Introduction
Den kjernefysiske konvolutten (NE) skiller nukleoplasma fra cytoplasma. Det er sammensatt av en indre og ytre kjernemembranen (INM og onm, henholdsvis) som kobler i det nukleære porer. Lumen avgrenset av begge membraner kalles perinukleære plass (PNS). Den onm er en forlengelse av den grove endoplasmatiske retikulum (ER), og INM fester seg til atom lamina, en meshwork av kjernefysisk type V intermediate filamenter representert av A- og B-type lamins 1,2. Linkers av Nucleoskeleton og Cytoskjelett (LINC) komplekser er makromolekylære forsamlinger som spenner over hele atom konvolutten for å fysisk koble det indre av kjernen til cytoskeletal filamenter og molekylære motorer (Figur 1a). De består av interaksjoner mellom evolusjonært konserverte motiver som karakteriserer to familier av integrerte trans proteiner av NE: Søn (Sad1 / Unc84) proteiner og Nesprins (Nuclear Konvolutt SPectRINS). I pattedyr, Sun1 og Sun2 are transmembranproteiner av INM hvis N-terminale region nucleoplasmic vekselvirker direkte med A- og B-type lamins 3-5. På den andre siden av INM, innenfor PNS, Sun proteiner havn en evolusjonær konservert-strekning på ~ 150 C-terminale aminosyrer som kalles sø domenet. SUN domener samhandle direkte med den evolusjonære bevart KASH (Klarsicht / Anc-en, Syne Homologi) domene, det molekylære signaturen til Nesprins. KASH domener består av en strekning av ~ 30 C-terminale aminosyrer som rager inn i PNS, etterfulgt av et transmembrandomene 6. Minst fire distinkte Nesprin gener (Nesprin1-4) kode KASH inneholder proteiner som lokaliserer seg NE 7. De cytoplasmatiske regioner av Nesprins, hvis størrelse varierer fra ~ 50 kDa (Nesprin4) til en forbløffende 1000 kDa (Nesprin1 gigantisk), inneholde flere spektrin gjentar samt spesifikke motiver slik at deres interaksjon med cytoskeletal komponenter som aktin, plectin og molekylære motorer 8- 13.
<p class = "jove_content"> Studier i virveldyr og virvelløse dyr har vist at Lamin / søn / Nesprin / molekylære motorer utgjør et evolusjonært konservert "aksen" kontrollerende atom migrasjon og forankring. Flere knock-out (KO) musemodeller av LINC komplekse komponenter har blitt beskrevet og var instrumental i å gi et rammeverk for å forstå rollene til Sun og Nesprin proteiner på NE under pattedyr utvikling 9,14,15. Men disse modellene presentere flere betydelige ulemper, særlig: 1) vanskeligheter med å tolke fenotyper ved at celler ikke-autonome effekter, 2) vanskeligheter med å skjelne mellom de fenotypiske bidrag fra KASH holdig vs. KASH-mindre Nesprin isoformene 16, 3) funksjonell redundans av Sun og Nesprin proteiner på NE i mange celletyper krever komplekse avlsprogram for å inaktivere alle SUN-Kash interaksjoner i mus 17 og 4) perinatal dødelighet hos mus mangelfulle for KASH-domene av bådeNesprins1 og to utelukker analyse av voksen fenotyper 18.Denne protokollen beskriver en roman musemodell designet for å forstyrre alle SUN-Kash interaksjoner in vivo, i en celle autonome og utviklingsmessig regulert måte, og dermed omgå mange av ulempene som er skissert ovenfor. Dette Cre / lox-baserte musemodell er avhengig av to viktige begreper: 1) KASH domenet av hvilken som helst kjent Nesprin protein er tilstrekkelig til å målrette EGFP til NE i cellekultursystemer og 2) SUN domener kommuniserer kritikkløst med KASH domener, slik overekspresjon av noen KASH domenet vil mette alle endogene SUN domener og inaktivere LINC komplekser i en dominant-negativ måte 17 (figur 1B). Denne protokollen beskriver vev slakteri- og foredlingsledd som brukes til å bekrefte avbrudd av alle SUN-Kash interaksjoner i lillehjernen Purkinje celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Etikk Uttalelse: Prosedyrer som involverer dyr fag ble godkjent av Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC) ved Washington University in St. Louis.
