Introduction
מעטפת הגרעין (NE) מפרידה nucleoplasm מציטופלסמה. הוא מורכב מקרום פנימי וחיצוני גרעיני (INM וONM, בהתאמה) המתחברים בנקבוביות גרעיניות. לומן שמסומן על ידי שני הקרומים נקרא חלל perinuclear (PNS). ONM היא הרחבה של הרשתית מחוספס endoplasmic (ER), וINM שומר על lamina הגרעיני, meshwork של חוטי ביניים מסוג V הגרעיני מיוצג על ידי א 'וב' מסוג lamins 1,2. Linkers של Nucleoskeleton ומתחמי נוגדנים (LINC) הם מכלולי macromolecular כי היקף כל מעטפת הגרעין להתחבר פיזי הפנימית של הגרעין לחוטי cytoskeletal ומנועים מולקולריים (איור 1 א). הם מורכבים מאינטראקציות בין מוטיבים שמורים באבולוציה המאפיינים את שתי משפחות של חלבונים הטרנסממברני נפרד מNE: חלבוני שמש (Sad1 / Unc84) וNesprins (גרעיני המעטפה SPectRINS). ביונקים, ar Sun1 וSun2חלבונים הטרנסממברני דואר של INM שN-מסוף nucleoplasmic אזור אינטראקציה ישירות עם A- וlamins B-סוג 3-5. בצד השני של INM, בתוך PNS, חלבוני שמש נמל מתיחה שימור האבולוציוני של ~ חומצות אמינו 150 C-מסוף נקראות תחום SUN. תחומים SUN אינטראקציה ישיר עם קאש-שימור אבולוציוני (Klarsicht / Anc-1, עברו" הומולוגיה) תחום, החתימה המולקולרית של Nesprins. תחומים קאש מורכבים ממתיחה של ~ 30 חומצות אמינו C-מסוף שבולטת לתוך PNS ואחריו תחום הטרנסממברני 6. לפחות ארבעה גנים שונים Nesprin (Nesprin1-4) לקודד קאש המכיל חלבונים שלמקם בNE 7. אזורי cytoplasmic של Nesprins, הגדלים משתנים מ~ 50kDa (Nesprin4) למדהים 1,000 kDa (ענק Nesprin1), מכילים spectrin מרובה חוזר כמו גם מוטיבים מסוימים המאפשר האינטראקציה שלהם עם רכיבי cytoskeletal כגון אקטין, plectin ומנועים מולקולריים 8 13.
<class = "jove_content" p> מחקרים בבעלי חוליות וחסרי חוליות הראו כי Lamin / מנועים מולקולריים שמש / Nesprin / מהווים "ציר" אבולוציונית שימור שליטה הגירה ומעגן גרעיניים. מודלים עכבר נוק-אאוט כמה (KO) של רכיבים מורכבים LINC תוארו וסייעו במתן מסגרת להבנת התפקידים של חלבוני שמש וNesprin בNE במהלך התפתחות יונקים 9,14,15. עם זאת, מודלים אלה כמה חסרונות הנוכחיים משמעותיים, בעיקר: 1) קושי בפרשנות פנוטיפים בשל תא השפעות חד-אוטונומיות, 2) קושי בהבחנה תרומות phenotypical של קאש המכילים לעומת קאש-פחות Nesprin isoforms 16, 3) יתירות פונקציונלית של חלבוני שמש וNesprin בNE בסוגים רבים של תאים דורשת תוכניות רבייה מורכבות כדי להשבית את כל אינטראקציות SUN-קאש בעכברים 17 ו -4) קטלני סביב הלידה של עכברים החסרות לקאש-תחום של שניNesprins1 ו -2 מונעים את הניתוח של מבוגרים פנוטיפים 18.פרוטוקול זה מתאר מודל רומן עכבר נועד לשבש את כל אינטראקציות SUN-קאש in vivo, בתא אופן אוטונומי ומוסדר מבחינה התפתחותית, ובכך עוקף רב של החסרונות שתוארו לעיל. Cre / מודל עכבר מבוסס לקס זה מסתמך על שני מושגים חשובים: 1) תחום קאש של כל חלבון Nesprin ידוע מספיק כדי למקד EGFP לNE במערכות תרבית תאים ו -2) תחומים SUN אינטראקציה עם אבחנת תחומים קאש, כך ביטוי יתר של כל תחום קאש יהיה להרוות כל תחומי SUN אנדוגני ולהשבית מתחמי LINC באופן דומיננטי שלילי 17 (איור 1). פרוטוקול זה מתאר קצירת רקמה ומדרגות עיבוד משמשות כדי לאשר את השיבוש של כל אינטראקציות SUN-קאש בתאי פורקינג 'במוח הקטן.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הצהרת אתיקה: נהלים כרוכים בנושאי בעלי חיים אושרו על ידי הוועדה המוסדית הטיפול בבעלי חיים והשימוש (IACUC) באוניברסיטת וושינגטון בסנט לואיס.
