Introduction
परमाणु लिफाफा (पूर्वोत्तर) कोशिका द्रव्य से nucleoplasm अलग करती है। यह परमाणु pores, पर कनेक्ट है कि एक आंतरिक और बाहरी परमाणु झिल्ली (INM और क्रमशः onm,) से बना है। दोनों झिल्ली द्वारा चित्रित लुमेन perinuclear अंतरिक्ष (पीएन) कहा जाता है। Onm किसी न किसी जालिका (ईआर) का एक विस्तार है, और INM परमाणु पटल का पालन करता है, ए और बी प्रकार के प्रतिनिधित्व वाले परमाणु टाइप वी माध्यमिक तंतुओं का एक meshwork 1,2 lamins। Nucleoskeleton और cytoskeleton (LINC) परिसरों के Linkers शारीरिक रूप से cytoskeletal तंतु और आणविक मोटर्स (चित्रा 1 ए) के नाभिक के इंटीरियर से कनेक्ट करने के लिए पूरे परमाणु लिफाफा कि अवधि macromolecular विधानसभाओं हैं। सूर्य (Sad1 / Unc84) प्रोटीन और Nesprins (परमाणु लिफाफा SPectRINS): वे पूर्वोत्तर के अभिन्न transmembrane प्रोटीन के दो परिवारों की विशेषताएँ कि evolutionarily संरक्षित रूपांकनों के बीच बातचीत से मिलकर बनता है। स्तनधारियों में, Sun1 और Sun2 ए.आर.जिसका एन टर्मिनल nucleoplasmic क्षेत्र ए और बी प्रकार lamins 3-5 के साथ सीधे संपर्क INM की ई transmembrane प्रोटीन। पीएन भीतर INM के दूसरे पक्ष पर, सूर्य प्रोटीन 150 सी टर्मिनल अमीनो एसिड रवि डोमेन बुलाया ~ के एक विकासवादी-संरक्षित खिंचाव बंदरगाह। रवि डोमेन विकासवादी-संरक्षित KASH के साथ सीधे बातचीत (Klarsicht / Anc -1, उस वक़्त अनुरूपता) डोमेन, Nesprins की आणविक हस्ताक्षर। KASH डोमेन के एक transmembrane डोमेन 6 से पीछा पीएन में protrudes कि ~ 30 सी टर्मिनल अमीनो एसिड के एक खंड से मिलकर बनता है। कम से कम चार अलग Nesprin जीन (Nesprin1-4) पूर्वोत्तर 7 बजे स्थानीय बनाना प्रोटीन है कि KASH युक्त सांकेतिक शब्दों में बदलना। एक आश्चर्यजनक 1,000 केडीए (Nesprin1 विशाल) जिसका आकार बदलती ~ 50kDa (Nesprin4) से Nesprins, के cytoplasmic क्षेत्रों, कई spectrin ऐसे actin, plectin और आणविक मोटर्स 8 के रूप में cytoskeletal घटकों के साथ उनकी बातचीत को सक्षम करने को दोहराता है और साथ ही विशिष्ट रूपांकनों शामिल 13।
<रीढ़ और अकशेरूकीय में पी वर्ग = "jove_content"> अध्ययन Lamin / सूर्य / Nesprin / आणविक मोटर्स एक evolutionarily संरक्षित 'धुरी' परमाणु प्रवास और लंगर को नियंत्रित करने का गठन कर दिखाया है। LINC जटिल घटकों के कई नाकआउट (को) माउस मॉडल का वर्णन किया और स्तनधारी विकास 9,14,15 दौरान पूर्वोत्तर में सूर्य और Nesprin प्रोटीन की भूमिका को समझने के लिए एक रूपरेखा प्रदान करने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाई थी गया है। हालांकि, इन मॉडलों सबसे विशेष रूप से उपस्थित कई महत्वपूर्ण कमियां: के phenotypical योगदान भेद में गैर स्वायत्त प्रभाव, 2) कठिनाई सेल के कारण phenotypes की व्याख्या में 1) कठिनाई KASH-कम Nesprin बनाम KASH युक्त, 3) 16 isoforms कई प्रकार की कोशिकाओं में पूर्वोत्तर में सूर्य और Nesprin प्रोटीन के कार्यात्मक अतिरेक दोनों की KASH-डोमेन के लिए चूहों की कमी 17 में सभी सूर्य-KASH बातचीत और चूहों के 4) प्रसवकालीन मारक निष्क्रिय करने के लिए जटिल प्रजनन योजनाओं की आवश्यकता हैNesprins1 और 2 वयस्क के विश्लेषण 18 phenotypes अलग करता है।