Introduction
L'involucro nucleare (NE) separa nucleoplasma dal citoplasma. Esso è composto da una membrana nucleare interna ed esterna (INM e ONM, rispettivamente) che collegano a pori nucleari. Il lume delineato da due membrane si chiama lo spazio perinucleare (PNS). Il ONM è un'estensione del reticolo endoplasmatico rugoso (ER) e l'INM aderisce alla lamina nucleare, un reticolo di nucleare tipo V filamenti intermedi rappresentato da A e B lamine di tipo 1,2. Linker del nucleoscheletro e citoscheletro (LINC) sono complessi macromolecolari assemblee che attraversano l'intero involucro nucleare collegare fisicamente l'interno del nucleo di filamenti citoscheletrici e motori molecolari (Figura 1A). Sono costituiti da interazioni tra motivi evolutivamente conservati che caratterizzano due famiglie di proteine transmembrana integranti del NE: Sun (SAD1 / Unc84) proteine e Nesprins (nucleare Envelope SPectRINS). Nei mammiferi, Sun1 e Sun2 are transmembrana proteine della INM la cui regione nucleoplasmic N-terminale interagisce direttamente con A e B lamine di tipo 3-5. Sull'altro lato della INM, all'interno del PNS, proteine Sun Harbor un tratto evolutivo conservata di ~ 150 amminoacidi C-terminale chiamato dominio SUN. Domini SUN interagiscono direttamente con il evolutivo conservata KASH (Klarsicht / Anc-1, Syne omologia) dominio, la firma molecolare di Nesprins. Domini KASH consistono di un tratto di ~ 30 C-terminale amminoacidi che sporge nel PNS seguito da un dominio transmembrana 6. Almeno quattro geni distinti Nesprin (Nesprin1-4) codificano KASH contenenti proteine che localizzano al NE 7. Le regioni citoplasmatici di Nesprins, il cui variare taglie da ~ 50kDa (Nesprin4) a un sorprendente 1.000 kDa (Nesprin1 gigante), contengono spectrina multiplo ripete così come i motivi specifici che consente loro interazione con componenti del citoscheletro, come l'actina, plectina e motori molecolari 8- 13.
<p class = "jove_content"> Studi di vertebrati e invertebrati hanno mostrato che / motori molecolari Lamin Sole / Nesprin / costituiscono un "asse" evolutivamente conservata controllare la migrazione nucleare e di ancoraggio. Diversi knock-out (KO) modelli murini di componenti complessi LINC sono stati descritti e sono stati strumentali nel fornire un quadro per capire il ruolo delle proteine Sole e Nesprin a NE durante lo sviluppo dei mammiferi 9,14,15. Tuttavia, questi modelli presentano diversi svantaggi significativi, più in particolare: 1) difficoltà nell'interpretare fenotipi dovuti alla cella effetti non autonomi, 2) difficoltà nel distinguere i contributi fenotipiche di Kash contenenti vs. KASH-meno Nesprin isoforme 16, 3) il la ridondanza funzionale delle proteine Sole e Nesprin al NE in numerosi tipi di cellule richiede sistemi di allevamento complessi per inattivare tutte le interazioni SUN-Kash in topi 17 e 4) la letalità perinatale di topi deficienti per la KASH-dominio di entrambiNesprins1 e 2 preclude l'analisi dei fenotipi adulti 18.Questo protocollo descrive un modello di topo romanzo progettata per distruggere tutte le interazioni SUN-KASH in vivo, in una cella modo autonomo e evolutivamente regolata, bypassando così molti degli inconvenienti sopra delineati. Questo / modello murino basato LOX-Cre si basa su due concetti importanti: 1) il dominio KASH di qualsiasi proteina Nesprin noto è sufficiente per indirizzare EGFP a NE in sistemi di colture cellulari e 2) i domini SUN interagire promiscuamente con i domini Kash, quindi sovraespressione di qualsiasi dominio KASH saturerà tutti i domini SUN endogeni e inattivare complessi LINC in modo negativamente dominante 17 (Figura 1B). Questo protocollo descrive la raccolta dei tessuti e fasi di lavorazione utilizzate per confermare l'interruzione di tutte le interazioni SUN-Kash in cellule di Purkinje cerebellari.
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Protocol
Etica Dichiarazione: procedure che coinvolgono soggetti animali sono stati approvati dalla cura e l'uso Comitato istituzionale animali (IACUC) presso la Washington University di St. Louis.
