Introduction
核膜（NE）は、細胞質から核質を分離します。これは、核膜孔に接続し、内側と外側核膜（INMとそれぞれONM）で構成されています。両方の膜で区切らルーメンは核周辺領域（PNS）と呼ばれています。 ONMは、粗面小胞体（ER）を拡張したものであり、INMは核ラミナ、核A-で表さタイプ-Vの中間フィラメントおよびB型ラミン1,2の網目構造に準拠しています。細胞核の骨格と細胞骨格（LINC）複合体のリンカーは、物理的に細胞骨格フィラメントと分子モーター（ 図1A）に核の内部を接続するための全体の核エンベロープにまたがる高分子集合体です。日（SAD1 / Unc84）タンパク質とNesprins（核膜SPectRINS）：彼らは、NEの一体型膜貫通型タンパク質の2家族を特徴づける進化的に保存されたモチーフ間の相互作用で構成されています。哺乳類では、Sun1とSun2 ARN末端 核質地域INMの電子の膜貫通タンパク質は、A及びB型ラミン3-5と直接対話します。 INMの反対側には、PNS内、日タンパク質は、〜150のC末端アミノ酸の進化的に保存されたストレッチを抱い日ドメインと呼ばれます。日ドメインは、進化的に保存さKASH（Klarsicht / ANC-1、あれから相同性）ドメイン、Nesprinsの分子署名と直接対話。 KASHドメインは、膜貫通ドメイン6に続いて、PNS内に突出〜30のC末端アミノ酸のストレッチで構成されています。少なくとも4つの異なるNesprin遺伝子（Nesprin1-4）は、NE 7に局在KASH含有タンパク質をコードします。サイズ〜50kDa（Nesprin4）から驚くほどの千キロダルトン（Nesprin1巨人）に変わるNesprins、の細胞質領域は、複数のスペクトリンは、アクチン、プレクチンと分子モーター8のような細胞骨格成分との相互作用を可能にするだけでなく、特定のモチーフを繰り返し含ま13。
<脊椎動物と無脊椎動物のpクラス= "jove_content">研究は、ラミン/日/ Nesprin /分子モーターは、進化的に保存された「軸」の核移行と足場を制御を構成していることが示されています。 LINC複雑なコンポーネントのいくつかのノックアウト（KO）マウスモデルが記載され、哺乳類の発生9,14,15中のNEで太陽とNesprinタンパク質の役割を理解するためのフレームワークを提供することに尽力したされています。最も顕著なのが、本これらのモデルには、いくつかの重大な欠点、：細胞非自律的効果による表現型の解釈に1）困難、KASHレスNesprinは16アイソフォーム対KASH含有の表現型の貢献を区別するのに2）難易度、3）多数の細胞タイプで、NEで太陽とNesprinタンパク質の機能的冗長性は、両方のKASHドメインを欠損したマウス17内のすべてのSUN-KASH相互作用およびマウスの4）周産期致死性を不活性化するために、複雑な繁殖スキームが必要ですNesprins1と2は、大人の表現型18の分析を排除します。このプロトコルは、このように上記で概説した欠点の多くをバイパスして、細胞自律的かつ発生的に調節方法で、 生体内でのすべてのSUN-KASH相互作用を破壊するように設計された新規マウスモデルを記述しています。これのCre / LOXベースのマウスモデルは、2つの重要な概念に依存している：1）任意の公知Nesprinタンパク質のKASHドメインが細胞培養系内のNEにEGFPを標的とし、2）SUNドメインがの過剰発現、従って、KASHドメインと無差別に相互作用するのに十分です任意のKASHドメインは、すべての内因性日ドメインを飽和させ、ドミナントネガティブな方法17（ 図1B）にLINC複合体を不活性化します。このプロトコルは、小脳プルキンエ細胞内のすべてのSUN-KASHの相互作用の破壊を確認するために使用される組織の収穫と処理手順について説明します。
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Protocol
倫理声明：動物を対象とする手順は、セントルイスにあるワシントン大学の施設内動物管理使用委員会（IACUC）によって承認されました。
1.マウスの繁殖とジェノタイピング