इस प्रोटोकॉल इस प्रकार ऊपर उल्लिखित कमियों के कई दरकिनार, एक सेल स्वायत्त और विकासात्मक विनियमित तरीके से विवो में सभी सूर्य-KASH बातचीत को बाधित करने के लिए बनाया गया एक उपन्यास माउस मॉडल, का वर्णन है। इस Cre / lox आधारित माउस मॉडल दो महत्वपूर्ण अवधारणाओं पर निर्भर करता है: 1) किसी भी ज्ञात Nesprin प्रोटीन की KASH डोमेन सेल संस्कृति प्रणालियों में पूर्वोत्तर के लिए EGFP को निशाना बनाने और 2) सूर्य डोमेन की overexpression इस प्रकार, KASH डोमेन के साथ मिश्रित होकर बातचीत करने के लिए पर्याप्त है किसी भी KASH डोमेन सभी अंतर्जात रवि डोमेन तर और एक प्रमुख नकारात्मक तरीके से 17 (चित्रा 1 बी) में LINC परिसरों को निष्क्रिय करेगा। इस प्रोटोकॉल ऊतक कटाई और अनुमस्तिष्क Purkinje कोशिकाओं में सभी सूर्य-KASH बातचीत के विघटन पुष्टि करने के लिए प्रयोग किया जाता है प्रसंस्करण कदम का वर्णन है।
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Protocol
आचार कथन: पशु विषयों को शामिल प्रक्रियाओं सेंट लुइस में वाशिंगटन विश्वविद्यालय में संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) द्वारा अनुमोदित किया गया।
1. माउस प्रजनन और जीनोटाइपिंग
- (PCP2Cre कैग-EGFP / KASH2) 19,20 टीजी उत्पादन करने के लिए टीजी (सीएजी lacZ / EGFP-KASH2) टीजी के साथ चूहों (PCP2-सीआरई) चूहों नस्ल। नोट: इस प्रोटोकॉल के शेष सेरिबैलम भीतर Purkinje कोशिकाओं को EGFP-KASH2 अभिव्यक्ति को सीमित करने के लिए टीजी (PCP2-सीआरई) माउस लाइन के उपयोग पर केंद्रित है, एक समान प्रक्रिया किसी अन्य टीजी (सीआरई) माउस के साथ पीछा किया जा सकता है ( 2A चित्रा)।
- पहले 19 में वर्णित के रूप में दोनों EGFP और रचनात्मक ट्रांसजीन को शरण देने के पिल्ले की पहचान करने के लिए जीनोटाइपिंग प्रदर्शन करते हैं।
विच्छेदन और ऊतक संग्रह के लिए सामग्री की 2. तैयारी
- -20 डिग्री सेल्सियस पर 30% पीबीएस में सुक्रोज (1x पीबीएस के 30 ग्राम सुक्रोज / 100 मिलीलीटर) और दुकान की 100 मिलीलीटर की तैयारी। ऊतक घंटा की दिनtranscardial perfusions के लिए एक 35 मिलीलीटर सिरिंज में arvesting, पिघलना और सुक्रोज समाधान का भार ~ 30-35 मिलीलीटर।
- पीबीएस में 4% पीएफए के 40 मिलीलीटर (10 एमएल 16% paraformaldehyde और 30 मिलीलीटर पीबीएस) तैयार करें। Transcardial perfusions के लिए एक 35 मिलीलीटर सिरिंज में लोड ~ 30-35 मिलीलीटर 4% की पीएफए।
- ऊतक विच्छेदन के लिए पीबीएस के 10 मिलीलीटर के साथ एक 10 सेमी टिशू कल्चर प्लेट भरें।
- 16 मिलीग्राम / एमएल ketamine और 3 मिलीग्राम / एमएल xylazine से मिलकर एक ketamine / xylazine कॉकटेल तैयार करें।
- विच्छेदन के लिए 70% इथेनॉल का एक समाधान तैयार है।
3. विच्छेदन और ऊतक संग्रह
- 1 मिलीलीटर सिरिंज का उपयोग करना, शरीर के वजन के 25 ग्राम प्रति ketamine / xylazine कॉकटेल के 500 μl इंजेक्षन और 15 मिनट के ~ लिए प्रतीक्षा करें। वैकल्पिक रूप से, ब्याज की जैविक प्रणाली के लिए उचित है कि एक और संस्थागत मंजूरी दे दी बेहोश करने की क्रिया विधि का उपयोग करें।
- बेहोश करने की क्रिया पर, धीरे से पृष्ठीय पक्ष के साथ एक स्टायरोफोम ट्रे पर सभी पंजे पिन, दर्द प्रतिक्रिया की कमी की पुष्टि करने के पीछे पंजा चुटकीमाउस नीचे का सामना करना पड़।
