Introduction
핵 봉투 (NE)는 세포질에서 핵질을 분리한다. 그것은 핵 구멍에 연결하는 내부 및 외부 핵 막 (INM 각각 ONM)로 구성되어있다. 모두 멤브레인로 구분 루멘은 핵 주변 공간 (PNS)라고합니다. ONM 러프 소포체 (ER)의 연장이고, INM 핵 박판에 부착, A- 및 B 형으로 표현 핵-V 형 중간 필라멘트 그물 세공은 1,2 라민. Nucleoskeleton 및 세포 뼈대 (LINC) 복합체의 링커는 물리적 골격 필라멘트 및 분자 모터 (그림 1A)에 핵의 내부를 연결하는 전체 핵 봉투에 걸쳐 거대 분자 어셈블리입니다. 일 (SAD1 / Unc84) 단백질과 Nesprins (핵 봉투 SPectRINS) : 그들은 NE의 통합 횡단 단백질의 두 가족의 특성을 진화 적으로 보존 모티브 사이의 상호 작용으로 구성되어 있습니다. 포유 동물에서, Sun1 Sun2에 ARN 말단 영역 nucleoplasmic A- 및 B 형 라민 3-5와 직접 상호 작용 INM의 E 막 횡단 단백질. PNS 내 INM의 다른 측면에서, 썬 단백질은 150 C- 말단 아미노산이 태양 도메인이라고 ~의 진화 - 보존 스트레칭 항구. SUN 도메인은 진화 - 보존 KASH와 직접 상호 작용 (Klarsicht / ANC-1, 영신의 인사 상동) 도메인, Nesprins의 분자 서명. KASH 도메인은 막 횡단 도메인 (6) 다음에 PNS 내로 돌출 ~ 30 C 말단 아미노산 스트레치로 구성된다. 적어도 네 가지 Nesprin 유전자 (Nesprin1-4)는 NE 7에서 지역화 단백질을 KASH 함유 인코딩. 놀라운 1,000 kDa의 (Nesprin1 거인)에 크기가 달라질 ~ 50kDa (Nesprin4)에서 Nesprins의 세포질 영역은 여러 스펙 트린은 액틴, plectin 및 분자 모터 8과 같은 세포 골격의 구성 요소와 상호 작용을 가능하게 반복뿐만 아니라 특정 주제 포함 (13).
<척추 동물과 무척추 동물의 P 클래스 = "jove_content"> 연구 라민 / 일 / Nesprin / 분자 모터는 진화 적으로 보존 된 "축"핵 이동과 고정을 제어를 구성하는 것으로 나타났습니다. LINC 복잡한 구성 요소의 여러 녹아웃 (KO) 마우스 모델을 설명하고 포유류의 개발 9,14,15시 (NE)에서 태양과 Nesprin 단백질의 역할을 이해하는 프레임 워크를 제공하는 수단이되었다되고있다. 그러나, 이러한 모델 특히 현재 몇 가지 중요한 단점 :의 표현형 기여 구별 비 자치 효과, 2) 어려움을 세포에 의한 표현형 해석 1) 어려움 KASH없는 Nesprin 대 KASH이 함유, 3) 16 이소 폼 다양한 세포 유형의 NE에서 태양과 Nesprin 단백질의 기능 중복은 모두의 KASH 도메인에 대한 결핍 마우스 (17)의 모든 SUN-KASH 상호 작용과 마우스의 4) 주 산기 치사를 비활성화하는 복잡한 번식 체계를 필요Nesprins1 2는 성인의 분석 18 표현형을 배제한다.이 프로토콜은 따라서 위에서 설명한 단점이 많은 우회, 셀 자율과 발달 규제 방식으로 생체 내에서 모든 Sun-KASH 상호 작용을 방해하기 위해 설계된 새로운 마우스 모델에 대해 설명합니다. 이는 Cre 호텔 / LOX 계 마우스 모델은 두 개의 중요한 개념에 의존한다 : 1) 공지 Nesprin 단백질 KASH 도메인은 세포 배양 시스템에서 NE에 EGFP 타겟팅 및 2) 일 도메인이 과발현 따라서 KASH 도메인으로 이것은 무작위 상호 작용하기에 충분한 어떤 KASH 도메인은 모든 내생 일 도메인을 포화과 지배적 인 음성 방식 (17) (그림 1B)에 LINC 복합체를 비활성화합니다. 이 프로토콜은 조직 수확 및 소뇌 조롱박 세포의 모든 SUN-KASH 상호 작용의 중단을 확인하는 데 사용 처리 단계를 설명합니다.