- （PCP2Cre CAG-EGFP / KASH2）19,20のTgを生成するためのTg（CAG-LacZを/ EGFP-KASH2）Tgを有するマウス（PCP2-CRE）マウスを飼育。注：このプロトコルの残りは小脳内のプルキンエ細胞にEGFP-KASH2発現を制限するためのTg（PCP2-CRE）マウス系統の使用に焦点を当てているが、同様の手順は、他のTg（CRE）マウスで追跡することができます（ 図2A）。
- 以前に19を説明したように、両方のEGFPとのCre導入遺伝子を保有する子犬を識別するために、遺伝子型判定を行います。
解剖および組織収集のための材料の作製
- -20℃で30％のPBS中のスクロース（1×PBS、30gのスクロース/ 100ミリリットル）と店の100ミリリットルを準備します。組織Hの日transcardial灌流35 mlシリンジにarvesting、解凍およびショ糖液の負荷〜30〜35ミリリットル。
- PBS中の4％PFA（10ミリリットル、16％パラホルムアルデヒド、30 mlのPBS）の40ミリリットルを準備します。 transcardial灌流35 mlシリンジにロード〜30〜35ミリリットルの4％PFA。
- 組織切開のためにPBS 10mlで10cmの組織培養プレートを埋めます。
- 16 mg / mlのケタミンおよび3 mg / mlのキシラジンから成るケタミン/キシラジンのカクテルを用意します。
- 解剖のための70％エタノール溶液を調製します。
3.解剖と組織収集
- 1mlシリンジを使用して、体重25グラムあたりのケタミン/キシラジンのカクテルの500μLを注入し、15分〜を待ちます。あるいは、目的の生物学的システムに適した別の制度承認鎮静メソッドを使用します。
- 鎮静時に、そっとの背側と発泡スチロールのトレイ上のすべての足をピン、疼痛応答の欠如を確認するために、後部足を挟まマウスを下に向けて。
- 70％エタノールで腹部をスプレーし、心臓へのアクセスを得るために胸郭の上に下腹部から切開を行います。
- 心臓の右心房に小さな切開を行い、心臓の左心室に30％ショ糖溶液を含む注射器を挿入します。
- 〜2〜5ミリリットルあたり分の速度で溶液を灌流。ときに空のシリンジを除去し、4％PFA溶液で繰り返します。
- 発泡スチロールのトレイからマウスの固定を解除し、脳にアクセスするために首を切ります。
- ピンセットやハサミを用いて動物の頭の周りの皮膚を削除します。針で頭蓋骨の後部の穴を突く、慎重にはさみや解剖鉗子で頭蓋骨を削除します。
- 脳は明らかにアクセス可能になると、小脳を除去し、PBS中でそれを置くために鉗子を使用しています。メスで矢状面で小脳を二等分し、4℃で一晩、30％スクロース溶液に移します。注：準備へパラフィン切片は、組織が埋め込み、切片の前に4％PFA中で4℃で一晩小脳を修正しています。
4.組織処理とセクショニング
- ドライアイスのスラリーと2-メチルブタンを準備します。浴の温度を5分間平衡化させます。
- OCT化合物でcryomoldを記入し、金型に二分小脳の半分を置きます。
- 解剖顕微鏡とピンセット位置のペア（小脳の正中線に近い）二等分面が上を向いているように、小脳を使用。
- OCT化合物は、組織標本の周りの白色の固体マトリックスを形成されるまで5分間ドライアイススラリーにcryomoldを転送します。注：必要に応じて凍結標本は現在、-20℃で保存することができます。
- 組織切片を収集するために前処理されたポリリジンスライドにラベルを付け、Cereの15ミクロン切片を収集するために、製造業者の指示に従ってクライオスタットを準備bellum。セクションを収集するには、慎重にスライドのポリリジンコーティングした側を10月セクションにお問い合わせください。セクションの向きを維持するために、このステップの間にスライドを回転させないでください。
- -20℃で保存組織切片染色およびイメージングに進むまで。
5.染色および小脳切片のイメージング
- 組織染色の前に、以下のソリューションを準備します。
PBSの〜50ミリリットル
〜PBS中の4％PFA 5〜10mlの