- 70% इथेनॉल के साथ पेट स्प्रे और दिल तक पहुंच हासिल करने रिब पिंजरे के ऊपर से पेट के निचले हिस्से से एक चीरा बनाते हैं।
- दिल के सही प्रांगण में एक छोटा सा चीरा और दिल के बाएं वेंट्रिकल में 30% sucrose के समाधान युक्त सिरिंज डालें।
- ~ 2-5 मिलीलीटर प्रति मिनट की दर पर समाधान छिड़कना। जब खाली, सिरिंज को हटाने और 4% पीएफए समाधान के साथ दोहराएँ।
- स्टायरोफोम ट्रे से माउस खोलना और मस्तिष्क का उपयोग करने के लिए सिर काटना।
- संदंश और कैंची का उपयोग पशु के सिर के चारों ओर त्वचा निकालें। एक सुई के साथ खोपड़ी के पीछे भाग में एक छेद प्रहार और ध्यान से कैंची और विदारक संदंश के साथ खोपड़ी को हटा दें।
- मस्तिष्क स्पष्ट रूप से सुलभ है, एक बार सेरिबैलम हटाने और पीबीएस में जगह संदंश का उपयोग करें। एक छुरी के साथ बाण के समान विमान में सेरिबैलम दोटूक और 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर में 30% sucrose के समाधान के लिए स्थानांतरण। नोट: तैयार करने के लिएआयल वर्गों रहे हैं, से पहले ऊतक एम्बेडिंग और सेक्शनिंग करने के लिए 4% पीएफए में 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर सेरिबैलम तय कर लो।
4. ऊतक प्रसंस्करण और सेक्शनिंग
- सूखी बर्फ और 2-मिथाइल ब्यूटेन का एक घोल तैयार करें। स्नान का तापमान 5 मिनट के लिए संतुलित करने की अनुमति दें।
- अक्टूबर यौगिक के साथ एक cryomold भरें और मोल्ड में bisected सेरिबैलम के एक आधा जगह है।
- एक विदारक माइक्रोस्कोप और संदंश स्थिति की एक जोड़ी (सेरिबैलम के midline के पास) bisected सतह का सामना करना पड़ जाता है, ताकि सेरिबैलम का उपयोग करना।
- अक्टूबर यौगिक ऊतक नमूना के चारों ओर एक ठोस सफेद मैट्रिक्स का गठन किया है जब तक 5 मिनट के लिए सूखी बर्फ घोल को cryomold स्थानांतरण। नोट: यदि जरूरी हुआ तो जमे हुए नमूना अब -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है।
- लेबल सेरे के 15 माइक्रोन वर्गों को इकट्ठा करने के क्रम में निर्माता के निर्देशों के अनुसार ऊतक वर्गों इकट्ठा करने के लिए पाली lysine स्लाइड इलाज से पहले और cryostat तैयारbellum। वर्गों को इकट्ठा करने के लिए, ध्यान से स्लाइड की पाली lysine लेपित पक्ष के साथ अक्टूबर अनुभाग से संपर्क करें। खंड के उन्मुखीकरण को संरक्षित करने के लिए, इस कदम के दौरान स्लाइड बारी बारी से नहीं है।
- धुंधला हो जाना और इमेजिंग के साथ आगे बढ़ने तक -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर ऊतक वर्गों।
5. धुंधला और सेरिबैलम धारा की इमेजिंग
- ऊतक धुंधला करने से पहले निम्न समाधानों को तैयार:
पीबीएस के ~ 50 मिलीलीटर
~ पीबीएस में 4% पीएफए के 5-10 मिलीलीटर
~ पीबीएस में 0.5% ट्राइटन X-100, 10% गधा सीरम के 10-20 मिलीलीटर - पिघलना अनुमस्तिष्क वर्गों। महत्वपूर्ण बात है, EGFP के लुप्त होती रोकने के लिए सतत और तीव्र प्रकाश के किसी भी स्रोत के लिए अपने जोखिम को कम।
- एक हाइड्रोफोबिक बाधा कलम का प्रयोग, ऊतक वर्गों के चारों ओर एक आयत आकर्षित।
- 5 मिनट के लिए 4% पीएफए के साथ वर्गों पोस्ट-ठीक। हाइड्रोफोबिक बाधा (आमतौर पर ~ 500 μl) द्वारा चित्रित पूरे क्षेत्र को कवर करने के लिए पर्याप्त तरल का प्रयोग करें। एक निर्वात या पिपेट पुनः का उपयोगलगानेवाला ऊतक वर्गों को परेशान करने के लिए नहीं विशेष रूप से सावधान किया जा रहा ले जाते हैं।