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Protocol
윤리 문 : 동물 주제와 관련된 절차는 세인트 루이스의 워싱턴 대학에서 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 승인되었다.
1. 마우스 사육 및 유전자형
- (PCP2Cre CAG-EGFP / KASH2) 19, 20, Tg는 생산의 Tg (CAG-LacZ를 / EGFP-KASH2)의 Tg와 마우스 (PCP2-Cre 호텔) 쥐 새끼를 낳. 주 :이 프로토콜의 나머지는 소뇌 내 조롱박 세포 EGFP-KASH2 발현을 제한의 Tg (PCP2-Cre 호텔) 마우스 라인의 사용에 초점을 맞추고 있지만, 유사한 절차가 다른 Tg는 (Cre 호텔) 마우스 수 미행 ( 도 2A).
- 이전 19 설명 된대로 모두 EGFP와 Cre 호텔 유전자를 품고 새끼를 식별하는 유전자형을 수행합니다.
해부 및 조직 컬렉션 재료 2. 준비
- -20 ℃에서 30 %의 수크로오스 PBS (PBS 1X 중 자당 30g / 100 mL) 및 점포 100 ㎖를 준비한다. 조직 (H)의 일transcardial 관류에 대한 35 ML의 주사기에 arvesting, 해동 및 자당 용액의 부하 ~ 30 ~ 35 ml의.
- PBS로 4 % PFA, 40 ㎖ (10 ㎖, 16 % 파라 포름 알데히드 및 PBS 30 ㎖)을 준비한다. transcardial 관류에 대한 35 ML의 주사기에로드 ~ 30 ~ 35 ml의 4 % PFA.
- 조직의 절개에 대한 PBS의 10 ㎖로 10cm 조직 배양 판을 채 웁니다.
- 16 ㎎ / ㎖ 케타민 3 ㎎ / ㎖ 자일 라진 구성된 케타민 / 자일 라진 칵테일을 준비합니다.
- 해부에 대한 70 % 에탄올 용액을 준비합니다.
3. 해부 및 조직 컬렉션
- 1 ML의 주사기를 사용하여, 체중 25g 당 케타민 / 자일 라진 칵테일 500 μl를 주입하고 15 분 ~ 기다립니다. 대안 적으로, 관심있는 생물학적 시스템에 적합한 다른 제도적 승인 진정 방법을 사용한다.
- 진정되면, 부드럽게의 등쪽면 스티로폼 트레이에 모든 발 핀, 통증 반응의 부족을 확인하기 위해 후면 발을 꼬집어마우스를 아래로 향하게.
- 70 % 에탄올로 복부를 스프레이하고 마음에 액세스 할 흉곽의 상단에 하복부에서 절개를합니다.
- 심장의 우심방의 작은 절개를 확인하고 심장의 좌심실에 30 % 자당 용액이 들어있는 주사기를 삽입합니다.
- ~ 2-5 ml의 당 분의 속도로 용액을 관류. 비어있는 경우, 주사기를 제거하고 4 % PFA 용액으로 반복한다.
- 스티로폼 트레이에서 마우스를 고정 해제 뇌에 액세스하기 위해 목을 벨.
- 집게와 가위를 사용하여 동물의 머리 주위 피부를 제거합니다. 바늘로 두개골의 뒤쪽 부분에 구멍을 찌를 조심스럽게 가위 해부 집게와 두개골을 제거합니다.