1. Allevamento Mouse e genotipizzazione
- Breed Tg (CAG-LacZ / EGFP-KASH2) topi con Tg (PCP2-Cre) per produrre topi Tg (PCP2Cre CAG-EGFP / KASH2) 19,20. Nota: Mentre il resto di questo protocollo concentra sull'uso della linea Tg (PCP2-Cre) topo per restringere espressione EGFP-KASH2 alle cellule di Purkinje nel cervelletto, una procedura simile può essere seguita con qualsiasi altra Tg (Cre) mouse ( Figura 2A).
- Eseguire genotipizzazione per individuare i cuccioli che ospitano sia transgeni EGFP e Cre come descritto in precedenza 19.
2. Preparazione dei Materiali per la dissezione e tessuto Collection
- Preparare 100 ml di 30% di saccarosio in PBS (30 g di saccarosio / 100 ml di PBS 1x) e conservare a -20 ° C. Il giorno del tessuto harvesting, disgelo e carico ~ 30-35 ml di soluzione di saccarosio in una siringa da 35 ml per perfusioni transcardial.
- Preparare 40 ml di 4% PFA in PBS (10 ml 16% paraformaldeide e 30 ml PBS). Carico ~ 30-35 ml di 4% PFA in una siringa da 35 ml per perfusioni transcardial.
- Riempire una piastra di coltura tissutale 10 centimetri con 10 ml di PBS per la dissezione dei tessuti.
- Preparare un cocktail di ketamina / xilazina costituito da 16 mg / ml di ketamina e 3 mg / ml xilazina.
- Preparare una soluzione di etanolo al 70% per la dissezione.
3. Dissection e tessuto Collection
- Usando una siringa da 1 ml, 500 ml di iniettare il cocktail ketamina / xylazina per 25 grammi di peso corporeo ed attendere ~ 15 min. In alternativa, utilizzare un altro metodo di sedazione istituzionalmente riconosciuto che è appropriato per il sistema biologico di interesse.
- Su sedazione, pizzicare delicatamente la zampa posteriore per confermare la mancanza di risposta al dolore, riporre tutte le zampe su un vassoio di polistirolo con il lato dorsale delil mouse verso il basso.
- Spruzzare la addome con 70% etanolo e fare un'incisione dal basso addome alla sommità della gabbia toracica per accedere al cuore.
- Effettuare una piccola incisione nell'atrio destro del cuore e inserire la siringa contenente la soluzione di saccarosio al 30% nel ventricolo sinistro del cuore.
- Profumato la soluzione ad una velocità di ~ 2-5 ml per min. Quando è vuoto, rimuovere la siringa e ripetere con la soluzione PFA 4%.
- Sblocca il mouse dal vassoio di polistirolo e decapitarlo per accedere al cervello.
- Togliere la pelle intorno alla testa dell'animale con pinze e forbici. Fare un buco nella parte posteriore del cranio con un ago e rimuovere con attenzione il cranio con forbici e pinze dissezione.
- Una volta che il cervello è chiaramente accessibile, utilizzare pinze per rimuovere il cervelletto e metterlo in PBS. Bisect cervelletto nel piano sagittale con un bisturi e trasferire la soluzione di saccarosio al 30% per una notte a 4 ° C. Nota: Per prepararesono sezioni di paraffina, fissano il cervelletto notte a 4 ° C in PFA 4% prima di incorporamento dei tessuti e sezionamento.
4. Tissue Processing e sezionamento
- Preparare una sospensione di ghiaccio secco e butano 2-metil. Consentire la temperatura del bagno si stabilizzi per 5 min.
- Riempire un cryomold con OCT e mettere la metà del cervelletto bipartita nello stampo.
- Utilizzando un microscopio da dissezione e una coppia di pinze posizione cervelletto modo che la superficie bisecata (vicino alla linea mediana del cervelletto) è rivolto verso l'alto.
- Trasferire il cryomold all'impasto ghiaccio secco per 5 minuti fino a quando il composto ottobre ha formato una solida matrice bianco intorno il campione di tessuto. Nota: I campioni congelati possono essere conservati a -20 ° C, se necessario.