1. גידול העכבר וGenotyping
- להתרבות עכברי Tg (CAG-LacZ / EGFP-KASH2) עכברים עם Tg (PCP2-Cre) לייצר Tg (PCP2Cre CAG-EGFP / KASH2) 19,20. הערה: בעוד שאר פרוטוקול זה מתמקד בשימוש בקו Tg העכבר (PCP2-Cre) כדי להגביל ביטוי EGFP-KASH2 לתאי פורקינג בתוך המוח הקטן, הליך דומה יכול להיות אחריו עם כל עכבר אחר Tg (Cre) ( איור 2 א).
- בצע genotyping לזהות גורי מחסה שני transgenes EGFP וCre כפי שתואר קודם לכן 19.
2. הכנת חומרים לאוסף Dissection ורקמות
- הכן של סוכרוז 30% PBS (30 סוכרוז גרם / 100 של 1x PBS מיליליטר) ולאחסן 100 מיליליטר ב -20 ° C. היום של ח הרקמהarvesting, הפשרה ועומס ~ 30-35 מיליליטר של תמיסת סוכרוז לתוך מזרק 35 מיליליטר לזילופי transcardial.
- הכן 40 מיליליטר של PFA 4% בPBS (10 מיליליטר 16% paraformaldehyde ו -30 מיליליטר PBS). טען ~ 30-35 PFA מיליליטר של 4% למזרק 35 מיליליטר לזילופי transcardial.
- מלא את צלחת תרבית רקמת 10 סנטימטרים עם 10 מיליליטר של PBS לנתיחה רקמה.
- הכן קוקטייל קטמין / xylazine בהיקף של 16 מ"ג / מיליליטר קטמין ו -3 מ"ג / מיליליטר xylazine.
- הכן פתרון של 70% אתנול לנתיחה.
3. Dissection ואוסף רקמות
- באמצעות מזרק 1 מיליליטר, להזריק 500 μl של קוקטייל קטמין / xylazine לכל 25 גרם של משקל גוף ולחכות ~ 15 דקות. לחלופין, להשתמש בשיטת הרגעה אישרה מוסדי אחרת שמתאימה למערכת הביולוגית של עניין.
- על ההרגעה, בעדינות לצבוט כפה האחורית כדי לאשר את חוסר תגובה לכאב, להצמיד את כל כפות על מגש קלקר עם צד הגב שלהעכבר כלפי מטה.
- לרסס את הבטן עם 70% אתנול ולעשות חתך מהבטן התחתונה לחלק העליון של כלוב הצלעות כדי לקבל גישה ללב.
- לעשות חתך קטן בעלייה הימנית של הלב ולהכניס את המזרק המכיל תמיסת סוכרוז 30% לתוך החדר השמאלי של הלב.
- Perfuse הפתרון בשיעור של ~ 2-5 מיליליטר לדקה. כאשר ריק, להסיר את המזרק וחזור עם 4% פתרון PFA.
- להוציא סיכה העכבר ממגש הקלקר ולערוף כדי לגשת למוח.
- הסר את העור סביב ראשו של בעל החיים באמצעות מלקחיים ומספריים. נקבו חור בחלק האחורי של הגולגולת עם מחט ולהסיר בזהירות את הגולגולת עם מספריים ומלקחיים לנתח.
