Introduction
L'enveloppe nucléaire (NE) sépare le nucléoplasme à partir du cytoplasme. Il est composé d'une membrane nucléaire interne et externe (INM et ONM, respectivement) qui se connectent à des pores nucléaires. La lumière délimitée par deux membranes est appelé l'espace périnucléaire (PNS). L'ONM est une extension du réticulum endoplasmique rugueux (ER) et l'INM adhère à la lamina nucléaire, un maillage de l'énergie nucléaire de type V filaments intermédiaires représenté par A et de type B lamines 1,2. Lieurs du cytosquelette et Nucleoskeleton (CLIC) sont des assemblages macromoléculaires complexes qui couvrent l'ensemble de l'enveloppe nucléaire de se connecter physiquement à l'intérieur du noyau de filaments du cytosquelette et des moteurs moléculaires (Figure 1A). Ils se composent d'interactions entre les motifs conservés qui caractérisent l'évolution, deux familles de protéines transmembranaires intégrante du NE: Sun (SAD1 / Unc84) des protéines et des Nesprins (SPectRINS enveloppe nucléaire). Chez les mammifères, Sun1 et Sun2 are protéines transmembranaires de l'INM dont la région nucléoplasmique N-terminal interagit directement avec A et de type B lamines 3-5. De l'autre côté de l'INM, dans le PNS, protéines Sun Harbor un tronçon évolutif conservé de ~ 150 acides aminés C-terminal appelé le domaine soleil. SUN domaines interagissent directement avec l'évolution conservé KASH (Klarsicht / Anc-1, Syne homologie) domaine, la signature moléculaire de Nesprins. KASH domaines sont constitués par un tronçon de ~ 30 acides aminés C-terminal qui fait saillie dans le PNS suivi d'un domaine transmembranaire 6. Au moins quatre gènes distincts (Nesprin1-4 Nesprin) codent KASH contenant des protéines qui localisent au NE 7. Les régions cytoplasmiques de Nesprins, dont les tailles varient de ~ 50 kDa (Nesprin4) à une étonnante 1.000 kDa (Nesprin1 géant), contiennent spectrine multiples répétitions ainsi que des motifs spécifiques permettant leur interaction avec les composants du cytosquelette tels que l'actine, plectine et moteurs moléculaires 8- 13.
<p class = "jove_content"> Études chez les vertébrés et les invertébrés ont montré que Lamin / moteurs moléculaires Sun / Nesprin / constituent un "axe" évolutif conservé le contrôle de la migration nucléaire et d'ancrage. Plusieurs modèles de souris knock-out (KO) de CLIC composants complexes ont été décrites et ont contribué à fournir un cadre pour comprendre le rôle des protéines Sun et Nesprin au cours du développement des mammifères NE 9,14,15. Cependant, ces modèles présentent plusieurs inconvénients importants, et plus particulièrement: 1) difficulté à interpréter phénotypes dues à la cellule des effets non-autonomes, 2) la difficulté de distinguer les contributions phénotypiques de KASH contenant vs KASH-moins Nesprin isoformes 16, 3) la redondance fonctionnelle des protéines Sun et Nesprin à la NE dans de nombreux types de cellules nécessite des programmes de sélection complexes pour inactiver toutes les interactions SUN-Kash chez la souris 17 et 4) la létalité périnatale de souris déficientes pour le KASH-domaine à la foisNesprins1 et 2 se oppose à l'analyse des phénotypes adultes 18.Ce protocole décrit un nouveau modèle de souris conçu pour perturber toutes les interactions SUN-Kash in vivo, dans une cellule de façon autonome et régulée par le développement, contournant ainsi la plupart des inconvénients décrits ci-dessus. Ce modèle de souris Cre / sur la base de LOX-repose sur deux concepts importants: 1) le domaine KASH de toute protéine Nesprin connu est suffisante pour cibler EGFP vers NE dans les systèmes de culture de cellules et 2) les domaines de SUN interagir pêle-mêle avec des domaines KASH, ainsi surexpression de tout domaine KASH va saturer tous les domaines de SUN endogènes et inactiver complexes CLIC de manière dominante négative 17 (figure 1B). Ce protocole décrit la récolte des tissus et des étapes de traitement utilisées pour confirmer l'interruption de toutes les interactions SUN-Kash dans les cellules de Purkinje du cervelet.
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Protocol
Déclaration éthique: procédures impliquant des sujets animaux ont été approuvés par le Comité institutionnel de protection des animaux et l'utilisation (IACUC) à l'Université de Washington à St. Louis.