- Etichetta pretrattate diapositive poli-lisina per la raccolta sezioni di tessuto e preparare il criostato secondo le istruzioni del produttore per raccogliere 15 micron sezioni del Cerebellum. Per raccogliere sezioni contattare attentamente la sezione PTOM il lato rivestito poli-lisina della slitta. Per mantenere l'orientamento della sezione, non ruotare la slitta durante questa fase.
- Sezioni di tessuto Conservare a -20 ° C fino a procedere con la colorazione e l'imaging.
5. La colorazione e imaging di Cervelletto Sezioni
- Preparare le seguenti soluzioni prima della colorazione dei tessuti:
~ 50 ml di PBS
~ 5-10 ml di PFA 4% in PBS
~ 10-20 ml di Triton X-100 0,5% siero asino, 10% in PBS - Sezioni cerebellari disgelo. È importante sottolineare che ridurre al minimo la loro esposizione a qualsiasi fonte di luce continua e intensa per evitare sbiadimento di EGFP.
- Con una penna barriera idrofobica, disegnare un rettangolo intorno alle sezioni di tessuto.
- Post-fissare le sezioni con 4% PFA per 5 min. Usi abbastanza liquido da coprire l'intera area delimitata dalla barriera idrofoba (di solito ~ 500 microlitri). Utilizzare un aspirapolvere o pipetta, rispostare il fissativo essere particolarmente attenti a non disturbare i sezioni di tessuto.
- Con una pipetta, applicare delicatamente PBS sul vetrino senza disturbare le sezioni di tessuto. Dopo 5 min utilizzare il vuoto o pipetta per rimuovere con attenzione il liquido. Ripetere la PBS sciacquare un totale di tre volte.
- Usando una pipetta, applicare con cura la diluizione appropriata di anticorpi primari (3 ml calbindin e / o anticorpi Nesprin2 per 900 ml di soluzione di) nello 0,5% Triton X-100, il 10% di siero asino in PBS. Incubare per un'ora a temperatura ambiente al buio.
Nota: EGFP-KASH2 sarà visibile mediante microscopia a fluorescenza diretta su sezioni congelate, e non è necessario utilizzare un anticorpo anti-EGFP. Tuttavia, se sono stati preparati sezioni di paraffina, l'imaging di EGFP-KASH2 richiede immunolocalizzazione con un anticorpo anti-EGFP. - Rimuovere la soluzione di anticorpi e risciacquare con PBS per tre volte.
- Preparare 1: 1.000 diluizioni di anticorpi secondari Alexa-Fluor in 0,5% Triton X-100,10% di siero asino in PBS e conservare al buio.
- Rimuovere delicatamente la PBS risciacquo finale e applicare la diluizione anticorpo secondario per un'ora al buio.
- Rimuovere la soluzione anticorpo secondario, sciacquare e lavare la sezione tre volte. Se necessario, applicare una colorazione nucleare, come DAPI (~ 300nm), durante la prima applicazione PBS.
- Rimuovere completamente la soluzione di PBS da tutto il tessuto e posto ~ 5-7 ml di mezzo di montaggio sulla sezione di tessuto. Collocare un vetrino di vetro sopra la sezione di tessuto e ritirate ~ 15-30 minuti a temperatura ambiente al buio.
- Utilizzare un microscopio a fluorescenza dotato i filtri appropriati per visualizzare EGFP e qualsiasi altre lunghezze d'onda appropriate per gli anticorpi secondari usati nelle fasi 5.8 / 5.9. A fette cerebellare, utilizzare un obiettivo 20X per visualizzare cerchi nucleari EGFP-KASH2.
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Representative Results
Questo protocollo illustra l'utilità del (/ EGFP-KASH2 CAG-LacZ) modello di topo Tg di limitare l'espressione EGFP-KASH2 alle cellule di Purkinje cerebellari utilizzando Tg (PCP2-Cre) topi. Nel Tg (PCP2Cre CAG-EGFP / KASH2) prole, la griglia di lettura aperta LacZ / V5 è asportato in P6 dalla ricombinasi Cre determinando così l'espressione di EGFP-KASH2 specificamente mirato al Purkinje cellule (Figura 2A). Come previsto, EGFP-KASH2 è rivolto a membrana nucleare come indicato dal modello bordo-come-EGFP positiva osservata attorno al nucleo (Figura 2B). Per massimizzare qualsiasi fenotipo fisiologico, è importante garantire che EGFP-KASH2 è espresso in una maggioranza di cellule bersaglio calcolando la percentuale di cellule positive EGFP-KASH2 che sono co-tinto con un marcatore specifico anticorpo-cellula. In questo esempio, l'espressione EGFP-KASH2 è stata rilevata in più del 70% delle cellule di Purkinje calbindin-positivi (Figura 2B). In questi Condizioni, non abbiamo osservato alcun significativo fenotipi istologici o comportamentali 10 mesi Tg (PCP2Cre CAG-EGFP / KASH2) topo 20. E 'importante assicurare che qualsiasi fenotipo morfologico o comportamentale non è dovuto alla espressione ectopica di EGFP-KASH2 in un tipo di cellula / tessuto non intenzionale. A tal proposito, EGFP-KASH2 non è stato osservato nello strato delle cellule granuli o strato molecolare di Tg (PCP2Cre CAG-EGFP-KASH2) cerebella (Figura 2B).