1. Mouse Avl og Genotyping
- Avle Tg (CAG-LacZ / EGFP-KASH2) mus med Tg (PCP2-Cre) mus å produsere Tg (PCP2Cre CAG-EGFP / KASH2) 19,20. Merk: Når resten av denne protokollen fokuserer på bruk av Tg (PCP2-Cre) muselinje for å begrense EGFP-KASH2 ekspresjon i Purkinje-celler i lillehjernen, kan en lignende fremgangsmåte følges med enhver annen Tg (Cre) mus ( Figur 2A).
- Utfør genotyping å identifisere valpene huser både EGFP og Cre transgener som tidligere beskrevet 19.
2. Utarbeidelse av materialer Dissection og Tissue Collection
- Forbered 100 ml 30% sukrose i PBS (30 g sukrose / 100 ml 1x PBS) og oppbevares ved -20 ° C. Dagen for vev harvesting, tine og last ~ 30-35 ml sukroseløsning inn i en 35 ml sprøyte for transcardial perfusjoner.
- Forbered 40 ml 4% PFA i PBS (10 ml 16% paraformaldehyd og 30 ml PBS). Load ~ 30-35 ml 4% PFA inn i en 35 ml sprøyte for transcardial perfusjoner.
- Fylle en 10 cm vevsdyrkningsplate med 10 ml PBS for vev disseksjon.
- Forbered en ketamin / xylazin cocktail bestående av 16 mg / ml ketamin og 3 mg / ml xylazine.
- Forbered en løsning av 70% etanol for disseksjon.
3. Dissection og Tissue Collection
- Ved hjelp av en 1 ml sprøyte, injisere 500 ul av ketamin / xylazin cocktail per 25 gram kroppsvekt, og vente på ~ 15 min. Alternativt kan du bruke en annen institusjonelt godkjent sedasjon metoden som passer for den biologiske system av interesse.
- Ved sedasjon, forsiktig klemme bak labben for å bekrefte manglende smerterespons, pin alle labbene på en Styrofoam brett med ryggsiden avmuse vendt ned.
- Spray magen med 70% etanol og lage et snitt fra nedre del av magen til toppen av brystkassen for å få tilgang til hjertet.
- Lage et lite snitt i den høyre atrium av hjertet og sette sprøyten inneholdende 30% sukrose-løsning i den venstre ventrikkel i hjertet.
- Perfuse løsningen med en hastighet på ~ 2-5 ml per min. Når den er tom, fjern sprøyten og gjenta med 4% PFA løsning.
- Løsne musen fra Styrofoam skuffen og halshogge å få tilgang til hjernen.
- Fjern skinnet rundt hodet på dyret ved hjelp av pinsett og saks. Dytte et hull i bakre del av skallen med en nål og forsiktig fjerne skallen med saks og dissekere tang.
- Når hjernen er klart tilgjengelig, bruke pinsett for å fjerne lillehjernen og legg den i PBS. Kjære cerebellum i sagittalplanet med en skalpell og overføring til 30% sukrose-oppløsning over natten ved 4 ° C. Merk: For å preper parafinsnitt, fikse lillehjernen over natten ved 4 ° C i 4% PFA før vev embedding og seksjonering.
4. Tissue Processing og Seksjonering
- Fremstille en oppslemming av tørris og 2-metyl-butan. At temperaturen av badet bringes til likevekt i 5 min.
- Fyll en cryomold med oktober sammensatte og plassere den ene halvdelen av bisected cerebellum i formen.
- Ved hjelp av en dissekere mikroskop og en pinsett stilling lillehjernen, slik at det delt i to overflaten (nær midtlinjen av cerebellum) vender oppover.
- Overfør cryomold til tørris oppslemmingen i 5 min inntil oktober forbindelsen har dannet en fast hvit matriks rundt vevspreparat. Merk: De frosne prøvene kan lagres ved -20 ° C hvis det er nødvendig.
- Etiketten forbehandlet poly-lysin lysbilder for innsamling vevssnitt og forberede kryostat i henhold til produsentens instruksjoner for å samle inn 15 mikrometer deler av cerebellum. Å samle delene, nøye kontakt OCT delen med poly-lysin belagt side av raset. For å bevare orienteringen av seksjonen, ikke roter lysbildet under dette trinnet.
- Butikken vevssnitt ved -20 ° C inntil fortsetter med flekker og bildebehandling.