1. élevage de souris et de génotypage
- Race Tg (CAG-LacZ / EGFP-KASH2) souris avec Tg (PCP2-Cre) pour produire des souris Tg (PCP2Cre CAG-EGFP / KASH2) 19,20. Note: Alors que le reste de ce protocole met l'accent sur l'utilisation de la ligne Tg (PCP2-Cre) de la souris pour restreindre EGFP-KASH2 expression aux cellules de Purkinje dans le cervelet, une procédure similaire peut être suivi avec un autre Tg (Cre) de la souris ( Figure 2A).
- Effectuer génotypage pour identifier les chiots abritant deux transgènes EGFP et la CRE comme décrit précédemment 19.
2. Préparation des matériaux pour la dissection et de tissus Collection
- Préparez 100 ml de saccharose à 30% dans du PBS (30 g de saccharose / 100 ml de PBS 1x) et conserver à -20 ° C. Le jour de tissu harvesting, dégel et la charge ~ 30-35 ml de solution de saccharose dans une seringue de 35 ml pour les perfusions transcardial.
- Préparer 40 ml de PFA à 4% dans du PBS (10 ml de 16% de paraformaldehyde et 30 ml de PBS). Charge ~ 30-35 ml de PFA à 4% dans une seringue de 35 ml pour les perfusions transcardial.
- Remplir un tissu plaque de culture de 10 cm avec 10 ml de PBS pour la dissection de tissus.
- Préparer un cocktail kétamine / xylazine constitué de 16 mg / ml de kétamine et de 3 mg / ml de xylazine.
- Préparer une solution d'éthanol à 70% pour la dissection.
3. Dissection et collecte de tissus
- En utilisant une seringue de 1 ml, 500 pi d'injecter le cocktail de kétamine / xylazine par 25 g de poids corporel et attendre ~ 15 min. Vous pouvez également utiliser une autre méthode de sédation institutionnel approuvé qui est approprié pour le système biologique d'intérêt.
- Sur la sédation, pincez doucement la patte arrière pour confirmer l'absence de réponse de la douleur, épingler tous les pattes sur un plateau de styromousse avec la face dorsale de lasouris vers le bas.
- Pulvériser l'abdomen avec 70% d'éthanol et de faire une incision de l'abdomen inférieur vers le haut de la cage thoracique pour avoir accès au cœur.
- Faire une petite incision dans l'oreillette droite du cœur et insérer la seringue contenant la solution de saccharose à 30% dans le ventricule gauche du cœur.
- Perfuser la solution à un débit de ~ 2-5 ml par min. Une fois vide, retirer la seringue et répéter avec la solution PFA 4%.
- Détacher la souris à partir du plateau de styromousse et décapiter pour accéder au cerveau.
- Retirer la peau autour de la tête de l'animal à l'aide de pinces et ciseaux. Percer un trou dans la partie postérieure du crâne avec une aiguille et retirer délicatement le crâne avec des ciseaux et des pinces à dissection.
- Une fois que le cerveau est clairement accessible, utiliser une pince pour enlever le cervelet et le placer dans PBS. Couper en deux le cervelet dans le plan sagittal avec un scalpel et le transférer à la solution de saccharose à 30% pendant une nuit à 4 ° C. Remarque: Pour prépsont des coupes en paraffine, fixent le cervelet pendant une nuit à 4 ° C dans 4% de PFA avant l'incorporation de tissu et la coupe.
4. Traitement des tissus et la coupe
- Préparer une suspension de glace sèche et le butane 2-méthyl. Laisser la température du bain à équilibrer pendant 5 min.
- Remplissez un cryomoule avec le composé PTOM et placer une moitié du cervelet bissectée dans le moule.
- En utilisant un microscope de dissection et d'une paire de pince de la position du cervelet de sorte que la surface coupée en deux (près de la ligne médiane du cervelet) est orientée vers le haut.
- Transférer le cryomoule à la suspension de la glace sèche pendant 5 min jusqu'à ce que l'Ordre a formé composé d'une matrice solide blanc autour de l'échantillon de tissu. Remarque: Les spécimen congelé peuvent désormais être conservés à -20 ° C si nécessaire.
- Étiquette pré-traitée diapositives de poly-lysine pour la collecte des coupes de tissus et de préparer le cryostat selon les instructions du fabricant afin de recueillir 15 um sections de la Cèrebellum. Pour collecter les sections, contactez attentivement la section PTOM à la face revêtue de la lame de poly-lysine. Afin de préserver l'orientation de la section, ne pas tourner la diapositive lors de cette étape.