- 뇌가 명확하게 접근하면, 소뇌를 제거하고 PBS에 배치하는 집게를 사용합니다. 메스와 시상면에서 소뇌를 양분하고 4 ℃에서 하룻밤 30 % 자당 용액에 전송할 수 있습니다. 참고 : 수험하기파라핀 섹션입니다 전에 조직 매립 및 단면에 4 % PFA 4 ° C에서 하룻밤 소뇌를 해결.
4. 조직 가공 및 단면
- 드라이 아이스, 2- 메틸 부탄의 슬러리를 조제. 욕조의 온도가 5 분 동안 평형을 허용합니다.
- 10월 화합물과 cryomold를 입력하고 금형에 이분 소뇌의 절반을 배치합니다.
- 해부 현미경과 집게 위치의 쌍 (소뇌의 중간 선 부근) 이분 된면이 위를 향하도록 소뇌 사용.
- OCT의 화합물은 조직 표본 주위 백색 고체 매트릭스를 형성 할 때까지 5 분 동안 드라이 아이스 슬러리에 cryomold 옮긴다. 주의 : 필요하다면 냉동 시험편 지금 -20 ℃에서 저장 될 수있다.
- 라벨 세르 15 μm의 단면을 수집하기 위해 제조자의 지시에 따라 조직 절편을 수집하기위한 폴리 리신 슬라이드를 처리 및 저온 장치가 미리 준비찾. 섹션을 수집하려면, 조심스럽게 슬라이드의 폴리 라이신 코팅 된면이 OCT의 섹션을 문의하십시오. 섹션의 방향을 유지하기 위해,이 단계에서 슬라이드를 회전하지 않습니다.
- 염색 및 이미징을 진행하기까지 -20 ° C에서 보관 조직 섹션.
5. 염색과 소뇌 섹션의 이미지
- 조직 염색하기 전에 다음과 같은 솔루션을 준비 :
PBS의 ~ 50 ㎖
~ PBS에서 4 % PFA의 5 ~ 10 ml의
~ PBS에서 0.5 % 트리톤 X-100, 10 % 당나귀 혈청의 10 ~ 20 ml의 - 해동 소뇌 부분. 중요한 것은, EGFP의 퇴색을 방지하기 위해 지속적이고 강렬한 빛의 소스에 노출을 최소화 할 수 있습니다.
- 소수성 장벽 펜을 사용하여 조직 섹션 주위에 사각형을 그립니다.
- 5 분 동안 4 % PFA와 섹션을 포스트 - 수정. 소수성 장벽 (보통 ~ 500 μL)로 구분 전체 영역을 커버하기에 충분한 액체를 사용합니다. 진공 또는 피펫을 다시 사용정착은 조직 절편을 방해하지 않도록 특히주의하면서 이동합니다.
- 피펫으로 부드럽게 조직 섹션을 방해하지 않고 슬라이드에 PBS를 적용합니다. 5 분 후 조심스럽게 액체를 제거하기 위해 진공 또는 피펫을 사용합니다. PBS가 3 회 반복하여 총 린스.
- 피펫을 사용하여 조심스럽게 PBS에서 0.5 % 트리톤 X-100, 10 % 당나귀 혈청 (솔루션의 900 μL 당 3 μL Calbindin 및 / 또는 Nesprin2 항체) 적절한 일차 항체의 희석을 적용합니다. 어둠 속에서 실온에서 1 시간 동안 배양한다.
주 : EGFP-KASH2은 동결 절편에 직접 형광 현미경으로 볼 수 있으며이 항 EGFP 항체를 이용할 필요가 없다. 파라핀 섹션이 준비되어있는 경우, EGFP-KASH2의 영상은 반 EGFP 항체와 면역을 필요로한다. - 항체 용액을 제거하고 PBS로 3 회 씻어.
- 제조 1 : 0.5 % 트리톤 X-100-알렉사 형석 이차 항체 1,000 희석액,어둠 속에서 10 % 당나귀 PBS에서 혈청 및 저장.
- 조심스럽게 최종 PBS 린스를 제거하고 어둠 속에서 한 시간 동안 차 항체 희석을 적용합니다.