〜PBS中0.5％トリトンX-100、10％ロバ血清の10-20 mlの - 小脳のセクションを解凍します。重要なことは、EGFPの退色を防止するために、連続した強い光の任意のソースへの露出を最小限に抑えることができます。
- 疎水性バリアペンを使用して、組織切片の周囲に四角形を描画します。
- 5分間、4％PFAでセクションをポスト修正。疎水性バリア（通常〜500μL）で区切ら領域全体をカバーするのに十分な液体を使用してください。真空またはピペットを使用して、再組織切片を乱さないように特に注意しながら固定液を移動します。
- ピペットを用いて、やさしく組織切片を乱すことなく、スライド上のPBSを適用します。 5分後、慎重に液体を除去するために真空またはピペットを使用しています。 PBSを繰り返して合計3回すすいでください。
- ピペットを使用して、慎重にPBS中0.5％トリトンX-100、10％ロバ血清中（溶液の900μLあたり3μlのカルビンジンおよび/またはNesprin2抗体）は、適切な一次抗体の希釈物を適用します。暗所で室温で1時間インキュベートします。
注：EGFP-KASH2は、凍結切片上の直接蛍光顕微鏡によって見えるようになり、それは抗EGFP抗体を利用する必要はありません。パラフィン切片を調製している場合は、EGFP-KASH2のイメージングは、抗EGFP抗体を用いた免疫検出を必要とします。 - 抗体溶液を除去し、PBSで3回すすいでください。
- 、0.5％トリトンX-100でアレクサ・フルーア二次抗体の希釈液千：1を準備します10％ロバ血清、PBS中、暗所で保管してください。
- 静かに最後のPBSリンスを削除し、暗所で1時間、二次抗体の希釈を適用します。
- 二次抗体溶液を除去し、セクションを3回洗浄し、洗浄してください。必要であれば、最初のPBS適用中に、このようなDAPIなどの核染色、（〜300nmの）を適用します。
- 完全組織と組織切片上でメディアをマウントする場所〜5-7μlの周りからのPBS溶液を除去。組織切片の上にカバーガラスを置き、暗所で室温〜15〜30分間のために確保さ。
- EGFPおよびステップ5.8 / 5.9で使用される二次抗体のための適切な任意の他の波長を可視化するために、適切なフィルターを備えた蛍光顕微鏡を使用してください。小脳切片では、EGFP-KASH2核リムを表示するには、20Xの対物レンズを使用しています。
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Representative Results
このプロトコルは、Tgは（PCP2-CRE）マウスを用いた小脳プルキンエ細胞にEGFP-KASH2発現を制限するためのTg（CAG-LacZを/ EGFP-KASH2）マウスモデルの有用性を示しています。 Tgは（PCP2Cre CAG-EGFP / KASH2）の子孫では、LacZを/ V5オープンリーディングフレームは、それによって特異的にプルキンエ細胞（ 図2A）を対象とし、EGFP-KASH2の発現を導くCreリコンビナーゼによってP6で切除されます。予想されたように核（ 図2B）を中心に観察EGFP陽性リム状のパターンによって示されるように、EGFP-KASH2は核膜を対象にしています。任意の生理学的な表現型を最大にするために、それは、EGFP-KASH2は、細胞特異的抗体マーカーで共染色されたEGFP-KASH2陽性細胞の割合を計算することにより、標的細胞の大部分で発現されることを保証することが重要です。この例では、EGFP-KASH2発現がカルビンジン陽性プルキンエ細胞（ 図2B）の70％以上で検出されました。これらのコンディでン、我々は、10ヶ月齢のTg（PCP2Cre CAG-EGFP / KASH2）マウス20内の任意の重要な組織学的または行動の表現型を観察しませんでした。これは、任意の形態学的または行動表現型が意図しない細胞型/組織におけるEGFP-KASH2の異所性発現によるものではないことを確認することが重要です。その点には、EGFP-KASH2は、顆粒細胞層またはTgが（PCP2Cre CAG-EGFP-KASH2）小脳（ 図2B）の分子層では観察されませんでした。
