2 tot expressie in de meeste doelcellen door berekening van het percentage EGFP-KASH2 positieve cellen die co-gekleurd met een cel-specifiek antilichaam marker. In dit voorbeeld werd EGFP-KASH2 expressie gedetecteerd in meer dan 70% van Calbindin-positieve Purkinje-cellen (Figuur 2B). In deze omstandigheden, hebben we geen significante histologische of behaviora observerenl fenotypes in 10 maanden oude Tg (PCP2Cre CAG-EGFP / KASH2) muizen 20. Het is belangrijk om ervoor te zorgen dat alle morfologische of gedragsfenotype is niet te wijten aan ectopische expressie van EGFP-KASH2 in een onbedoelde celtype / weefsel. Om dat verband werd EGFP-KASH2 niet waargenomen in de korrel cellaag of de moleculaire laag van Tg (PCP2Cre CAG-EGFP-KASH2) cerebella (Figuur 2B).
Tenslotte is het belangrijk te bevestigen dat de mate van verstoring LINC complex in cellen die EGFP-KASH2. Dit kan worden bereikt met behulp van hoogwaardige anti-Nesprin antilichamen tegen verplaatsing NO van cellen die EGFP-KASH2 benadrukken. Zoals getoond in figuur 3, wordt endogene Nesprin2 verplaatst van de kernenvelop van Purkinje cellen die EGFP-KASH2 expressie (Figuur 3 bovenste paneel, gele pijlen), terwijl Purkinje cellen die geen expressie EGFP-KASH2 behouden endogene Nesprin2 de nucleaire enveloppe (fig 3 (figuur 3 onderste witte pijlen). Verscheidene rapporten hebben nu bevestigd de expressie van EGFP-KASH2, vergezeld van de verdringing van endogene Nesprins, extra weefsels en celtypen zoals skeletspier vezels en conus fotoreceptoren 19,21.
Figuur 1. LINC complexen sluit de kern naar het cytoskelet en worden verstoord door de overexpressie van EGFP-KASH2. (A) Afbeelding van LINC complexen die het inwendige van de kern verbinden met het cytoplasmatische cytoskelet. Merk op dat SUN domeinen interageren promiscue met KASH domeinen uit alle Nesprins (Nesprins 1-4). (B) Overexpressie of EGFP-KASH2 verdringt endogene Nesprins van de nucleaire envelop naar de ER, in een dominante negatieve manier, dus de kern van de omringende cytoplasma cytoskelet loskoppelen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. Overexpressie van EGFP-KASH2 specifiek gericht op cerebellaire Purkinje cellen. (A) Het fokken van Tg (CAG-LacZ / EGFP-KASH2) naar Tg (PCP2-Cre) muizen resulteert in Tg (PCP2Cre CAG-EGFP-KASH2) nakomelingen waarbij Cre recombinase specifiek cerebellaire Purkinje-cellen tot expressie wordt gebracht. Bij expressie (P6), Cre recombinase transloceert naar de kern waar het accijns het LacZ ORF en induceert EGFP-KASH2 expressie. (B) Tg (PCP2Cre CAG-EGFP-KASH2) Muizen specifiek uiten EGFP-KASH2 in cerebellaire Purkinje cellen geïdentificeerd met Calbindin (rood gekleurd). Merk op dat beide cerebellaire korrel neuronen en interneuronen van de moleculaire laag zijn negatief voor EGFP-KASH2 expressie. Afkortingen: MoL: Molecular laag, PCL: Purkinje cellaag en GCL. Korrel cellaag Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3. Verstoring van endogene LINC complexen in cerebellaire Purkinje cellen. Single confocale vlak toont expressie van EGFP-KASH2 dat endogene Nesprin2 (gekleurd in rood) van de nucleaire enveloppe van Purkinje cellen (gele pijlen boven) verdringt. Merk op dat Purkinjecellen ontbreekt EGFP-KASH2 expressie behouden endogene Nesprin2 op hun nucleaire envelop (white pijl boven). In Tg (CAG-LacZ / EGFP-KASH2) controle nestgenoten wordt geen EGFP signaal waargenomen en Nesprin2 wordt gedetecteerd bij de nucleaire envelop van Purkinje cellen (witte pijlen onderaan). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De meest kritische stap om met succes de studie van de rol van LINC complexen in vivo met behulp van de Tg (CAG-LacZ / EGFP-KASH2) model is om een geschikte Cre muis regel (s) te identificeren. Inderdaad, als Cre actief in andere celtypes zijn betrokken bij soortgelijke trajecten, kan de interpretatie van de resultaten bemoeilijkt. Daarom is het belangrijk om nabijgelegen cellen te onderzoeken, zoals hier in de moleculaire en granulaat cellagen van het cerebellum (Figuur 2B). Ook elke fysiologisch relevante fenotypen te optimaliseren is het belangrijk om een Cre stam identificeren met wijdverspreide Cre expressie over het celtype van belang. Het is ook van vitaal belang om een diepgaande karakterisering van de expressie patroon van LINC complexe componenten te ondernemen tijdens de ontwikkeling van het systeem van belang. Inderdaad, een nadeel van de Tg (CAG-LacZ / EGFP-KASH2) muismodel is dat het geen informatie geeft verschaffen welke Zon eiwitten of Nesprins varianten betrokken bij het biologische systeem under overweging. Echter, kan dit probleem worden opgelost door het uitvoeren van een rigoureuze karakterisering bij zowel het transcript en eiwit niveaus. In feite hebben dergelijke studies verricht bij verschillende gelegenheden die tijdens CZS ontwikkeling heeft geleid tot belangrijke bevindingen over de rol van specifieke LINC complexe componenten en homeostase 21,22.
Tenslotte, hoewel dit protocol is gericht op het gebruik van vaste CNS weefsels, Tg (CAG-LacZ / EGFP-KASH2) muizen kunnen worden gebruikt voor het isoleren en kweken primaire cellen om het effect te verstoren LINC complexen in vitro bestuderen. Met deze regeling is het mogelijk te isoleren en te zuiveren primaire, EGFP-KASH2-positieve cellen voor toepassingen zoals time-lapse video microscopie. Dit omzeilt lage transfectie efficiëntie of lentivirale productie vereist voor primaire kweek systemen, zoals neuronen.
Samengevat, de Tg (CAG-LacZ / EGFP-KASH2) muizen, openen nieuwe en spannende mogelijkheden om het plezier te bestuderenctie van LINC complexen in vivo tijdens de embryonale en postnatale zoogdieren ontwikkelingsprocessen in diverse weefsels en celtypen fundamentele celbiologie vragen te beantwoorden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs danken het personeel van de morfologie en Imaging kern van de Moleculaire Genetica kern (afdeling Oogheelkunde en Visual Sciences) en van de Muis Genetica Core aan de Washington University in St. Louis School of Medicine. De auteurs worden ondersteund door de kleine subsidieprogramma van de McDonnell Centrum voor Cellulaire en Moleculaire Neurobiologie, de Hoop Centrum voor Neurologische Aandoeningen, de National Eye Institute (# R01EY022632 naar DH), een Nationaal Instituut Eye Center Core Grant (# P30EY002687) en een onbeperkte subsidie van Onderzoek naar blindheid te voorkomen dat de afdeling Oogheelkunde en Visual Sciences.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S0389 | |
| 10x PBS | Gibco | 14200-075 | |
| 16% Paraformaldehyde Solution | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| OCT Compound | Tissue-Tek | 4583 | |
| Adhesion Slides | StatLab | M1000W | |
| Donkey Serum | Sigma Aldrich | D9663 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T9284 | |
| ImmuEdge Pen | Vector Laboratories | H-4000 | |
| Anti-Calbindin Antibody | Sigma Aldrich | C9848 | |
| Anti-EGFP Antibody | Abcam | ab13970 | |
| Anti-Nesprin2 Antibody | Previously described in Ref. 21 | ||
| Fluorescent Mounting Media | Dako | S3023 | |
| 2-methyl butane | Sigma Aldrich | O3551 |
References
- Hutchison, C. J. Lamins: building blocks or regulators of gene expression? Nature reviews. Molecular cell biology. 3, 848-858 (2002).