- 이차 항체 용액을 제거 씻어 절을 세 번 씻는다. 필요한 경우, 제 PBS의인가 등 DAPI (~ 300 ㎚) 등의 핵 염색을 적용한다.
- 완전히 조직과 조직 섹션에 미디어를 장착 장소 ~ 5-7 μL 각국에서 PBS 용액을 제거합니다. 조직 절편 위에 유리 커버 슬립을 놓고 어둠 속에서 실온에서 ~ 15-30 분간 방치.
- EGFP와 같이 5.8 / 5.9에서 사용 된 이차 항체에 적합한 임의의 다른 파장을 시각화하는 적절한 필터를 갖춘 형광 현미경을 사용한다. 소뇌 조각에서 EGFP-KASH2 핵 림을 보려면 20 배 목표를 사용합니다.
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Representative Results
이 프로토콜의 Tg (PCP2-Cre 호텔) 생쥐를 사용 소뇌 조롱박 세포 EGFP-KASH2 발현을 제한 (TG-LacZ를 CAG / EGFP-KASH2) 마우스 모델의 유용성을 도시한다. Tg가에서 (PCP2Cre CAG-EGFP / KASH2) 자손, LacZ를 / V5 오픈 리딩 프레임함으로써 특히 조롱박 세포 (그림 2A)를 대상으로 EGFP-KASH2의 발현을 유도하는 Cre 호텔 재조합 효소에 의해 P6에서 절제되어있다. 예상대로 핵 (그림 2B)의 주위에 관찰 EGFP 양성 림 같은 패턴에 의해 지시 된 바와 같이, EGFP-KASH2은 핵 봉투를 대상으로한다. 임의의 생리 학적 표현형을 극대화하기 위해서는 세포 - 특이 적 항체 마커와 공동 - 염색 KASH2 EGFP 양성 세포의 비율을 계산하여 그 EGFP-KASH2 타겟 세포의 과반수에 표현되어 있는지 확인하는 것이 중요하다. 이 예에서는 EGFP-KASH2 식 Calbindin 조롱박 양성 세포 (도 2B)의 70 % 이상에서 검출 하였다. 이 콘돌리자에서TIONS, 우리 10 개월의 Tg (PCP2Cre CAG-EGFP / KASH2) 마우스 (20)에 상당한 조직 학적 또는 행동 표현형을 관찰하지 않았다. 그것은 어떤 형태 학적 표현형 또는 행동 의도 세포 유형 / 조직 EGFP-KASH2의 이소성 발현에 기인없는 것이 중요하다. 그 점에, EGFP-KASH2는 과립 세포 층 또는 Tg는 (PCP2Cre CAG-EGFP-KASH2) 소뇌 (그림 2B)의 분자 층에서 관찰되지 않았다.
마지막으로, EGFP-KASH2을 발현하는 세포의 LINC 복잡한 장애의 정도를 확인하는 것이 중요하다. 이것은 EGFP-KASH2을 발현하는 세포의 NE로부터 그들의 변위를 강조하기 위해 고품질 안티 Nesprin 항체를 사용하여 달성 될 수있다. 그림 3에 나타낸 바와 같이 조롱박 세포 EGFP-KASH2의 RETA을 표현하지 않는 반면, 내생 Nesprin2은 EGFP-KASH2을 표현 조롱박 세포의 핵 봉투 (그림 3 상단 패널, 노란색 화살표)에서 변위핵 봉투에서 내인성 Nesprin2 (그림 3 상단 패널, 흰색 화살표)에서. 예상대로, Cre 호텔 - 재조합 효소를 발현하지 않는 제어 한배 새끼는 전체 조롱박 세포 인구 (그림 3 하단 흰색 화살표)의 핵 봉투에 Nesprin2를 표시합니다. 몇몇 보고서 해주기 골격근 섬유 콘 감광체 (19, 21)에 따라 추가 조직 및 세포 유형에서 내인성 Nesprins의 변위를 수반 EGFP-KASH2의 발현을 확인 하였다.