- एक विंदुक के साथ, धीरे ऊतक वर्गों के बिना परेशान स्लाइड पर पीबीएस लागू होते हैं। 5 मिनट के बाद सावधानी से तरल निकालने के लिए वैक्यूम या पिपेट का उपयोग करें। पीबीएस तीन बार की कुल कुल्ला दोहराएँ।
- एक विंदुक का प्रयोग, ध्यान से पीबीएस में 0.5% ट्राइटन X-100, 10% गधा सीरम में (समाधान के 900 μl प्रति 3 μl Calbindin और / या Nesprin2 एंटीबॉडी) उचित प्राथमिक एंटीबॉडी के कमजोर पड़ने के लागू होते हैं। अंधेरे में कमरे के तापमान पर एक घंटे के लिए सेते हैं।
नोट: EGFP-KASH2 जमे हुए वर्गों पर प्रत्यक्ष प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा दिखाई जाएगी, और यह एक एंटी-EGFP एंटीबॉडी का उपयोग करने के लिए आवश्यक नहीं है। आयल वर्गों तैयार किया गया है हालांकि, अगर EGFP-KASH2 की इमेजिंग एक विरोधी EGFP एंटीबॉडी के साथ immunodetection की आवश्यकता है। - एंटीबॉडी समाधान निकालें और पीबीएस तीन बार से कुल्ला।
- 1 तैयार: 0.5% ट्राइटन X-100 में एलेक्सा-स्त्राव माध्यमिक एंटीबॉडी के 1,000 dilutions,अंधेरे में 10% गधा पीबीएस में सीरम और दुकान।
- धीरे अंतिम पीबीएस कुल्ला हटाने और अंधेरे में एक घंटे के लिए माध्यमिक एंटीबॉडी कमजोर पड़ने लागू होते हैं।
- माध्यमिक एंटीबॉडी समाधान निकालें कुल्ला और धारा तीन बार धोएं। यदि आवश्यक हो, पहले पीबीएस आवेदन के दौरान, इस तरह के DAPI (~ 300nm) के रूप में एक परमाणु दाग, लागू होते हैं।
- पूरी तरह से ऊतक और ऊतक खंड पर बढ़ते मीडिया की जगह ~ 5-7 μl चारों ओर से पीबीएस समाधान निकालने। ऊतक खंड के शीर्ष पर एक गिलास coverslip रखें और अंधेरे में कमरे के तापमान पर ~ 15-30 मिनट के लिए अलग निर्धारित करें।
- EGFP और कदम 5.8 / 5.9 में इस्तेमाल माध्यमिक एंटीबॉडी के लिए उपयुक्त किसी अन्य तरंग दैर्ध्य कल्पना करने के लिए उपयुक्त फिल्टर से लैस एक प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी का प्रयोग करें। अनुमस्तिष्क स्लाइस में, EGFP-KASH2 परमाणु रिम्स को देखने के लिए एक 20x उद्देश्य का उपयोग करें।
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Representative Results
इस प्रोटोकॉल टीजी (PCP2-सीआरई) चूहों का उपयोग अनुमस्तिष्क Purkinje कोशिकाओं को EGFP-KASH2 अभिव्यक्ति को सीमित करने के लिए टीजी (सीएजी lacZ / EGFP-KASH2) माउस मॉडल की उपयोगिता को दिखाता है। टीजी में (PCP2Cre कैग-EGFP / KASH2) वंश, lacZ / वी 5 खुला पढ़ने फ्रेम जिससे विशेष रूप से Purkinje कोशिकाओं (2A चित्रा) के लिए लक्षित EGFP-KASH2 की अभिव्यक्ति के लिए अग्रणी रचनात्मक Recombinase से पी 6 पर excised है। जैसी कि उम्मीद थी नाभिक (चित्रा 2 बी) के आसपास मनाया EGFP पॉजिटिव रिम-तरह के पैटर्न से संकेत के रूप में, EGFP-KASH2 परमाणु लिफाफा करने का लक्ष्य है। किसी भी शारीरिक लक्षण प्रारूप को अधिकतम करने के लिए, यह एक सेल विशिष्ट एंटीबॉडी मार्कर के साथ सह दाग रहे हैं कि EGFP-KASH2 सकारात्मक कोशिकाओं के प्रतिशत की गणना के द्वारा कि EGFP-KASH2 लक्षित कोशिकाओं के बहुमत में व्यक्त किया जाता है सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण है। इस उदाहरण में, EGFP-KASH2 अभिव्यक्ति Calbindin पॉजिटिव Purkinje