- ברגע שהמוח הוא בבירור נגיש, להשתמש במלקחיים כדי להסיר את המוח הקטן ולמקם אותו ב- PBS. לחצות את המוח הקטן במטוס sagittal עם אזמל ולהעביר לפתרון סוכרוז 30% לילה בשעה 4 מעלות צלזיוס. הערה: כדי prepהקטעים פרפין, לתקן את המוח הקטן לילה ב 4 מעלות צלזיוס PFA 4% לפני הטבעה וחתך רקמות.
4. עיבוד רקמות וחתך
- הכן תרחיף של קרח יבש ווטאן 2-מתיל. לאפשר את הטמפרטורה של האמבטיה לאזן במשך 5 דקות.
- מלא cryomold עם מתחם OCT ולמקם את מחצית המוח הקטן החצוי לתבנית.
- באמצעות מיקרוסקופ לנתח וזוג מלקחיים עמדת המוח הקטן, כך שהמשטח החצוי (ליד קו האמצע של המוח הקטן) פונה כלפי מעלה.
- העבר את cryomold לslurry הקרח היבש במשך 5 דקות עד למתחם אוקטובר יצר לבנה מטריצה מוצקה סביב דגימת הרקמה. הערה: כעת ניתן לאחסן הדגימה הקפואה ב -20 ° C אם נדרש.
- התווית מראש שטופלה שקופיות פולי-ליזין לאיסוף קטעי רקמה ולהכין את cryostat פי הוראות היצרן כדי לאסוף 15 מיקרומטר חלקים של והנוזלbellum. כדי לאסוף את החלקים, פנה בזהירות את סעיף אוקטובר עם הצד המצופה פולי-ליזין של השקופית. כדי לשמר את הכיוון של הסעיף, לא לסובב את השקופיות במהלך שלב זה.
- סעיפי רקמות חנות ב -20 ° C עד שתמשיך עם כתמים והדמיה.
5. מכתים והדמיה של המוח קטן סעיפים
- הכן את הפתרונות לפני מכתים הרקמות הבאים:
~ 50 מיליליטר של PBS
~ 5-10 מיליליטר של PFA 4% ב- PBS
~ 10-20 מיליליטר של 0.5%, 10% חמורים בדם Triton X-100 ב PBS - חלקי המוח הקטן הפשרה. חשוב לציין, לצמצם את החשיפה שלהם לכל מקור של אור רציף והאינטנסיבי כדי למנוע דהייה של EGFP.
- באמצעות עט מחסום הידרופובי, לצייר מלבן סביב סעיפי רקמות.
- פוסט לתקן את החלקים עם PFA 4% במשך 5 דקות. השתמש מספיק נוזלי כדי לכסות את כל השטח שמסומן על ידי המחסום הידרופובי (בדרך כלל ~ 500 μl). באמצעות ואקום או פיפטה, מחדשלהזיז את מקבע להיות זהיר במיוחד שלא להפריע את סעיפי רקמות.
- עם טפטפת, בעדינות להחיל PBS בשקופית מבלי להפריע סעיפי רקמות. לאחר 5 דקות להשתמש בוואקום או פיפטה כדי להסיר את הנוזל בזהירות. חזור על PBS לשטוף כולל של שלוש פעמים.
- בעזרת פיפטה, להחיל בזהירות את הדילול המתאים של נוגדנים עיקריים (3 μl Calbindin ו / או נוגדן Nesprin2 לμl 900 של פתרון) ב 0.5% X-100, 10% חמורים בדם טריטון בPBS. דגירה של שעה אחת בטמפרטורת חדר בחושך.
הערה: EGFP-KASH2 יהיה גלוי על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי הישיר על חלקים קפואים, ואין צורך להשתמש בנוגדן אנטי-EGFP. עם זאת, אם חלקי פרפין ערוכים, הדמיה של EGFP-KASH2 דורשת immunodetection עם נוגדן אנטי-EGFP. - הסר את פתרון הנוגדן ולשטוף עם PBS שלוש פעמים.
- הכן 1: 1,000 דילולים של נוגדנים משני Alexa-פלואוריד ב 0.5% Triton X-100,10% חמורים בדם בPBS וחנות בחושך.