最後に、EGFP-KASH2を発現する細胞におけるLINC複雑な混乱の程度を確認することが重要です。これは、EGFP-KASH2を発現する細胞のNEからの変位を強調するために高品質の抗Nesprin抗体を用いて達成することができます。 図3に示すように 、内因性Nesprin2はEGFP-KASH2 RETAを発現しないプルキンエ細胞つつ、EGFP-KASH2（ 図3トップパネル、黄色の矢印）を発現プルキンエ細胞の核膜からずれています核膜に内因性Nesprin2（ 図3トップパネル、白矢印）です。予想されるように、Creをリコンビナーゼを発現しない対照同腹子は、全プルキンエ細胞集団（ 図3下部に白い矢印）の核膜でNesprin2を表示します。いくつかの報告は今、このような骨格筋線維と錐体光受容体19,21などの追加の組織および細胞型において、内因性Nesprinsの変位を伴って、EGFP-KASH2の発現が確認されました。
図1. LINC複合体は、細胞骨格に核を接続し、EGFP-KASH2の過剰発現によって破壊されている。細胞質細胞骨格に核の内部を接続するLINC複合体の（A）描写。日ドメインがKASHドメインと無差別に相互作用することに注意してくださいすべてNesprins（Nesprins 1-4）から。 EGFP-KASH2の（B）の過剰発現は、このように、周囲の細胞質の細胞骨格から核を切断し、ドミナントネガティブな様式で、ERに核膜から内因性Nesprinsを置換します。
Tgは（PCP2-CRE）Tgのマウスの結果（PCP2Cre CAG-EGFP-KASH2）子孫へのTg（CAG-LacZを/ EGFP-KASH2）のEGFP-KASH2の図2過剰発現は、特に小脳プルキンエ細胞を標的とする。（A）繁殖ここでCreリコンビナーゼは、小脳プルキンエ細胞に特異的に発現しています。式（P6）の際に、Creリコンビナーゼは、LacZのORFを切除し、EGFP-KASH2発現を誘導する核に移行。 （B）のTg（PCP2Cre CAG-EGFP-KASH2）マウスは、具体的には、小脳プルキンエ細胞identifにEGFP-KASH2を表現カルビンジンとIED（赤に着色）。分子層の両方の小脳顆粒ニューロンと介在はEGFP-KASH2の発現に関して陰性であることに注意してください。略語：MOL：分子層、PCL：プルキンエ細胞層とGCL：顆粒細胞層。
小脳プルキンエ細胞における内因性LINC複合体の図3.破壊。プルキンエ細胞（上の黄色の矢印）の核膜から（赤に着色）内因性Nesprin2を変位EGFP-KASH2の発現を示す単一の共焦点面。 EGFP-KASH2の発現を欠くプルキンエ細胞がその核エンベロープ（白矢印上）で内因性Nesprin2を維持することに注意してください。 Tgは（CAG-LacZを/ EGFP-KASH2）対照同腹子では、何のEGFPシグナルは観察されず、Nesprin2はすべてPurkiの核膜で検出されます
このプロトコルは、の有用性を示していますTgは（PCP2-CRE）マウスを用いた小脳プルキンエ細胞にEGFP-KASH2発現を制限するためのTg（CAG-LacZを/ EGFP-KASH2）マウスモデル。 Tgは（PCP2Cre CAG-EGFP / KASH2）の子孫では、LacZを/ V5オープンリーディングフレームは、それによって特異的にプルキンエ細胞（ 図2A）を対象とし、EGFP-KASH2の発現を導くCreリコンビナーゼによってP6で切除されます。予想されたように核（ 図2B）を中心に観察EGFP陽性リム状のパターンによって示されるように、EGFP-KASH2は核膜を対象にしています。任意の生理学的な表現型を最大にするために、それは、EGFP-KASH2は、細胞特異的抗体マーカーで共染色されたEGFP-KASH2陽性細胞の割合を計算することにより、標的細胞の大部分で発現されることを保証することが重要です。この例では、EGFP-KASH2発現がカルビンジン陽性プルキンエ細胞（ 図2B）の70％以上で検出されました。これらの条件では、我々はすべての重要な組織学的またはbehavioraは観察されませんでした10ヶ月齢のTg（PCP2Cre CAG-EGFP / KASH2）マウス20リットルの表現型。これは、任意の形態学的または行動表現型が意図しない細胞型/組織におけるEGFP-KASH2の異所性発現によるものではないことを確認することが重要です。その点には、EGFP-KASH2は、顆粒細胞層またはTgが（PCP2Cre CAG-EGFP-KASH2）小脳（ 図2B）の分子層では観察されませんでした。