Infine, è fondamentale per confermare l'entità del LINC complesso perturbazione in cellule che esprimono EGFP-KASH2. Ciò può essere ottenuto utilizzando anticorpi anti-Nesprin alta qualità per enfatizzare il loro spostamento dalla NE di cellule che esprimono EGFP-KASH2. Come mostrato in figura 3, endogena Nesprin2 viene spostato dalla membrana nucleare di cellule di Purkinje che esprimono EGFP-KASH2 (Figura 3 pannello superiore, frecce gialle) mentre le cellule di Purkinje che non esprimono EGFP-KASH2 retain endogene Nesprin2 la busta nucleare (Figura 3 pannello superiore, freccia bianca). Come previsto, fratellini di controllo, che non esprimono Cre-ricombinasi, visualizzano Nesprin2 la busta nucleare di tutta la popolazione di cellule di Purkinje (Figura 3 frecce bianche in basso). Diversi studi hanno confermato l'espressione di EGFP-KASH2, accompagnato dallo spostamento di Nesprins endogene, in altri tessuti e tipi di cellule, come le fibre muscolari scheletriche e fotorecettori cono 19,21.
Figura 1. complessi LINC collegano il nucleo al citoscheletro e sono interrotti dalla sovraespressione di EGFP-KASH2. (A) Rappresentazione di complessi LINC che collegano l'interno del nucleo al citoscheletro citoplasmatica. Si noti che i domini SUN interagiscono promiscuamente con i domini KASHda tutti Nesprins (Nesprins 1-4). (B) sovraespressione di EGFP-KASH2 sposta Nesprins endogene dalla busta nucleare al pronto soccorso, in modo dominante negativo, scollegando così il nucleo del citoscheletro citoplasmatica circostante.
Figura 2. sovraespressione di EGFP-KASH2 specificamente mirati alle cellule di Purkinje cerebellari. (A) Allevamento di Tg (CAG-LacZ / EGFP-KASH2) a Tg (PCP2-Cre) Risultati in topi Tg (PCP2Cre CAG-EGFP-KASH2) prole in cui Cre ricombinasi è espresso in particolare in cellule di Purkinje cerebellari. Su espressione (P6), Cre ricombinasi trasloca nel nucleo dove accise il LacZ ORF e induce l'espressione EGFP-KASH2. (B) Tg (PCP2Cre CAG-EGFP-KASH2) topi specificatamente esprimere EGFP-KASH2 nelle cellule di Purkinje cerebellari IDENTIFied con calbindin (colorato in rosso). Si noti che entrambi i neuroni granulari del cervelletto e interneuroni dello strato molecolare sono negative per l'espressione di EGFP-KASH2. Abbreviazioni: MoL: strato molecolare, PCL: strato di cellule di Purkinje e GCL: strato di cellule granello.