- Coupes de tissus de magasin -20 ° C à jusqu'à procéder à la coloration et l'imagerie.
5. Coloration et imagerie du cervelet Sections
- Préparer les solutions suivantes avant la coloration de tissus:
~ 50 ml de PBS
~ 5-10 ml de PFA à 4% dans du PBS
~ 10-20 ml de 0,5% de Triton X-100 de sérum d'âne, à 10% dans du PBS - Sections cérébelleux dégel. Surtout, minimiser leur exposition à une source de lumière continue et intense pour éviter la décoloration de l'EGFP.
- En utilisant un stylo de barrière hydrophobe, dessinez un rectangle autour des sections de tissus.
- Post-fixer les sections avec PFA 4% pendant 5 min. Utilisez assez de liquide pour couvrir l'ensemble de la zone délimitée par la barrière hydrophobe (généralement ~ 500 pi). Aide d'un aspirateur ou d'une pipette, REdéplacer le fixateur en faisant particulièrement attention à ne pas déranger les coupes de tissus.
- Avec une pipette, appliquer doucement PBS sur la diapositive sans déranger les coupes de tissus. Après 5 min utiliser l'aspirateur ou une pipette pour enlever avec précaution le liquide. Répétez la PBS rincer un total de trois fois.
- En utilisant une pipette, appliquez soigneusement la dilution appropriée d'anticorps primaires (3 pi Calbindin et / ou d'anticorps Nesprin2 par 900 pi de solution) dans 0,5% de Triton X-100, le sérum de l'âne de 10% dans le PBS. Incuber pendant une heure à la température ambiante dans l'obscurité.
Remarque: EGFP-KASH2 restera visible par microscopie à fluorescence directe sur des coupes congelées, sans qu'il soit nécessaire d'utiliser un anticorps anti-EGFP. Toutefois, si des sections de paraffine ont été préparés, l'imagerie de l'EGFP-KASH2 nécessite immunodétection avec un anticorps anti-EGFP. - Retirer la solution d'anticorps et rincer avec du PBS à trois reprises.
- Préparation 1: 1000 d'anticorps secondaire dilutions Alexa Fluor-0,5 en% de Triton X-100,10% de sérum de âne dans PBS et de stocker dans l'obscurité.
- Retirez délicatement le rinçage final PBS et appliquer la dilution d'anticorps secondaire pendant une heure dans l'obscurité.
- Retirer la solution d'anticorps secondaire, rincer et laver la section trois fois. Si nécessaire, appliquer un colorant nucléaire, tels que le DAPI (~ 300 nM), au cours de la première application du PBS.
- Supprimer complètement la solution de PBS à partir autour du tissu et le lieu ~ 5-7 pi de milieu de montage sur la section de tissu. Placez une lamelle de verre sur le dessus de la section de tissu et mettre de côté pour ~ 15-30 min à température ambiante dans l'obscurité.
- Utilisation d'un microscope à fluorescence équipé des filtres appropriés pour visualiser EGFP ainsi que d'autres longueurs d'onde appropriées pour les anticorps secondaires utilisés dans les étapes 5.8 / 5.9. Dans tranches de cervelet, utilisez un objectif 20X pour voir jantes nucléaires EGFP-KASH2.
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Representative Results
Ce protocole illustre l'utilité de la (/ EGFP-KASH2 CAG-LacZ) Tg modèle de souris pour restreindre EGFP-KASH2 expression à l'aide de cellules cérébelleuses de Purkinje souris Tg (PCP2-Cre). Dans Tg (PCP2Cre CAG-EGFP / KASH2) progéniture, le cadre de lecture ouvert LacZ / V5 est excisée à P6 par la Cre recombinase ce qui conduit à l'expression de EGFP-KASH2 spécifiquement ciblées sur les cellules de Purkinje (figure 2A). Comme prévu, EGFP-KASH2 est destiné à l'enveloppe nucléaire, comme indiqué par le diagramme de rebord analogue à EGFP-positive observée autour du noyau (figure 2B). Afin de maximiser tout phénotype physiologique, il est important de veiller à ce que EGFP-KASH2 est exprimé dans la majorité des cellules ciblées par le calcul du pourcentage de cellules positives à l'EGFP-KASH2 qui sont co-coloré avec un marqueur de l'anticorps spécifique de la cellule. Dans cet exemple, l'expression EGFP-KASH2 a été détecté dans plus de 70% des cellules de Purkinje Calbindin-positives (Figure 2B). Dans ces conditions, nous ne respectaient pas toutes les phénotypes histologiques ou comportementales importantes sur 10 mois, Tg (PCP2Cre CAG-EGFP / KASH2) 20 souris. Il est important de veiller à ce que n'importe quel phénotype morphologique ou comportemental est pas due à l'expression ectopique de EGFP-KASH2 dans un type de cellule / tissu non volontaire. Pour cet égard, KASH2-EGFP n'a pas été observée dans la couche de cellules granulaires ou de la couche moléculaire de Tg (PCP2Cre CAG-EGFP-KASH2) cervelet (figure 2B).