- להסיר בעדינות ולשטוף PBS הסופי ולהחיל את דילול נוגדנים משני במשך שעה אחת בחושך.
- הסר את פתרון נוגדנים משני, לשטוף ולשטוף את הסעיף שלוש פעמים. במידת הצורך, יחול כתם גרעיני, כגון DAPI (~ 300nM), במהלך יישום PBS הראשון.
- להסיר לחלוטין את פתרון PBS מרחבי הרקמה והמקום ~ 5-7 μl של ההרכבה תקשורת בקטע הרקמה. מניחים coverslip זכוכית על גבי קטע הרקמה ומניח בצד ל~ 15-30 דקות בטמפרטורת חדר בחושך.
- השתמש במיקרוסקופ פלואורסצנטי מצויד במסננים המתאימים לדמיין EGFP וכל אורכי גל אחרים מתאימים לנוגדנים משני המשמשים בצעדים 5.8 / 5.9. בפרוסות המוח הקטן, להשתמש אובייקטיבי 20X כדי להציג המכון גרעיני EGFP-KASH2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
פרוטוקול זה ממחיש את התועלת של (/ EGFP-KASH2 CAG-LacZ) מודל עכבר Tg להגביל ביטוי EGFP-KASH2 לתאי המוח הקטן פורקינג באמצעות Tg עכברים (PCP2-Cre). בTg (PCP2Cre CAG-EGFP / KASH2) צאצאים, מסגרת הקריאה פתוחה LacZ / V5 הוא נכרת בP6 ידי recombinase Cre ויגרמו לביטוי של EGFP-KASH2 הממוקד במיוחד לתאים (איור 2 א) פורקינג. כצפוי, EGFP-KASH2 מיועד למעטפת הגרעין כפי שצוין על ידי הדפוס כמו השפה-EGFP החיובי שנצפה סביב הגרעין (איור 2). על מנת למקסם את כל פנוטיפ פיסיולוגי, חשוב להבטיח כי EGFP-KASH2 בא לידי ביטוי ברוב התאים ממוקדים על ידי חישוב אחוז התאים חיוביים EGFP-KASH2 שישתפו מוכתם עם סמן נוגדן ספציפי בתא. בדוגמא זו, ביטוי EGFP-KASH2 זוהה בלמעלה מ -70% מתאי Calbindin חיוביים פורקינג (איור 2). בקונדי אלהמשא, אנחנו לא רואים שום פנוטיפים היסטולוגית או התנהגות משמעותיות בTg 10 בן חודש עכברים (PCP2Cre CAG-EGFP / KASH2) 20. חשוב להבטיח שכל פנוטיפ מורפולוגיים או התנהגות לא בשל ביטוי חוץ רחמי של EGFP-KASH2 בסוג התא / רקמה לא מכוונת. לכבד את זה, EGFP-KASH2 לא נצפה בשכבת תאי גרגיר או השכבה המולקולרית של Tg (PCP2Cre CAG-EGFP-KASH2) cerebella (איור 2).
לבסוף, הוא חיוני, כדי לאשר את מידת ההפרעה מורכבת LINC בתאים להביע EGFP-KASH2. זה יכול להיות מושגים באמצעות נוגדנים נגד Nesprin באיכות גבוהה להדגיש עקירתם מNE של תאים להביע EGFP-KASH2. כפי שניתן לראות באיור 3, Nesprin2 אנדוגני הוא שנעקר ממעטפת הגרעין של תאי פורקינג 'המבטאות EGFP-KASH2 (איור 3 פנל עליון, חצים צהובים) ואילו תאי פורקינג' שלא להביע EGFP-KASH2 RetaבNesprin2 אנדוגני במעטפה הגרעין (איור 3 פנל עליון, חץ לבן). כצפוי, המלטת שליטה, שאינו מבטא Cre-recombinase, להציג Nesprin2 במעטפה הגרעין של אוכלוסיית כל תא פורקינג '(איור 3 חצים לבנים למטה). כמה דיווחים החברה אישרו את הביטוי של EGFP-KASH2, מלווה בתזוזה של Nesprins אנדוגני, ברקמות נוספות וסוגי תאים כגון סיבי שריר שלד וקולטניים אור קונוס 19,21.