कोशिकाओं (चित्रा 2 बी) के 70% से अधिक में पाया गया था। इन कब्जा मेंमाहौल, हम 10 महीने की उम्र में टीजी (PCP2Cre कैग-EGFP / KASH2) चूहों 20 में कोई महत्वपूर्ण ऊतकीय या व्यवहार phenotypes का पालन नहीं किया। यह किसी भी रूपात्मक या व्यवहार phenotype के एक अनपेक्षित सेल प्रकार / ऊतक में EGFP KASH2 के अस्थानिक अभिव्यक्ति के कारण नहीं है कि यह सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण है। कि सम्मान करने के लिए, EGFP-KASH2 दाना सेल परत या टीजी (PCP2Cre कैग-EGFP-KASH2) cerebella (चित्रा 2 बी) की आणविक परत में नहीं मनाया गया।
अंत में, यह EGFP-KASH2 व्यक्त कोशिकाओं में LINC जटिल व्यवधान की हद तक इस बात की पुष्टि करने के लिए महत्वपूर्ण है। इस EGFP-KASH2 व्यक्त कोशिकाओं के पूर्वोत्तर से उनके विस्थापन पर जोर करने के लिए उच्च गुणवत्ता विरोधी Nesprin एंटीबॉडी का उपयोग कर प्राप्त किया जा सकता है। 3 चित्र में दिखाया गया है Purkinje कोशिकाओं EGFP-KASH2 reta व्यक्त नहीं करते कि, जबकि अंतर्जात Nesprin2 EGFP-KASH2 कि एक्सप्रेस Purkinje कोशिकाओं के परमाणु लिफाफा (चित्रा 3 शीर्ष पैनल, पीले तीर) से विस्थापित हैपरमाणु लिफाफा पर अंतर्जात Nesprin2 (चित्रा 3 शीर्ष पैनल, सफेद तीर) में। जैसी कि उम्मीद थी, Cre पर Recombinase व्यक्त नहीं करते जो नियंत्रण littermates, पूरे Purkinje सेल आबादी (चित्रा 3 नीचे सफेद तीर) के परमाणु लिफाफा पर Nesprin2 प्रदर्शित करते हैं। कई रिपोर्टों अब इस तरह के कंकाल की मांसपेशी फाइबर और कोन फोटोरिसेप्टर 19,21 के रूप में अतिरिक्त ऊतकों और प्रकार की कोशिकाओं में अंतर्जात Nesprins, के विस्थापन के साथ EGFP-KASH2 की अभिव्यक्ति की पुष्टि की है।
चित्रा 1. LINC परिसरों cytoskeleton करने के नाभिक कनेक्ट और EGFP-KASH2 की overexpression द्वारा बाधित कर रहे हैं। साइटोप्लास्मिक cytoskeleton करने के नाभिक के इंटीरियर कनेक्ट कि LINC परिसरों की (ए) चित्रण। रवि डोमेन KASH डोमेन के साथ मिश्रित होकर बातचीत कि नोटसभी Nesprins से (Nesprins 1-4)। EGFP-KASH2 (बी) overexpression इस प्रकार आसपास के साइटोप्लास्मिक cytoskeleton से नाभिक रखती, एक प्रमुख नकारात्मक फैशन में, ईआर के लिए परमाणु लिफाफा से अंतर्जात Nesprins विस्थापित।
टीजी (PCP2-सीआरई) टीजी में चूहों परिणाम (PCP2Cre कैग-EGFP-KASH2) संतानों के लिए टीजी (सीएजी lacZ / EGFP-KASH2) की EGFP-KASH2 चित्रा 2. overexpression विशेष अनुमस्तिष्क Purkinje कोशिकाओं को निशाना बनाया। (ए) प्रजनन जिसमें रचनात्मक Recombinase अनुमस्तिष्क Purkinje कोशिकाओं में विशेष रूप से व्यक्त किया जाता है। अभिव्यक्ति (पी 6) पर, रचनात्मक Recombinase यह lacZ ओआरएफ Excises और EGFP-KASH2 अभिव्यक्ति लाती है जहां नाभिक में translocates। (बी) टीजी (PCP2Cre कैग-EGFP-KASH2) चूहों विशेष अनुमस्तिष्क Purkinje कोशिकाओं identif में EGFP KASH2 का इजहारCalbindin साथ आइईडी (लाल रंग में रंग)। आणविक परत के दोनों अनुमस्तिष्क ग्रेन्युल न्यूरॉन्स और इन्तेर्नयूरोंस EGFP-KASH2 अभिव्यक्ति के लिए नकारात्मक हैं कि ध्यान दें। लघुरूप: मोल: आण्विक परत, पीसीएल: Purkinje सेल परत और GCL: छोटा दाना सेल परत।