도 1 LINC 착물은 세포 골격에 핵을 연결하고 EGFP-KASH2의 과발현에 의해 파괴된다. 세포질 세포 골격에 핵의 내부를 연결 LINC 복합체 (A) 묘사. 일 도메인이 KASH 도메인으로 이것은 무작위 상호 작용합니다모든 Nesprins에서 (Nesprins 1-4). EGFP-KASH2의 (B) 과발현 따라서 주변의 세포질 세포 골격에서 핵을 분리, 지배적 인 부정적인 방식으로, 응급실에 핵 봉투에서 내생 Nesprins 변위.
Tg는 (PCP2-Cre 호텔)의 Tg 마우스 결과 (PCP2Cre CAG-EGFP-KASH2) 자손의 Tg (CAG-LacZ를 / EGFP-KASH2)의 EGFP-KASH2 그림 2. 과발현은 특히 소뇌 조롱박 세포를 대상으로. (A) 사육 하는 Cre 호텔 재조합 효소는 소뇌 조롱박 세포에서 구체적으로 표현된다. 식 (P6)에, 재조합 효소 Cre 호텔은 LacZ를 ORF를 소비세와 EGFP-KASH2 발현을 유도하는 핵으로 전위 시키며. (B)의 Tg (PCP2Cre CAG-EGFP-KASH2) 마우스는 특히 소뇌 조롱박 세포 IDENTIF에서 EGFP-KASH2을 표현Calbindin와 IED (붉은 색). 분자 층의 두 소뇌 과립 뉴런과의 interneurons는 EGFP-KASH2 식에 대한 부정적인합니다. 요약 : 노동부 : 분자 층, PCL : 조롱박 세포 층과 GCL : 과립 세포층.
그림 소뇌 조롱박 세포에서 내생 LINC 복합체의 3 중단. EGFP-KASH2의 단일 공 초점 평면 보여주는 표현 조롱박 세포의 핵막에서 (붉은 색) 내생 Nesprin2 (상단 노란색 화살표)를 변위. EGFP-KASH2 식을 결여 조롱박 세포는 핵 봉투에서 내인성 Nesprin2 (흰색 화살표 상단)을 유지합니다. Tg는 (CAG-LacZ를 / EGFP-KASH2) 제어 한배 새끼에서 더 EGFP 신호가 관찰되지 않고 Nesprin2 모든 Purki의 핵 봉투에서 검출
이 프로토콜의 유용성을 도시Tg는 (CAG-LacZ를 / EGFP-KASH2) 마우스 모델의 Tg (PCP2-Cre 호텔) 마우스를 사용하여 소뇌 조롱박 세포에 EGFP-KASH2 식을 제한 할 수 있습니다. Tg가에서 (PCP2Cre CAG-EGFP / KASH2) 자손, LacZ를 / V5 오픈 리딩 프레임함으로써 특히 조롱박 세포 (그림 2A)를 대상으로 EGFP-KASH2의 발현을 유도하는 Cre 호텔 재조합 효소에 의해 P6에서 절제되어있다. 예상대로 핵 (그림 2B)의 주위에 관찰 EGFP 양성 림 같은 패턴에 의해 지시 된 바와 같이, EGFP-KASH2은 핵 봉투를 대상으로한다. 임의의 생리 학적 표현형을 극대화하기 위해서는 세포 - 특이 적 항체 마커와 공동 - 염색 KASH2 EGFP 양성 세포의 비율을 계산하여 그 EGFP-KASH2 타겟 세포의 과반수에 표현되어 있는지 확인하는 것이 중요하다. 이 예에서는 EGFP-KASH2 식 Calbindin 조롱박 양성 세포 (도 2B)의 70 % 이상에서 검출 하였다. 이러한 조건에서 우리는 어떤 중요한 조직 학적 또는 behaviora을 준수하지 않았다10개월 된 Tg는 (PCP2Cre CAG-EGFP / KASH2) 마우스 (20)의 L 표현형. 그것은 어떤 형태 학적 표현형 또는 행동 의도 세포 유형 / 조직 EGFP-KASH2의 이소성 발현에 기인없는 것이 중요하다. 그 점에, EGFP-KASH2는 과립 세포 층 또는 Tg는 (PCP2Cre CAG-EGFP-KASH2) 소뇌 (그림 2B)의 분자 층에서 관찰되지 않았다.