איור 1. מתחמי LINC להתחבר הגרעין לשלד התא והם שיבשו על ידי ביטוי יתר של EGFP-KASH2. () תיאור של מתחמי LINC המחבר את הפנים של הגרעין לשלד תא cytoplasmic. שים לב שתחומי SUN אינטראקציה עם אבחנת תחומים קאשמכל Nesprins (Nesprins 1-4). (ב) יתר של EGFP-KASH2 מחליף Nesprins אנדוגני ממעטפת הגרעין לחדר המיון, באופן שלילי דומיננטי, ובכך לנתק את הגרעין משלד תא cytoplasmic שמסביב.
גידול ביטוי יתר של איור 2. EGFP-KASH2 ממוקד במיוחד לתאי פורקינג 'במוח הקטן. () של Tg (CAG-LacZ / EGFP-KASH2) לTg (PCP2-Cre) צאצאי תוצאות עכברים בTg (PCP2Cre CAG-EGFP-KASH2) בי recombinase Cre מתבטא במיוחד בתאי פורקינג 'במוח הקטן. על הביטוי (P6), recombinase Cre translocates לגרעין שבו בולה ORF LacZ וגורם ביטוי EGFP-KASH2. (ב) Tg (PCP2Cre CAG-EGFP-KASH2) עכברים במיוחד להביע EGFP-KASH2 בתאי פורקינג 'במוח הקטן identifמטען עם Calbindin (בצבע אדום). שים לב ששני נוירונים במוח הקטן גרגיר וinterneurons של השכבה המולקולרית הם שליליים לביטוי EGFP-KASH2. קיצורים: MOL: שכבה מולקולרית, PCL: שכבת פורקינג 'התא וGCL: שכבת תאי גרגיר.
איור 3. שיבוש של מתחמי LINC אנדוגני בתאי פורקינג 'במוח הקטן. ביטוי מראה יחיד מטוס confocal של EGFP-KASH2 שמחליף Nesprin2 אנדוגני (בצבע אדום) ממעטפת הגרעין של תאי פורקינג' (חיצים צהובים העליונים). שים לב שתאי פורקינג חסרי ביטוי EGFP-KASH2 לשמור Nesprin2 אנדוגני במעטפת הגרעין שלהם (למעלה חץ לבן). בהמלטת שליטת Tg (CAG-LacZ / EGFP-KASH2), אין אות EGFP הוא ציין וNesprin2 מזוהה במעטפה הגרעין של כל Purki
פרוטוקול זה ממחיש את התועלת שלTg (CAG-LacZ / EGFP-KASH2) מודל עכבר כדי להגביל את הביטוי EGFP-KASH2 לתאי המוח הקטן פורקינג באמצעות Tg עכברים (PCP2-Cre). בTg (PCP2Cre CAG-EGFP / KASH2) צאצאים, מסגרת הקריאה פתוחה LacZ / V5 הוא נכרת בP6 ידי recombinase Cre ויגרמו לביטוי של EGFP-KASH2 הממוקד במיוחד לתאים (איור 2 א) פורקינג. כצפוי, EGFP-KASH2 מיועד למעטפת הגרעין כפי שצוין על ידי הדפוס כמו השפה-EGFP החיובי שנצפה סביב הגרעין (איור 2). על מנת למקסם את כל פנוטיפ פיסיולוגי, חשוב להבטיח כי EGFP-KASH2 בא לידי ביטוי ברוב התאים ממוקדים על ידי חישוב אחוז התאים חיוביים EGFP-KASH2 שישתפו מוכתם עם סמן נוגדן ספציפי בתא. בדוגמא זו, ביטוי EGFP-KASH2 זוהה בלמעלה מ -70% מתאי Calbindin חיוביים פורקינג (איור 2). בתנאים אלה, אנחנו לא רואים שום היסטולוגית או behaviora משמעותייםפנוטיפים l בעכברי 10 חודשים ישנים Tg (PCP2Cre CAG-EGFP / KASH2) 20. חשוב להבטיח שכל פנוטיפ מורפולוגיים או התנהגות לא בשל ביטוי חוץ רחמי של EGFP-KASH2 בסוג התא / רקמה לא מכוונת. לכבד את זה, EGFP-KASH2 לא נצפה בשכבת תאי גרגיר או השכבה המולקולרית של Tg (PCP2Cre CAG-EGFP-KASH2) cerebella (איור 2).