Figura 3. Turbativa di complessi LINC endogeni nelle cellule di Purkinje cerebellari. Singolo piano confocale mostrando espressione di EGFP-KASH2 che spiazza Nesprin2 endogena (colorato in rosso) dalla busta nucleare delle cellule di Purkinje (frecce gialle in alto). Si noti che le cellule di Purkinje privi espressione EGFP-KASH2 mantengono endogeno Nesprin2 al loro involucro nucleare (freccia in alto bianco). Nel Tg (CAG-LacZ / EGFP-KASH2) controllo littermates, nessun segnale EGFP si osserva e Nesprin2 viene rilevata la busta nucleare del tutto Purki
Questo protocollo illustra l'utilità diil Tg (CAG-LacZ / EGFP-KASH2) modello di topo per limitare l'espressione EGFP-KASH2 alle cellule di Purkinje cerebellari utilizzando Tg (PCP2-Cre) topi. Nel Tg (PCP2Cre CAG-EGFP / KASH2) prole, la griglia di lettura aperta LacZ / V5 è asportato in P6 dalla ricombinasi Cre determinando così l'espressione di EGFP-KASH2 specificamente mirato al Purkinje cellule (Figura 2A). Come previsto, EGFP-KASH2 è rivolto a membrana nucleare come indicato dal modello bordo-come-EGFP positiva osservata attorno al nucleo (Figura 2B). Per massimizzare qualsiasi fenotipo fisiologico, è importante garantire che EGFP-KASH2 è espresso in una maggioranza di cellule bersaglio calcolando la percentuale di cellule positive EGFP-KASH2 che sono co-tinto con un marcatore specifico anticorpo-cellula. In questo esempio, l'espressione EGFP-KASH2 è stata rilevata in più del 70% delle cellule di Purkinje calbindin-positivi (Figura 2B). In queste condizioni, non abbiamo osservato alcun istologica significativa o behaviorafenotipi l su 10 mesi Tg (PCP2Cre CAG-EGFP / KASH2) topo 20. E 'importante assicurare che qualsiasi fenotipo morfologico o comportamentale non è dovuto alla espressione ectopica di EGFP-KASH2 in un tipo di cellula / tessuto non intenzionale. A tal proposito, EGFP-KASH2 non è stato osservato nello strato delle cellule granuli o strato molecolare di Tg (PCP2Cre CAG-EGFP-KASH2) cerebella (Figura 2B).
Infine, è fondamentale per confermare l'entità del LINC complesso perturbazione in cellule che esprimono EGFP-KASH2. Ciò può essere ottenuto utilizzando anticorpi anti-Nesprin alta qualità per enfatizzare il loro spostamento dalla NE di cellule che esprimono EGFP-KASH2. Come mostrato in figura 3, endogena Nesprin2 viene spostato dalla membrana nucleare di cellule di Purkinje che esprimono EGFP-KASH2 (Figura 3 pannello superiore, frecce gialle) mentre le cellule di Purkinje che non esprimono EGFP-KASH2 mantenere endogena Nesprin2 la busta nucleare (Figura 3 (Figura 3 frecce bianche in basso). Diversi studi hanno confermato l'espressione di EGFP-KASH2, accompagnato dallo spostamento di Nesprins endogene, in altri tessuti e tipi di cellule, come le fibre muscolari scheletriche e fotorecettori cono 19,21.
Figura 1. complessi LINC collegano il nucleo al citoscheletro e sono interrotti dalla sovraespressione di EGFP-KASH2. (A) Rappresentazione di complessi LINC che collegano l'interno del nucleo al citoscheletro citoplasmatica. Si noti che i domini SUN interagiscono promiscuamente con i domini KASH provenienti da tutto Nesprins (Nesprins 1-4). (B) o Sovraespressionef EGFP-KASH2 sposta Nesprins endogene dalla busta nucleare al pronto soccorso, in modo dominante negativo, scollegando così il nucleo del citoscheletro citoplasmatica circostante. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. sovraespressione di EGFP-KASH2 specificamente mirati alle cellule di Purkinje cerebellari. (A) Allevamento di Tg (CAG-LacZ / EGFP-KASH2) a Tg (PCP2-Cre) Risultati in topi Tg (PCP2Cre CAG-EGFP-KASH2) prole in cui Cre ricombinasi è espresso in particolare in cellule di Purkinje cerebellari. Su espressione (P6), Cre ricombinasi trasloca nel nucleo dove accise il LacZ ORF e induce l'espressione EGFP-KASH2. (B) Tg (PCP2Cre CAG-EGFP-KASH2) Topi specificatamente esprimere EGFP-KASH2 nelle cellule di Purkinje cerebellari identificati con calbindin (colorato in rosso). Si noti che entrambi i neuroni granulari del cervelletto e interneuroni dello strato molecolare sono negative per l'espressione di EGFP-KASH2. Abbreviazioni: MoL: strato molecolare, PCL: strato di cellule di Purkinje e GCL:. Strato di cellule granuli Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3. Turbativa di complessi LINC endogeni nelle cellule di Purkinje cerebellari. Singolo piano confocale mostrando espressione di EGFP-KASH2 che spiazza Nesprin2 endogena (colorato in rosso) dalla busta nucleare delle cellule di Purkinje (frecce gialle in alto). Si noti che le cellule di Purkinje privi espressione EGFP-KASH2 mantengono endogeno Nesprin2 al loro involucro nucleare (di Pentecostee freccia in alto). Nel Tg (CAG-LacZ / EGFP-KASH2) controllo littermates, nessun segnale EGFP si osserva e Nesprin2 viene rilevata la busta nucleare di tutte le cellule di Purkinje (frecce bianche in basso). Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