Enfin, il est essentiel de confirmer l'étendue de la perturbation CLIC complexe dans les cellules exprimant l'EGFP-KASH2. Ceci peut être réalisé en utilisant des anticorps anti-Nesprin de haute qualité à souligner leur déplacement en provenance du NE de cellules exprimant l'EGFP-KASH2. Comme le montre la figure 3, endogène Nesprin2 est déplacé de l'enveloppe nucléaire de cellules de Purkinje qui expriment EGFP-KASH2 (Figure 3 panneau supérieur, flèches jaunes) alors que les cellules de Purkinje qui ne reflètent pas EGFP-KASH2 Retadans endogène Nesprin2 à l'enveloppe nucléaire (Figure 3 panneau supérieur, flèche blanche). Comme prévu, la même portée de contrôle, qui ne sont pas expriment la recombinase Cre, Nesprin2 afficher à l'enveloppe nucléaire de l'ensemble de la population des cellules de Purkinje (figure 3 flèches blanches bas). Plusieurs rapports ont maintenant confirmé l'expression de EGFP-KASH2, accompagné par le déplacement de Nesprins endogènes dans des tissus supplémentaires et des types de cellules telles que des fibres de muscle squelettique et des photorécepteurs de cône 19,21.
Figure 1. Les complexes de CLIC relient le noyau vers le cytosquelette et sont perturbées par la surexpression de la EGFP-KASH2. (A) Représentation de complexes CLIC qui relient l'intérieur du noyau vers le cytosquelette cytoplasmique. Notez que SUN domaines interagissent pêle-mêle avec des domaines KASHde tous Nesprins (Nesprins 1-4). (B) La surexpression de EGFP-KASH2 déplace Nesprins endogènes de l'enveloppe nucléaire à l'urgence, dans un mode dominant négatif, en déconnectant ainsi le noyau du cytosquelette cytoplasmique environnante.
Figure 2. La surexpression de EGFP-KASH2 spécifiquement ciblé aux cellules de Purkinje du cervelet. (A) Elevage de Tg (CAG-LacZ / EGFP-KASH2) à Tg (PCP2-Cre) les résultats de la souris dans Tg (PCP2Cre CAG-EGFP-KASH2) progéniture dans lequel la recombinase Cre est exprimée spécifiquement dans les cellules de Purkinje du cervelet. Lors de l'expression (P6), la recombinase Cre une translocation dans le noyau où il excise le LacZ ORF et induit l'expression EGFP-KASH2. (B) Tg (PCP2Cre CAG-EGFP-KASH2) souris expriment spécifiquement EGFP-KASH2 dans les cellules de Purkinje du cervelet identifié avec Calbindin (coloré en rouge). Notez que les deux neurones granulaires du cervelet et des interneurones de la couche moléculaire sont négatives pour l'expression EGFP-KASH2. Abréviations: MoL: couche moléculaire, PCL: couche de cellules de Purkinje et GCL: couche de cellules de granules.