לבסוף, הוא חיוני, כדי לאשר את מידת ההפרעה מורכבת LINC בתאים להביע EGFP-KASH2. זה יכול להיות מושגים באמצעות נוגדנים נגד Nesprin באיכות גבוהה להדגיש עקירתם מNE של תאים להביע EGFP-KASH2. כפי שניתן לראות באיור 3, Nesprin2 אנדוגני הוא שנעקר ממעטפת הגרעין של תאי פורקינג 'המבטאות EGFP-KASH2 (איור 3 פנל עליון, חצים צהובים) ואילו תאי פורקינג' שלא להביע EGFP-KASH2 לשמור Nesprin2 אנדוגני במעטפה הגרעין (איור 3 '(איור 3 חצים לבנים למטה). כמה דיווחים החברה אישרו את הביטוי של EGFP-KASH2, מלווה בתזוזה של Nesprins אנדוגני, ברקמות נוספות וסוגי תאים כגון סיבי שריר שלד וקולטניים אור קונוס 19,21.
איור 1. מתחמי LINC להתחבר הגרעין לשלד התא והם שיבשו על ידי ביטוי יתר של EGFP-KASH2. () תיאור של מתחמי LINC המחבר את הפנים של הגרעין לשלד תא cytoplasmic. שים לב שתחומי SUN אינטראקציה עם אבחנת תחומים קאש מכל Nesprins (Nesprins 1-4). o (ב) ביטוי יתרF-EGFP KASH2 מחליף Nesprins אנדוגני ממעטפת הגרעין לחדר המיון, באופן שלילי דומיננטי, ובכך לנתק את הגרעין משלד תא cytoplasmic שמסביב. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
גידול ביטוי יתר של איור 2. EGFP-KASH2 ממוקד במיוחד לתאי פורקינג 'במוח הקטן. () של Tg (CAG-LacZ / EGFP-KASH2) לTg (PCP2-Cre) צאצאי תוצאות עכברים בTg (PCP2Cre CAG-EGFP-KASH2) בי recombinase Cre מתבטא במיוחד בתאי פורקינג 'במוח הקטן. על הביטוי (P6), recombinase Cre translocates לגרעין שבו בולה ORF LacZ וגורם ביטוי EGFP-KASH2. (ב) Tg (PCP2Cre CAG-EGFP-KASH2) עכברים במיוחד להביע EGFP-KASH2 בתאי פורקינג 'במוח הקטן מזוהים עם Calbindin (בצבע אדום). שים לב ששני נוירונים במוח הקטן גרגיר וinterneurons של השכבה המולקולרית הם שליליים לביטוי EGFP-KASH2. קיצורים: MOL: שכבה מולקולרית, PCL: שכבת פורקינג 'התא וGCL:. שכבת תאי גרגיר אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3. שיבוש של מתחמי LINC אנדוגני בתאי פורקינג 'במוח הקטן. ביטוי מראה יחיד מטוס confocal של EGFP-KASH2 שמחליף Nesprin2 אנדוגני (בצבע אדום) ממעטפת הגרעין של תאי פורקינג' (חיצים צהובים העליונים). שים לב שתאי פורקינג חסרי ביטוי EGFP-KASH2 לשמור Nesprin2 אנדוגני במעטפת הגרעין שלהם (כהואדואר חץ עליון). בהמלטת שליטת Tg (CAG-LacZ / EGFP-KASH2), אין אות EGFP הוא ציין וNesprin2 מזוהה במעטפה הגרעין של כל תאי פורקינג '(חיצים לבנים למטה). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
השלב הקריטי ביותר ללמוד בהצלחה את התפקיד של מתחמי LINC in vivo באמצעות מודל Tg (CAG-LacZ / EGFP-KASH2) הוא לזהות קו מתאים Cre עכבר (ים). ואכן, אם Cre הוא פעיל בתא-סוגים אחרים מעורבים במסלולים דומים, זה יכול לסבך את הפרשנות של התוצאות. לפיכך, חשוב לבחון תאים סמוכים, כפי שמוצגים כאן בשכבות מולקולריות של התא וגרגיר של המוח הקטן (איור 2). כמו כן, על מנת למקסם את כל פנוטיפים רלוונטיים מבחינה פיזיולוגית חשוב לזהות