La fase più critica per studiare con successo il ruolo di complessi LINC in vivo utilizzando la (/ EGFP-KASH2 CAG-LacZ) modello Tg è quello di individuare una linea di topi Cre adatto (s). Infatti, se Cre è attiva in altri tipi di cellule coinvolte in percorsi simili, può complicare l'interpretazione dei risultati. Quindi, è importante esaminare cellule vicine, come mostrato qui negli strati cellulari e molecolari granuli del cervelletto (Figura 2B). Analogamente, per massimizzare eventuali fenotipi fisiologicamente rilevanti è importante identificare un ceppo con un'ampia espressione Cre Cre attraverso il tipo cellulare di interesse. È anche essenziale per intraprendere una caratterizzazione approfondita del pattern di espressione di componenti complessi LINC durante lo sviluppo del sistema di interesse. In effetti, uno svantaggio del (/ EGFP-KASH2 CAG-LacZ) modello di topo Tg è che non fornisce alcuna informazione su quali proteine Sun o varianti Nesprins sono coinvolti nel sistema biologico uconsiderazione nder. Tuttavia, questo problema può essere superato da intraprendere una caratterizzazione rigorosa sia a livelli di trascrizione e di proteine. In realtà, tali studi sono stati intrapresi in più occasioni che hanno portato a importanti scoperte sul ruolo di specifici componenti complessi LINC durante lo sviluppo del sistema nervoso centrale e l'omeostasi 21,22.
Infine, mentre questo protocollo è focalizzata sull'uso di tessuto cerebrale fissi, Tg (CAG-LacZ / EGFP-KASH2) topi può essere utilizzata per isolare e cellule primarie coltura per studiare l'effetto di interrompere complessi LINC in vitro. Utilizzando questo programma, è possibile isolare e purificare colture primarie di cellule EGFP-KASH2 positivi per applicazioni quali la microscopia time-lapse video. Ciò ignora l'efficienza di trasfezione bassi o produzione lentiviral richiesta per sistemi di coltura primari come i neuroni.
In sintesi, i Tg (/ EGFP-KASH2 CAG-LacZ) topi aprono possibilità nuove ed entusiasmanti per studiare il divertimentoction di complessi LINC in vivo durante i processi di sviluppo dei mammiferi embrionali e postnatali in una vasta gamma di tessuti e tipi di cellule per affrontare questioni fondamentali di biologia cellulare.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Gli autori ringraziano il personale del nucleo Morfologia e Imaging, del nucleo Genetica Molecolare (Dipartimento di Oftalmologia e Scienze Visive) e del mouse Genetica Nucleo presso la Washington University di St. Louis School of Medicine. Gli autori sono supportati dal piccolo programma di sovvenzioni dal Centro McDonnell per Cellulare e Neurobiologia Molecolare, il Centro Speranza per disordini neurologici, il National Eye Institute (# R01EY022632 a DH), un Istituto Nazionale di Eye Centro Nucleo Grant (# P30EY002687) e un sovvenzione illimitata di ricerca per prevenire la cecità al Dipartimento di Oftalmologia e Scienze Visive.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S0389 | |
| 10x PBS | Gibco | 14200-075 | |
| 16% Paraformaldehyde Solution | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| OCT Compound | Tissue-Tek | 4583 | |
| Adhesion Slides | StatLab | M1000W | |
| Donkey Serum | Sigma Aldrich | D9663 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T9284 | |
| ImmuEdge Pen | Vector Laboratories | H-4000 | |
| Anti-Calbindin Antibody | Sigma Aldrich | C9848 | |
| Anti-EGFP Antibody | Abcam | ab13970 | |
| Anti-Nesprin2 Antibody | Previously described in Ref. 21 | ||
| Fluorescent Mounting Media | Dako | S3023 | |
| 2-methyl butane | Sigma Aldrich | O3551 |
References
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