- Stuurman, N., Heins, S., Aebi, U. Nuclear lamins: their structure, assembly, and interactions. Journal of structural biology. 122, 42-66 (1998).
- Crisp, M., et al. Coupling of the nucleus and cytoplasm: role of the LINC complex. The Journal of cell biology. 172, 41-53 (2006).
- Haque, F., et al. SUN1 interacts with nuclear lamin A and cytoplasmic nesprins to provide a physical connection between the nuclear lamina and the cytoskeleton. Molecular and cellular biology. 26, 3738-3751 (2006).
- Hodzic, D. M., Yeater, D. B., Bengtsson, L., Otto, H., Stahl, P. D. Sun2 is a novel mammalian inner nuclear membrane protein. The Journal of biological chemistry. 279, 25805-25812 (2004).
- Starr, D. A.
- Mellad, J. A., Warren, D. T., Shanahan, C. M. Nesprins LINC the nucleus and cytoskeleton. Current opinion in cell biology. 23, 47-54 (2011).
- Fridolfsson, H. N., Starr, D. A. Kinesin-1 and dynein at the nuclear envelope mediate the bidirectional migrations of nuclei. The Journal of cell biology. 191, 115-128 (2010).
- Meyerzon, M., Fridolfsson, H. N., Ly, N., McNally, F. J., Starr, D. A. UNC-83 is a nuclear-specific cargo adaptor for kinesin-1-mediated nuclear migration. Development. 136, 2725-2733 (2009).
- Padmakumar, V. C., et al. Enaptin, a giant actin-binding protein, is an element of the nuclear membrane and the actin cytoskeleton. Experimental cell research. 295, 330-339 (2004).
- Roux, K. J., et al. Nesprin 4 is an outer nuclear membrane protein that can induce kinesin-mediated cell polarization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 2194-2199 (2009).
- Wilhelmsen, K., et al. a novel outer nuclear membrane protein, associates with the cytoskeletal linker protein plectin. The Journal of cell biology. 171, 799-810 (2005).
- Wilson, M. H., Holzbaur, E. L. Nesprins anchor kinesin-1 motors to the nucleus to drive nuclear distribution in muscle cells. Development. 142, 218-228 (2015).
- Yu, J., et al. KASH protein Syne-2/Nesprin-2 and SUN proteins SUN1/2 mediate nuclear migration during mammalian retinal development. Human molecular genetics. 20, 1061-1073 (2011).
- Zhang, X., et al. Syne-1 and Syne-2 play crucial roles in myonuclear anchorage and motor neuron innervation. Development. 134, 901-908 (2007).
- Zhang, J., et al. Nesprin 1 is critical for nuclear positioning and anchorage. Human molecular genetics. 19, 329-341 (2010).
- Stewart-Hutchinson, P. J., Hale, C. M., Wirtz, D., Hodzic, D. Structural requirements for the assembly of LINC complexes and their function in cellular mechanical stiffness. Experimental cell research. 314, 1892-1905 (2008).
- Zhang, X., et al. SUN1/2 and Syne/Nesprin-1/2 complexes connect centrosome to the nucleus during neurogenesis and neuronal migration in mice. Neuron. 64, 173-187 (2009).
- Razafsky, D., Hodzic, D. Temporal and tissue-specific disruption of LINC complexes in vivo. Genesis. 52, 359-365 (2014).
- Razafsky, D., Hodzic, D. A variant of Nesprin1 giant devoid of KASH domain underlies the molecular etiology of autosomal recessive cerebellar ataxia type I. Neurobiology of disease. 78, 57-67 (2015).
- Razafsky, D., Blecher, N., Markov, A., Stewart-Hutchinson, P. J., Hodzic, D. LINC complexes mediate the positioning of cone photoreceptor nuclei in mouse retina. PloS one. 7, e47180 (2012).
- Razafsky, D. S., Ward, C. L., Kolb, T., Hodzic, D. Developmental regulation of linkers of the nucleoskeleton to the cytoskeleton during mouse postnatal retinogenesis. Nucleus. 4, 399-409 (2013).