מתח Cre עם ביטוי Cre נרחב על פני סוג התא של עניין. זה גם חיוני לבצע אפיון מעמיק של דפוס הביטוי של רכיבים מורכבים LINC במהלך הפיתוח של המערכת של עניין. ואכן, חסרון אחד של מודל עכבר Tg (CAG-LacZ / EGFP-KASH2) הוא שהוא אינו מספק כל מידע על שחלבוני שמש או גרסאות Nesprins מעורבות במערכת הביולוגית uשיקול nder. עם זאת, בעיה זו ניתן להתגבר על ידי ביצוע אפיון קפדני בשתי רמות התמליל והחלבון. למעשה, מחקרים כאלה כבר התחייבו בכמה הזדמנויות שהובילו לממצאים חשובים על תפקידו של רכיבים מורכבים LINC הספציפיים במהלך התפתחות מערכת העצבים המרכזית והומאוסטזיס 21,22.
לבסוף, בעוד פרוטוקול זה הוא על השימוש ברקמות מערכת העצבים המרכזית קבועות ממוקד, עכברי Tg (CAG-LacZ / EGFP-KASH2) יכולים לשמש כדי לבודד ותאים ראשוניים תרבות כדי לחקור את ההשפעה של שיבוש מתחמי LINC במבחנה. באמצעות שיטה זו, ניתן לבודד ולטהר תרבויות עיקריות של תאי EGFP-KASH2 החיוביים עבור יישומים כגון מיקרוסקופיה וידאו הזמן לשגות. זה עוקף את יעילות נמוכה transfection או ייצור lentiviral הנדרש למערכות תרבות עיקריות, כגון תאי עצב.
לסיכום, Tg העכברים (CAG-LacZ / EGFP-KASH2) לפתוח אפשרויות חדשות ומרגשות ללמוד הכיףction של מתחמי LINC in vivo בתהליכי התפתחות עובריים יונקים ולאחר לידה במגוון רחב של רקמות וסוגי תאי מטרה לענות על שאלות בסיסיות בביולוגיה של תא.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
יש המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
המחברים מודים לצוות ליבת המורפולוגיה וההדמיה, של ליבת הגנטיקה המולקולרית (מחלקת עיניים ומדעים חזותיים) ושל עכבר הגנטיקה Core באוניברסיטת וושינגטון בסנט לואיס בית הספר לרפואה. המחברים נתמכים על ידי תכנית המענק הקטנה ממרכז מקדונל לתאי ומולקולרית לנוירוביולוגיה, מרכז התקווה להפרעות נוירולוגיות, העין הלאומית (# R01EY022632 לDH), National Eye Institute מרכז Core גרנט (# P30EY002687) ו מענק בלתי מוגבל ממחקר למניעת עיוורון למחלקת עיניים ומדעים חזותיים.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S0389 | |
| 10x PBS | Gibco | 14200-075 | |
| 16% Paraformaldehyde Solution | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| OCT Compound | Tissue-Tek | 4583 | |
| Adhesion Slides | StatLab | M1000W | |
| Donkey Serum | Sigma Aldrich | D9663 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T9284 | |
| ImmuEdge Pen | Vector Laboratories | H-4000 | |
| Anti-Calbindin Antibody | Sigma Aldrich | C9848 | |
| Anti-EGFP Antibody | Abcam | ab13970 | |
| Anti-Nesprin2 Antibody | Previously described in Ref. 21 | ||
| Fluorescent Mounting Media | Dako | S3023 | |
| 2-methyl butane | Sigma Aldrich | O3551 |
References
- Hutchison, C. J. Lamins: building blocks or regulators of gene expression? Nature reviews. Molecular cell biology. 3, 848-858 (2002).