最後に、EGFP-KASH2を発現する細胞におけるLINC複雑な混乱の程度を確認することが重要です。これは、EGFP-KASH2を発現する細胞のNEからの変位を強調するために高品質の抗Nesprin抗体を用いて達成することができます。 図3に示すように 、内因性Nesprin2はEGFP-KASH2が核エンベロープで内因性Nesprin2を保持発現しないプルキンエ細胞つつ、EGFP-KASH2（ 図3トップパネル、黄色の矢印）を発現プルキンエ細胞の核膜（ 図からずれています3 図3下部に白い矢印）の核膜でNesprin2を表示します。いくつかの報告は今、このような骨格筋線維と錐体光受容体19,21などの追加の組織および細胞型において、内因性Nesprinsの変位を伴って、EGFP-KASH2の発現が確認されました。
図1. LINC複合体は、細胞骨格に核を接続し、EGFP-KASH2の過剰発現によって破壊されている。細胞質細胞骨格に核の内部を接続するLINC複合体の（A）描写。日ドメインはすべてNesprins（Nesprins 1-4）からKASHドメインと無差別に相互作用することに注意してください。 （B）の過剰発現OF EGFP-KASH2は、このように、周囲の細胞質の細胞骨格から核を切断、ドミナントネガティブな様式で、ERに核膜から内因性Nesprinsを変位させる。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
Tgは（PCP2-CRE）Tgのマウスの結果（PCP2Cre CAG-EGFP-KASH2）子孫へのTg（CAG-LacZを/ EGFP-KASH2）のEGFP-KASH2の図2過剰発現は、特に小脳プルキンエ細胞を標的とする。（A）繁殖ここでCreリコンビナーゼは、小脳プルキンエ細胞に特異的に発現しています。式（P6）の際に、Creリコンビナーゼは、LacZのORFを切除し、EGFP-KASH2発現を誘導する核に移行。 （B）のTg（PCP2Cre CAG-EGFP-KASH2）マウスは、具体的には赤に着色カルビンジン（）で識別小脳プルキンエ細胞にEGFP-KASH2を発現します。分子層の両方の小脳顆粒ニューロンと介在はEGFP-KASH2の発現に関して陰性であることに注意してください。略語：MOL：分子層、PCL：プルキンエ細胞層とGCL：顆粒細胞層は、 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
小脳プルキンエ細胞における内因性LINC複合体の図3.破壊。プルキンエ細胞（上の黄色の矢印）の核膜から（赤に着色）内因性Nesprin2を変位EGFP-KASH2の発現を示す単一の共焦点面。 EGFP-KASH2の発現を欠くプルキンエ細胞が核エンベロープで内因性Nesprin2を維持することに注意してください（聖霊降臨祭電子矢印上）。 Tgは（CAG-LacZを/ EGFP-KASH2）対照同腹子では、何のEGFPシグナルが観察されないとNesprin2はすべてのプルキンエ細胞（白矢印下）の核膜で検出される。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