चित्रा अनुमस्तिष्क Purkinje कोशिकाओं में अंतर्जात LINC परिसरों के 3. विघटन। EGFP-KASH2 की एकल कोंफोकल विमान दिखा अभिव्यक्ति Purkinje कोशिकाओं के परमाणु लिफाफा से (लाल रंग में रंग) अंतर्जात Nesprin2 (ऊपर पीले तीर) विस्थापित कि। EGFP-KASH2 अभिव्यक्ति की कमी Purkinje कोशिकाओं अपने परमाणु लिफाफा पर अंतर्जात Nesprin2 (सफेद तीर ऊपर) का कहना है कि ध्यान दें। टीजी (सीएजी lacZ / EGFP-KASH2) नियंत्रण littermates में, कोई EGFP संकेत मनाया जाता है और Nesprin2 सभी Purki के परमाणु लिफाफा में पता चला है
इस प्रोटोकॉल की उपयोगिता को दिखाता हैटीजी (सीएजी lacZ / EGFP-KASH2) माउस मॉडल टीजी (PCP2-सीआरई) चूहों का उपयोग अनुमस्तिष्क Purkinje कोशिकाओं को EGFP-KASH2 अभिव्यक्ति को सीमित करने के लिए। टीजी में (PCP2Cre कैग-EGFP / KASH2) वंश, lacZ / वी 5 खुला पढ़ने फ्रेम जिससे विशेष रूप से Purkinje कोशिकाओं (2A चित्रा) के लिए लक्षित EGFP-KASH2 की अभिव्यक्ति के लिए अग्रणी रचनात्मक Recombinase से पी 6 पर excised है। जैसी कि उम्मीद थी नाभिक (चित्रा 2 बी) के आसपास मनाया EGFP पॉजिटिव रिम-तरह के पैटर्न से संकेत के रूप में, EGFP-KASH2 परमाणु लिफाफा करने का लक्ष्य है। किसी भी शारीरिक लक्षण प्रारूप को अधिकतम करने के लिए, यह एक सेल विशिष्ट एंटीबॉडी मार्कर के साथ सह दाग रहे हैं कि EGFP-KASH2 सकारात्मक कोशिकाओं के प्रतिशत की गणना के द्वारा कि EGFP-KASH2 लक्षित कोशिकाओं के बहुमत में व्यक्त किया जाता है सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण है। इस उदाहरण में, EGFP-KASH2 अभिव्यक्ति Calbindin पॉजिटिव Purkinje कोशिकाओं (चित्रा 2 बी) के 70% से अधिक में पाया गया था। इन स्थितियों में, हम किसी भी महत्वपूर्ण ऊतकीय या behaviora का पालन नहीं किया10 महीने की उम्र में टीजी (PCP2Cre कैग-EGFP / KASH2) चूहों 20 में एल phenotypes। यह किसी भी रूपात्मक या व्यवहार phenotype के एक अनपेक्षित सेल प्रकार / ऊतक में EGFP KASH2 के अस्थानिक अभिव्यक्ति के कारण नहीं है कि यह सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण है। कि सम्मान करने के लिए, EGFP-KASH2 दाना सेल परत या टीजी (PCP2Cre कैग-EGFP-KASH2) cerebella (चित्रा 2 बी) की आणविक परत में नहीं मनाया गया।
अंत में, यह EGFP-KASH2 व्यक्त कोशिकाओं में LINC जटिल व्यवधान की हद तक इस बात की पुष्टि करने के लिए महत्वपूर्ण है। इस EGFP-KASH2 व्यक्त कोशिकाओं के पूर्वोत्तर से उनके विस्थापन पर जोर करने के लिए उच्च गुणवत्ता विरोधी Nesprin एंटीबॉडी का उपयोग कर प्राप्त किया जा सकता है। 3 चित्र में दिखाया गया है, अंतर्जात Nesprin2 EGFP-KASH2 कि एक्सप्रेस Purkinje कोशिकाओं के परमाणु लिफाफा (चित्रा 3 शीर्ष पैनल, पीले तीर) से विस्थापित है EGFP-KASH2 परमाणु लिफाफा पर अंतर्जात Nesprin2 बनाए रखने व्यक्त नहीं करते कि Purkinje कोशिकाओं (चित्रा, जबकि 3 (चित्रा 3 नीचे सफेद तीर) के परमाणु लिफाफा पर Nesprin2 प्रदर्शित करते हैं। कई रिपोर्टों अब इस तरह के कंकाल की मांसपेशी फाइबर और कोन फोटोरिसेप्टर 19,21 के रूप में अतिरिक्त ऊतकों और प्रकार की कोशिकाओं में अंतर्जात Nesprins, के विस्थापन के साथ EGFP-KASH2 की अभिव्यक्ति की पुष्टि की है।