Figure 3. Perturbation de complexes CLIC endogènes dans les cellules de Purkinje du cervelet. Simple confocale plan montrant l'expression de l'EGFP-KASH2 qui déplace endogène Nesprin2 (coloré en rouge) à partir de l'enveloppe nucléaire de cellules de Purkinje (flèches jaunes en haut). Notez que les cellules de Purkinje manquant expression EGFP-KASH2 maintenir endogène Nesprin2 à leur enveloppe nucléaire (blanc flèche en haut). Dans Tg (CAG-LacZ / EGFP-KASH2) de la même portée de contrôle, aucun signal de l'EGFP est observée et Nesprin2 est détectée à l'enveloppe nucléaire de toutes Purki
Ce protocole illustre l'utilité dela Tg (CAG-LacZ / EGFP-KASH2) modèle de souris pour restreindre EGFP-KASH2 expression aux cellules de Purkinje du cervelet utilisant des souris TG (PCP2-CRE). Dans Tg (PCP2Cre CAG-EGFP / KASH2) progéniture, le cadre de lecture ouvert LacZ / V5 est excisée à P6 par la Cre recombinase ce qui conduit à l'expression de EGFP-KASH2 spécifiquement ciblées sur les cellules de Purkinje (figure 2A). Comme prévu, EGFP-KASH2 est destiné à l'enveloppe nucléaire, comme indiqué par le diagramme de rebord analogue à EGFP-positive observée autour du noyau (figure 2B). Afin de maximiser tout phénotype physiologique, il est important de veiller à ce que EGFP-KASH2 est exprimé dans la majorité des cellules ciblées par le calcul du pourcentage de cellules positives à l'EGFP-KASH2 qui sont co-coloré avec un marqueur de l'anticorps spécifique de la cellule. Dans cet exemple, l'expression EGFP-KASH2 a été détecté dans plus de 70% des cellules de Purkinje Calbindin-positives (Figure 2B). Dans ces conditions, on n'a pas observé de histologique ou behaviora significativel phénotypes sur 10 mois, Tg (PCP2Cre CAG-EGFP / KASH2) 20 souris. Il est important de veiller à ce que n'importe quel phénotype morphologique ou comportemental est pas due à l'expression ectopique de EGFP-KASH2 dans un type de cellule / tissu non volontaire. Pour cet égard, KASH2-EGFP n'a pas été observée dans la couche de cellules granulaires ou de la couche moléculaire de Tg (PCP2Cre CAG-EGFP-KASH2) cervelet (figure 2B).
Enfin, il est essentiel de confirmer l'étendue de la perturbation CLIC complexe dans les cellules exprimant l'EGFP-KASH2. Ceci peut être réalisé en utilisant des anticorps anti-Nesprin de haute qualité à souligner leur déplacement en provenance du NE de cellules exprimant l'EGFP-KASH2. Comme le montre la Figure 3, endogène Nesprin2 est déplacé à partir de l'enveloppe nucléaire de cellules de Purkinje qui expriment EGFP-KASH2 (figure 3 le panneau supérieur, les flèches jaune), tandis que les cellules de Purkinje qui ne expriment pas EGFP-KASH2 conserver endogène Nesprin2 à l'enveloppe nucléaire (Figure 3 (figure 3 flèches blanches bas). Plusieurs rapports ont maintenant confirmé l'expression de EGFP-KASH2, accompagné par le déplacement de Nesprins endogènes dans des tissus supplémentaires et des types de cellules telles que des fibres de muscle squelettique et des photorécepteurs de cône 19,21.
Figure 1. Les complexes de CLIC relient le noyau vers le cytosquelette et sont perturbées par la surexpression de la EGFP-KASH2. (A) Représentation de complexes CLIC qui relient l'intérieur du noyau vers le cytosquelette cytoplasmique. Notez que les domaines de SUN interagissent pêle-mêle avec KASH domaines de tous Nesprins (Nesprins 1-4). (B) La surexpression of EGFP-KASH2 déplace Nesprins endogènes de l'enveloppe nucléaire à l'urgence, dans un mode dominant négatif, en déconnectant ainsi le noyau du cytosquelette cytoplasmique environnante. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2. La surexpression de EGFP-KASH2 spécifiquement ciblé aux cellules de Purkinje du cervelet. (A) Elevage de Tg (CAG-LacZ / EGFP-KASH2) à Tg (PCP2-Cre) les résultats de la souris dans Tg (PCP2Cre CAG-EGFP-KASH2) progéniture dans lequel la recombinase Cre est exprimée spécifiquement dans les cellules de Purkinje du cervelet. Lors de l'expression (P6), la recombinase Cre une translocation dans le noyau où il excise le LacZ ORF et induit l'expression EGFP-KASH2. (B) Tg (PCP2Cre CAG-EGFP-KASH2) Souris exprimer spécifiquement EGFP-KASH2 dans les cellules de Purkinje du cervelet identifiés avec Calbindin (coloré en rouge). Notez que les deux neurones granulaires du cervelet et des interneurones de la couche moléculaire sont négatives pour l'expression EGFP-KASH2. Abréviations: MoL: couche moléculaire, PCL: couche de cellules de Purkinje et GCL:. Couche de cellules granules S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3. Perturbation de complexes CLIC endogènes dans les cellules de Purkinje du cervelet. Simple confocale plan montrant l'expression de l'EGFP-KASH2 qui déplace endogène Nesprin2 (coloré en rouge) à partir de l'enveloppe nucléaire de cellules de Purkinje (flèches jaunes en haut). Notez que les cellules de Purkinje manquant expression EGFP-KASH2 maintenir endogène Nesprin2 à leur enveloppe nucléaire (Pentecôtee arrow haut). Dans Tg (CAG-LacZ / EGFP-KASH2) littermates de contrôle, aucun signal de l'EGFP est observée et Nesprin2 est détecté à l'enveloppe nucléaire de toutes les cellules de Purkinje (flèches blanches en bas). S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