5. Farging og Imaging av lillehjernen Seksjoner
- Forbered følgende løsninger før vevet farging:
~ 50 ml PBS
~ 5-10 ml 4% PFA i PBS
~ 10-20 ml 0,5% Triton X-100, 10% serum i PBS esel - Tine lillehjernen seksjoner. Viktigere, minimere sin eksponering til noen kilde til kontinuerlig og intenst lys for å hindre falming av EGFP.
- Ved hjelp av en hydrofob barriere penn, tegne et rektangel rundt vevssnittene.
- Post-fikse seksjoner med 4% PFA i 5 min. Bruk nok væske til å dekke hele området avgrenses av den hydrofobe barriere (vanligvis ~ 500 mL). Ved hjelp av et vakuum eller pipette, reflytte fiksativ være spesielt forsiktig for ikke å forstyrre vevssnitt.
- Med en pipette, forsiktig bruke PBS på lysbildet uten å forstyrre vevssnitt. Etter 5 min bruke vakuum eller pipette for å fjerne forsiktig væsken. Gjenta PBS skylle totalt tre ganger.
- Ved hjelp av en pipette, anvende nøye passende fortynning av primære antistoffer (3 ul Calbindin og / eller Nesprin2 antistoff per 900 ul oppløsning) i 0,5% Triton X-100, 10% esel serum i PBS. Inkuber i en time ved romtemperatur i mørket.
Merk: EGFP-KASH2 vil være synlig ved direkte fluorescens mikroskopi på frosne snitt, og det er ikke nødvendig å benytte et anti-EGFP-antistoff. Men hvis parafinsnitt er utarbeidet, avbildning av EGFP-KASH2 krever immundeteksjon med et anti-EGFP antistoff. - Fjern det antistoffløsning og skyll med PBS tre ganger.
- Forbered 1: 1000 fortynninger av Alexa-Fluor sekundære antistoffer hos 0,5% Triton X-100,10% esel serum i PBS og oppbevares mørkt.
- Fjern forsiktig den endelige PBS skylling og bruke den sekundære antistoff fortynning i en time i mørket.
- Ta ut den sekundære antistoff løsning, skyll og vask avsnittet tre ganger. Hvis det er nødvendig, bruke en kjernefysisk flekk, for eksempel DAPI (~ 300nm), i løpet av første PBS-programmet.
- Fullstendig fjerne PBS løsning fra hele vev og sted ~ 5-7 mL av montering media på vev delen. Plassere et dekkglass på toppen av vevet seksjonen og satt til side i ~ 15 til 30 minutter ved romtemperatur i mørke.
- Bruke et fluorescens mikroskop utstyrt med passende filtre for å visualisere EGFP og eventuelle andre egnede bølgelengder for de sekundære antistoffer som ble anvendt i trinn 5.8 / 5.9. I lillehjernen skiver, bruk en 20X objektiv for å vise EGFP-KASH2 atom felger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne protokollen illustrerer nytten av Tg (CAG-LacZ / EGFP-KASH2) musemodell for å begrense EGFP-KASH2 uttrykk til lillehjernen Purkinje celler ved hjelp av Tg (PCP2-Grobunn) mus. I Tg (PCP2Cre CAG-EGFP / KASH2) avkom, blir LacZ / V5 åpen leseramme skåret på P6 av Cre rekombinase dermed fører til uttrykk av EGFP-KASH2 spesielt rettet mot Purkinje celler (Figur 2A). Som forventet er EGFP-KASH2 rettet på atom konvolutten som indikert av EGFP-positive kant-lignende mønster observert rundt kjernen (figur 2B). For å maksimere en hvilken som helst fysiologisk fenotype, er det viktig å sikre at EGFP-KASH2 uttrykkes i et flertall av målceller ved å beregne prosentandelen av EGFP-KASH2 positive celler som er ko-farget med en celle-spesifikt antistoff markør. I dette eksempel ble EGFP-KASH2 ekspresjon detektert i mer enn 70% av Calbindin-positive Purkinje celler (figur 2B). I disse Condisjoner, har vi ikke observere noen signifikante histologiske eller atferds fenotyper i 10 måneder gamle Tg (PCP2Cre CAG-EGFP / KASH2) mus 20. Det er viktig å sikre at eventuelle morfologiske eller atferds fenotype er ikke på grunn av ektopisk uttrykk for EGFP-KASH2 en utilsiktet celletype / vev. Å så henseende ble EGFP-KASH2 ikke observert i granulat celle laget eller den molekylære lag av Tg (PCP2Cre CAG-EGFP-KASH2) cerebella (figur 2B).