마지막으로, EGFP-KASH2을 발현하는 세포의 LINC 복잡한 장애의 정도를 확인하는 것이 중요하다. 이것은 EGFP-KASH2을 발현하는 세포의 NE로부터 그들의 변위를 강조하기 위해 고품질 안티 Nesprin 항체를 사용하여 달성 될 수있다. 그림 3에 나타낸 바와 같이, 내생 Nesprin2은 EGFP-KASH2을 표현 조롱박 세포의 핵 봉투 (그림 3 상단 패널, 노란색 화살표)에서 변위 EGFP-KASH2 핵 봉투에서 내생 Nesprin2을 유지 표현하지 않는 조롱박 세포 (그림 동안 3 (그림 3 하단 흰색 화살표)의 핵 봉투에 Nesprin2를 표시합니다. 몇몇 보고서 해주기 골격근 섬유 콘 감광체 (19, 21)에 따라 추가 조직 및 세포 유형에서 내인성 Nesprins의 변위를 수반 EGFP-KASH2의 발현을 확인 하였다.
도 1 LINC 착물은 세포 골격에 핵을 연결하고 EGFP-KASH2의 과발현에 의해 파괴된다. 세포질 세포 골격에 핵의 내부를 연결 LINC 복합체 (A) 묘사. 그 일 도메인이 모든 Nesprins (Nesprins 1-4)에서 KASH 도메인으로 이것은 무작위 상호 작용합니다. (B) 과발현 OF EGFP-KASH2 따라서 주변 세포질 세포 골격에서 핵을 분리, 지배적 인 부정적인 방식으로, 응급실에 핵 봉투에서 내생 Nesprins 변위. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Tg는 (PCP2-Cre 호텔)의 Tg 마우스 결과 (PCP2Cre CAG-EGFP-KASH2) 자손의 Tg (CAG-LacZ를 / EGFP-KASH2)의 EGFP-KASH2 그림 2. 과발현은 특히 소뇌 조롱박 세포를 대상으로. (A) 사육 하는 Cre 호텔 재조합 효소는 소뇌 조롱박 세포에서 구체적으로 표현된다. 식 (P6)에, 재조합 효소 Cre 호텔은 LacZ를 ORF를 소비세와 EGFP-KASH2 발현을 유도하는 핵으로 전위 시키며. (B)의 Tg (PCP2Cre CAG-EGFP-KASH2) 특별히 Calbindin 식별 소뇌 조롱박 세포에서 EGFP-KASH2을 표현 마우스 ()가 빨간색으로 색깔. 분자 층의 두 소뇌 과립 뉴런과의 interneurons는 EGFP-KASH2 식에 대한 부정적인합니다. 요약 : 노동부 : 분자 층, PCL : 조롱박 세포 층과 GCL :. 과립 세포 층 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 소뇌 조롱박 세포에서 내생 LINC 복합체의 3 중단. EGFP-KASH2의 단일 공 초점 평면 보여주는 표현 조롱박 세포의 핵막에서 (붉은 색) 내생 Nesprin2 (상단 노란색 화살표)를 변위. EGFP-KASH2 식을 결여 조롱박 세포는 핵 봉투에서 내생 Nesprin2을 유지하는 것이 (오순절주의E) 상단 화살표. Tg는 (CAG-LacZ를 / EGFP-KASH2) 제어 한배 새끼에서 더 EGFP 신호가 관찰되지 않고 Nesprin2 모든 조롱박 세포 (흰색 화살표 아래)의 핵 봉투에서 검출된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
가장 중요한 단계는 성공적으로의 Tg (CAG-LacZ를 / EGFP-KASH2) 모델이 적합 Cre 호텔 마우스 라인 (들)을 식별하는 것입니다 사용하여 생체 내에서 LINC 복합체의 역할을 연구합니다. Cre 호텔 유사한 경로에 관여하는 다른 세포 유형에서 활성 상태 인 경우 사실, 그것은 결과의 해석을 복잡하게 할 수 있습니다. 소뇌 (도 2B)의 분자량 및 과립 세포층 여기에 도시 된 바와 같이, 따라서, 이것은, 주변 셀을 검사하는 것이 중요하다. 마찬가지로, 임의의 생리 학적으로 관련된 표현형을 최대화하는 것이 관심의 세포 유형에 걸쳐 광범위 Cre 호텔 식 Cre 호텔 균주를 파악하는 것이 중요하다. 