चित्रा 1. LINC परिसरों cytoskeleton करने के नाभिक कनेक्ट और EGFP-KASH2 की overexpression द्वारा बाधित कर रहे हैं। साइटोप्लास्मिक cytoskeleton करने के नाभिक के इंटीरियर कनेक्ट कि LINC परिसरों की (ए) चित्रण। सूरज कि डोमेन के सभी Nesprins (Nesprins 1-4) से KASH डोमेन के साथ मिश्रित होकर बातचीत पर ध्यान दें। (बी) overexpression ओच EGFP-KASH2 इस प्रकार आसपास के साइटोप्लास्मिक cytoskeleton से नाभिक रखती, एक प्रमुख नकारात्मक फैशन में, ईआर के लिए परमाणु लिफाफा से अंतर्जात Nesprins विस्थापित। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
टीजी (PCP2-सीआरई) टीजी में चूहों परिणाम (PCP2Cre कैग-EGFP-KASH2) संतानों के लिए टीजी (सीएजी lacZ / EGFP-KASH2) की EGFP-KASH2 चित्रा 2. overexpression विशेष अनुमस्तिष्क Purkinje कोशिकाओं को निशाना बनाया। (ए) प्रजनन जिसमें रचनात्मक Recombinase अनुमस्तिष्क Purkinje कोशिकाओं में विशेष रूप से व्यक्त किया जाता है। अभिव्यक्ति (पी 6) पर, रचनात्मक Recombinase यह lacZ ओआरएफ Excises और EGFP-KASH2 अभिव्यक्ति लाती है जहां नाभिक में translocates। (बी) टीजी (PCP2Cre कैग-EGFP-KASH2) विशेष रूप से Calbindin के साथ की पहचान अनुमस्तिष्क Purkinje कोशिकाओं में EGFP KASH2 को व्यक्त चूहों () लाल रंग में रंग। आणविक परत के दोनों अनुमस्तिष्क ग्रेन्युल न्यूरॉन्स और इन्तेर्नयूरोंस EGFP-KASH2 अभिव्यक्ति के लिए नकारात्मक हैं कि ध्यान दें। लघुरूप: मोल: आण्विक परत, पीसीएल: Purkinje सेल परत और GCL:। ग्रेन्युल सेल परत यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा अनुमस्तिष्क Purkinje कोशिकाओं में अंतर्जात LINC परिसरों के 3. विघटन। EGFP-KASH2 की एकल कोंफोकल विमान दिखा अभिव्यक्ति Purkinje कोशिकाओं के परमाणु लिफाफा से (लाल रंग में रंग) अंतर्जात Nesprin2 (ऊपर पीले तीर) विस्थापित कि। EGFP-KASH2 अभिव्यक्ति की कमी Purkinje कोशिकाओं अपने परमाणु लिफाफा पर अंतर्जात Nesprin2 का कहना है कि (कण नोटई) शीर्ष तीर। टीजी (सीएजी lacZ / EGFP-KASH2) नियंत्रण littermates में, कोई EGFP संकेत मनाया जाता है और Nesprin2 सभी Purkinje कोशिकाओं (सफेद तीर नीचे) की परमाणु लिफाफा पर पता चला है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
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Discussion
सबसे महत्वपूर्ण कदम सफलतापूर्वक टीजी (सीएजी lacZ / EGFP-KASH2) मॉडल एक उपयुक्त Cre माउस लाइन (एस) की पहचान करने के लिए है का उपयोग vivo में LINC परिसरों की भूमिका का अध्ययन करने के लिए। Cre समान रास्ते में शामिल अन्य सेल-प्रकार में सक्रिय है, तो वास्तव में, यह परिणामों की व्याख्या जटिल हो सकता है। सेरिबैलम (चित्रा 2 बी) की आणविक और दाना सेल परतों में यहाँ के रूप में दिखाया इसलिए, यह, पास कोशिकाओं की जांच करने के लिए महत्वपूर्ण है। इसी तरह, किसी भी physiologically प्रासंगिक phenotypes अधिकतम करने के लिए यह ब्याज की सेल प्रकार भर में बड़े पैमाने पर रचनात्मक अभिव्यक्ति के साथ एक रचनात्मक तनाव की पहचान करने के लिए महत्वपूर्ण है। यह ब्याज की प्रणाली के विकास के दौरान LINC जटिल घटकों की अभिव्यक्ति पैटर्न की एक में गहराई से लक्षण वर्णन शुरू करने के लिए भी महत्वपूर्ण है। दरअसल, टीजी (सीएजी lacZ / EGFP-KASH2) माउस मॉडल की एक खामी सूर्य प्रोटीन