L'étape la plus critique pour étudier avec succès le rôle de complexes CLIC in vivo utilise le (/ EGFP-KASH2 CAG-LacZ) modèle Tg est d'identifier une ligne appropriée de la souris Cre (s). En effet, si Cre est actif dans d'autres types cellulaires impliqués dans les voies similaires, il peut compliquer l'interprétation des résultats. Par conséquent, il est important d'examiner les cellules voisines, comme illustré ici dans les couches cellulaires et moléculaires granulaires du cervelet (figure 2B). De même, pour maximiser les phénotypes physiologiquement pertinents, il est important d'identifier une souche Cre Cre avec l'expression répandue à travers le type cellulaire d'intérêt. Il est également essentiel de procéder à une caractérisation en profondeur du profil d'expression de CLIC composants complexes au cours du développement du système d'intérêt. En effet, un inconvénient de la (/ EGFP-KASH2 CAG-LacZ) modèle de souris Tg est qu'elle ne fournit aucune information quant aux protéines soleil ou variantes Nesprins sont impliqués dans le système biologique under considération. Toutefois, ce problème peut être surmonté en entreprenant une caractérisation rigoureuse tant au niveau de la transcription et de protéines. En fait, ces études ont été menées à plusieurs reprises qui ont conduit à des résultats importants sur le rôle de composants complexes spécifiques CLIC au cours du développement du système nerveux central et de l'homéostasie 21,22.
Enfin, alors que ce protocole est axé sur l'utilisation de tissus du système nerveux central fixes, Tg (CAG-LacZ / EGFP-KASH2) des souris peut être utilisée pour isoler et la culture de cellules primaires pour étudier l'effet de perturber complexes CLIC in vitro. En utilisant ce schéma, il est possible d'isoler et de purifier des cultures primaires de cellules EGFP-KASH2-positifs pour des applications telles que la vidéo time-lapse microscopie. Cela évite de faibles efficacités de transfection ou de la production lentiviral requise pour les systèmes de culture primaire, telles que les neurones.
En résumé, les (/ EGFP-KASH2 CAG-LacZ) souris Tg ouvrent des possibilités nouvelles et passionnantes à étudier le plaisirction de complexes CLIC in vivo au cours des processus de développement de mammifères embryonnaires et post-natales dans une grande variété de tissus et types de cellules pour traiter des questions fondamentales de la biologie cellulaire.
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Disclosures
Les auteurs ont rien à révéler.
Acknowledgments
Les auteurs remercient le personnel du noyau Morphologie et d'imagerie, du noyau génétique moléculaire (Département d'ophtalmologie et des sciences visuelles) et de la Génétique de la souris de base à la Washington University School of Medicine à St. Louis. Les auteurs sont soutenus par le programme de petites subventions du centre McDonnell cellulaire et neurobiologie moléculaire, le Centre Espoir pour les troubles neurologiques, le National Eye Institute (# R01EY022632 DH), un National Eye Institute Core Center Grant (# P30EY002687) et une subvention sans restriction de la recherche pour prévenir la cécité au Département d'ophtalmologie et des sciences visuelles.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S0389 | |
| 10x PBS | Gibco | 14200-075 | |
| 16% Paraformaldehyde Solution | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| OCT Compound | Tissue-Tek | 4583 | |
| Adhesion Slides | StatLab | M1000W | |
| Donkey Serum | Sigma Aldrich | D9663 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T9284 | |
| ImmuEdge Pen | Vector Laboratories | H-4000 | |
| Anti-Calbindin Antibody | Sigma Aldrich | C9848 | |
| Anti-EGFP Antibody | Abcam | ab13970 | |
| Anti-Nesprin2 Antibody | Previously described in Ref. 21 | ||
| Fluorescent Mounting Media | Dako | S3023 | |
| 2-methyl butane | Sigma Aldrich | O3551 |
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