이는 관심의 시스템의 개발시 LINC 복합체 성분의 발현 패턴의 충분히 특성화를 수행하는 것도 중요하다. 실제로, (TG-LacZ를 CAG / EGFP-KASH2) 마우스 모델의 한가지 단점은 일 Nesprins 단백질 또는 변이체는 생물학적 체계에 관여 할로 어떤 정보도 제공하지 않는다는 것이다 U파인더 고려. 그러나이 문제는 모두 성적 증명서 및 단백질 수준에서 엄격한 특성을 착수에 의해 극복 될 수있다. 사실, 이러한 연구는 중추 신경계 개발 과정에서 특정 LINC 복잡한 구성 요소의 역할에 대한 중요한 연구 결과로 주도 (21, 22)을 항상성 여러 차례 수행하고있다.
이 프로토콜은 고정 CNS 조직의 사용에 초점을 맞추고있는 동안 마지막으로, Tg는 (CAG-LacZ를 / EGFP-KASH2) 마우스는 시험 관내에서 LINC 착물을 방해하는 효과를 연구하기 위해 분리 및 배양 된 기본 셀에 사용될 수있다. 이 방식을 이용하면, 분리 및 시간 경과 비디오 현미경과 같은 애플리케이션에 EGFP-KASH2 양성 세포의 일차 배양 물을 정화 할 수있다. 이는 뉴런 낮은 형질 감염 효율 또는 일차 배양 시스템에 필요한 렌티 바이러스 생산을 무시.
요약하면, Tg는 (CAG-LacZ를가 / EGFP-KASH2) 마우스는 재미를 공부하는 새롭고 흥미로운 가능성을 열어조직 및 세포 유형의 다양한에서 배아 및 출생 후 포유류의 발달 과정에서 생체 내에서 LINC 단지의 ction의 기본 세포 생물학 문의 사항에 답변을 제공합니다.
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Disclosures
저자가 공개하는 게 없다.
Acknowledgments
저자는 (학과 안과 및 Visual 과학)과 의학의 세인트 루이스 학교 워싱턴 대학에서 마우스 유전학 코어의 분자 유전학 코어, 형태 및 이미지 코어의 직원을 감사드립니다. 저자는 세포에 대한 맥도넬 센터 및 분자 신경 생물학, 신경 장애에 대한 희망 센터에서 작은 보조금 프로그램에 의해 지원, 국립 안과 연구소 (DH에 # R01EY022632), 국립 안과 연구소 센터 코어 그랜트 (# 1 P30EY002687) 및 연구에서 무제한 부여 안과 및 Visual 과학 부서에 실명을 방지합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S0389 | |
| 10x PBS | Gibco | 14200-075 | |
| 16% Paraformaldehyde Solution | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| OCT Compound | Tissue-Tek | 4583 | |
| Adhesion Slides | StatLab | M1000W | |
| Donkey Serum | Sigma Aldrich | D9663 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T9284 | |
| ImmuEdge Pen | Vector Laboratories | H-4000 | |
| Anti-Calbindin Antibody | Sigma Aldrich | C9848 | |
| Anti-EGFP Antibody | Abcam | ab13970 | |
| Anti-Nesprin2 Antibody | Previously described in Ref. 21 | ||
| Fluorescent Mounting Media | Dako | S3023 | |
| 2-methyl butane | Sigma Aldrich | O3551 |
References
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