正常のTg（CAG-のLacZ / EGFP-KASH2）モデルを用いてインビボで LINC複合体の役割を研究するための最も重要なステップは、適切なのCreマウス系統を同定することです。 Creが同様の経路に関与する他の細胞型で活性であれば確かに、それは結果の解釈を複雑にすることができます。小脳（ 図2B）の分子および顆粒細胞層にここに示されるように、したがって、それは、近隣の細胞を調べることが重要です。同様に、任意の生理学的に関連する表現型を最大化するためには、目的の細胞型を横切る広範Cre発現とのCre株を同定することが重要です。これは、目的のシステムの開発時にLINC複雑なコンポーネントの発現パターンの詳細な特性評価を行うことも重要です。実際、Tgは（CAG-LacZを/ EGFP-KASH2）マウスモデルの欠点の1つは、Sunタンパク質またはNesprins変異体は、生物学的システムに関与しているためにどのように任意の情報を提供しないということであるUファインダーの考慮。しかし、この問題は、両方の転写物およびタンパク質レベルでの厳密な特性評価を実施することによって克服することができます。実際には、このような研究は、CNSの開発と恒常性21,22の間に特定のLINC複雑なコンポーネントの役割についての重要な発見につながったいくつかの場面で行われています。
このプロトコルは、固定されたCNS組織の使用に焦点を当てている間に最後に、Tgは（CAG-のLacZ / EGFP-KASH2）マウスは 、in vitroでLINC複合体を破壊する効果を研究するために一次細胞を単離し、培養するために使用することができます。このスキームを使用して、このようなタイムラプスビデオ顕微鏡検査などのアプリケーションのためにEGFP-KASH2陽性細胞の初代培養物の単離及び精製することが可能です。これは、ニューロンなどの低トランスフェクション効率または一次培養システムに必要なレンチウイルスの生産を、バイパスします。
要約すると、Tgは（CAG-LacZを/ EGFP-KASH2）マウスは楽しみを研究する新しいエキサイティングな可能性を開きます基本的な細胞生物学の質問に対処するための組織および細胞型の多種多様な胚および出生後の哺乳動物の発生過程中にin vivoでの LINC複合体のction。
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Disclosures
著者らは、開示することは何もありません。
Acknowledgments
著者らは、分子遺伝学のコア（眼科およびVisual科学科）の医学のセントルイス校のワシントン大学でマウス遺伝学コアの形態とイメージングコアのスタッフに、感謝します。作者は、携帯用のマクドネルセンター分子神経生物学、神経疾患のためのホープセンターから小規模助成プログラムでサポートされている、国立眼研究所（DHへ＃R01EY022632）、国立眼研究所センターコアグラント（＃1 P30EY002687）と眼科およびVisual科学科に失明を防止するための研究から無制限の助成金。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S0389 | |
| 10x PBS | Gibco | 14200-075 | |
| 16% Paraformaldehyde Solution | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| OCT Compound | Tissue-Tek | 4583 | |
| Adhesion Slides | StatLab | M1000W | |
| Donkey Serum | Sigma Aldrich | D9663 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T9284 | |
| ImmuEdge Pen | Vector Laboratories | H-4000 | |
| Anti-Calbindin Antibody | Sigma Aldrich | C9848 | |
| Anti-EGFP Antibody | Abcam | ab13970 | |
| Anti-Nesprin2 Antibody | Previously described in Ref. 21 | ||
| Fluorescent Mounting Media | Dako | S3023 | |
| 2-methyl butane | Sigma Aldrich | O3551 |
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