- Stuurman, N., Heins, S., Aebi, U. Nuclear lamins: their structure, assembly, and interactions. Journal of structural biology. 122, 42-66 (1998).
- Crisp, M., et al. Coupling of the nucleus and cytoplasm: role of the LINC complex. The Journal of cell biology. 172, 41-53 (2006).
- Haque, F., et al. SUN1 interacts with nuclear lamin A and cytoplasmic nesprins to provide a physical connection between the nuclear lamina and the cytoskeleton. Molecular and cellular biology. 26, 3738-3751 (2006).
- Hodzic, D. M., Yeater, D. B., Bengtsson, L., Otto, H., Stahl, P. D. Sun2 is a novel mammalian inner nuclear membrane protein. The Journal of biological chemistry. 279, 25805-25812 (2004).
- Starr, D. A.
- Mellad, J. A., Warren, D. T., Shanahan, C. M. Nesprins LINC the nucleus and cytoskeleton. Current opinion in cell biology. 23, 47-54 (2011).
- Fridolfsson, H. N., Starr, D. A. Kinesin-1 and dynein at the nuclear envelope mediate the bidirectional migrations of nuclei. The Journal of cell biology. 191, 115-128 (2010).
- Meyerzon, M., Fridolfsson, H. N., Ly, N., McNally, F. J., Starr, D. A. UNC-83 is a nuclear-specific cargo adaptor for kinesin-1-mediated nuclear migration. Development. 136, 2725-2733 (2009).
- Padmakumar, V. C., et al. Enaptin, a giant actin-binding protein, is an element of the nuclear membrane and the actin cytoskeleton. Experimental cell research. 295, 330-339 (2004).
- Roux, K. J., et al. Nesprin 4 is an outer nuclear membrane protein that can induce kinesin-mediated cell polarization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 2194-2199 (2009).
- Wilhelmsen, K., et al. a novel outer nuclear membrane protein, associates with the cytoskeletal linker protein plectin. The Journal of cell biology. 171, 799-810 (2005).
- Wilson, M. H., Holzbaur, E. L. Nesprins anchor kinesin-1 motors to the nucleus to drive nuclear distribution in muscle cells. Development. 142, 218-228 (2015).
- Yu, J., et al. KASH protein Syne-2/Nesprin-2 and SUN proteins SUN1/2 mediate nuclear migration during mammalian retinal development. Human molecular genetics. 20, 1061-1073 (2011).
- Zhang, X., et al. Syne-1 and Syne-2 play crucial roles in myonuclear anchorage and motor neuron innervation. Development. 134, 901-908 (2007).
- Zhang, J., et al. Nesprin 1 is critical for nuclear positioning and anchorage. Human molecular genetics. 19, 329-341 (2010).
- Stewart-Hutchinson, P. J., Hale, C. M., Wirtz, D., Hodzic, D. Structural requirements for the assembly of LINC complexes and their function in cellular mechanical stiffness. Experimental cell research. 314, 1892-1905 (2008).
- Zhang, X., et al. SUN1/2 and Syne/Nesprin-1/2 complexes connect centrosome to the nucleus during neurogenesis and neuronal migration in mice. Neuron. 64, 173-187 (2009).
- Razafsky, D., Hodzic, D. Temporal and tissue-specific disruption of LINC complexes in vivo. Genesis. 52, 359-365 (2014).
- Razafsky, D., Hodzic, D. A variant of Nesprin1 giant devoid of KASH domain underlies the molecular etiology of autosomal recessive cerebellar ataxia type I. Neurobiology of disease. 78, 57-67 (2015).
- Razafsky, D., Blecher, N., Markov, A., Stewart-Hutchinson, P. J., Hodzic, D. LINC complexes mediate the positioning of cone photoreceptor nuclei in mouse retina. PloS one. 7, e47180 (2012).
- Razafsky, D. S., Ward, C. L., Kolb, T., Hodzic, D. Developmental regulation of linkers of the nucleoskeleton to the cytoskeleton during mouse postnatal retinogenesis. Nucleus. 4, 399-409 (2013).