या Nesprins वेरिएंट जैविक प्रणाली में शामिल कर रहे हैं के रूप में जो इसे किसी भी जानकारी प्रदान नहीं करता है यूnder विचार। हालांकि, इस मुद्दे को दोनों प्रतिलेख और प्रोटीन के स्तर पर एक कठोर लक्षण वर्णन उपक्रम द्वारा दूर किया जा सकता है। वास्तव में, इस तरह के अध्ययन सीएनएस के विकास के दौरान विशिष्ट LINC जटिल घटकों की भूमिका के बारे में महत्वपूर्ण निष्कर्ष करने के लिए नेतृत्व और 21,22 homeostasis जो कई अवसरों पर कार्य शुरू कर दिया गया है।
इस प्रोटोकॉल तय सीएनएस ऊतकों के उपयोग पर ध्यान केंद्रित किया है, जबकि अंत में, टीजी (सीएजी lacZ / EGFP-KASH2) चूहों इन विट्रो में LINC परिसरों में खलल न डालें के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए अलग और संस्कृति प्राथमिक कोशिकाओं के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। इस योजना का उपयोग करना, यह अलग है और ऐसे समय चूक वीडियो माइक्रोस्कोपी के रूप में आवेदन के लिए EGFP- KASH2 पॉजिटिव कोशिकाओं के प्राथमिक संस्कृतियों को शुद्ध करने के लिए संभव है। इस तरह के न्यूरॉन्स के रूप में कम अभिकर्मक क्षमता या प्राथमिक संस्कृति प्रणालियों के लिए आवश्यक lentiviral उत्पादन, नजरअंदाज।
सारांश में, टीजी (सीएजी lacZ / EGFP-KASH2) चूहों मज़ा अध्ययन करने के लिए नए और रोमांचक संभावनाएं खुलऊतकों और सेल प्रकार की एक विस्तृत विविधता में भ्रूण और प्रसव के बाद स्तनधारी विकास की प्रक्रिया के दौरान इन विवो में LINC परिसरों के ction बुनियादी कोशिका जीव विज्ञान सवालों का पता करने के लिए।
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Disclosures
लेखकों के पास खुलासे के लिए कुछ भी नहीं है।
Acknowledgments
लेखकों (विभाग नेत्र विज्ञान और दृश्य विज्ञान) और मेडिसिन के सेंट लुइस स्कूल में वाशिंगटन विश्वविद्यालय में माउस आनुवंशिकी कोर के आणविक आनुवंशिकी कोर की, आकृति विज्ञान और इमेजिंग कोर के कर्मचारियों को धन्यवाद। लेखकों सेलुलर के लिए मैकडोनल केंद्र और आण्विक तंत्रिका जीव विज्ञान, मस्तिष्क संबंधी विकार के लिए आशा है कि केंद्र से छोटे अनुदान कार्यक्रम के द्वारा समर्थित हैं, राष्ट्रीय नेत्र संस्थान (डीएच करने के लिए # R01EY022632), एक राष्ट्रीय नेत्र संस्थान केंद्र कोर अनुदान (# P30EY002687) और एक रिसर्च से अप्रतिबंधित अनुदान नेत्र विज्ञान और दृश्य विज्ञान विभाग को अंधापन रोकने के लिए।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S0389 | |
| 10x PBS | Gibco | 14200-075 | |
| 16% Paraformaldehyde Solution | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| OCT Compound | Tissue-Tek | 4583 | |
| Adhesion Slides | StatLab | M1000W | |
| Donkey Serum | Sigma Aldrich | D9663 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T9284 | |
| ImmuEdge Pen | Vector Laboratories | H-4000 | |
| Anti-Calbindin Antibody | Sigma Aldrich | C9848 | |
| Anti-EGFP Antibody | Abcam | ab13970 | |
| Anti-Nesprin2 Antibody | Previously described in Ref. 21 | ||
| Fluorescent Mounting Media | Dako | S3023 | |
| 2-methyl butane | Sigma Aldrich | O3551 |
References
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