Endelig er det viktig å bekrefte graden av LINC kompleks forstyrrelse i celler som uttrykker EGFP-KASH2. Dette kan oppnås ved hjelp av høy-kvalitets anti-Nesprin antistoffer for å fremheve deres forskyvning fra NE av celler som uttrykker EGFP-KASH2. Som vist i figur 3, er endogen Nesprin2 fortrengt fra atom konvolutt av Purkinje celler som uttrykker EGFP-KASH2 (figur 3 toppanelet, gule piler) mens Purkinje celler som ikke uttrykker EGFP-KASH2 retai endogen Nesprin2 ved kjernekraft konvolutten (figur 3 toppanelet, hvit pil). Som forventet, kontroll kullsøsken, som ikke uttrykker Cre-rekombinase, vise Nesprin2 ved kjernekraft konvolutten av hele Purkinje cellepopulasjonen (figur 3 nederste hvite piler). Flere rapporter har nå bekreftet uttrykk for EGFP-KASH2, ledsaget av forskyvning av endogene Nesprins, i flere vev og celletyper som for eksempel skjelettmuskelfibre og kjegle fotoreseptorene 19,21.
Figur 1. LINC komplekser koble kjernen til cytoskjelettet og blir forstyrret av overekspresjon av EGFP-KASH2. (A) Visning av LINC komplekser som forbinder det indre av kjernen til cytoplasma cytoskjelettet. Merk at SUN domener samhandle promiskuøst med Kash domenerfra alle Nesprins (Nesprins 1-4). (B) Overuttrykte EGFP-KASH2 fortrenger endogene Nesprins fra atom konvolutt til ER, i en dominant negativ måte, og dermed kobler kjernen fra omkringliggende cytoplasma cytoskeleton.
Figur 2. Overuttrykte EGFP-KASH2 spesielt rettet mot lillehjernen Purkinje celler. (A) Avl av Tg (CAG-LacZ / EGFP-KASH2) til Tg (PCP2-Cre) mus resultater i Tg (PCP2Cre CAG-EGFP-KASH2) avkom hvori Cre rekombinase uttrykkes spesifikt i lillehjernen Purkinje celler. Ved uttrykk (P6), translocates Cre rekombinase inn i kjernen hvor det excises LacZ ORF og induserer EGFP-KASH2 uttrykk. (B) Tg (PCP2Cre CAG-EGFP-KASH2) mus spesifikt uttrykker EGFP-KASH2 i lillehjernen Purkinje celler ID-kort produksjonIED med Calbindin (farget i rødt). Legg merke til at begge lillehjernen granule nevroner og interneurons av molekylære lag er negative for EGFP-KASH2 uttrykk. Forkortelser: MOL: Molecular lag, PCL: Purkinje celle laget og GCL: Granule cellelaget.
Figur 3. Forstyrrelse av endogene LINC komplekser i lillehjernen Purkinje celler. Enkelt konfokal planet viser uttrykk for EGFP-KASH2 som fortrenger endogen Nesprin2 (farget i rødt) fra atom konvolutt av Purkinje celler (gule piler øverst). Merk at Purkinje celler som mangler EGFP-KASH2 uttrykk opprett endogen Nesprin2 på sitt kjernefysiske konvolutten (hvit pil øverst). I Tg (CAG-LacZ / EGFP-KASH2) kontrollkullsøsken, er ingen EGFP signal observert og Nesprin2 oppdages ved kjernekraft konvolutt av alt Purki
Denne protokollen illustrerer nytten avTg (CAG-LacZ / EGFP-KASH2) musemodell for å begrense EGFP-KASH2 uttrykk til lillehjernen Purkinje celler ved hjelp av Tg (PCP2-Grobunn) mus. I Tg (PCP2Cre CAG-EGFP / KASH2) avkom, blir LacZ / V5 åpen leseramme skåret på P6 av Cre rekombinase dermed fører til uttrykk av EGFP-KASH2 spesielt rettet mot Purkinje celler (Figur 2A). Som forventet er EGFP-KASH2 rettet på atom konvolutten som indikert av EGFP-positive kant-lignende mønster observert rundt kjernen (figur 2B). For å maksimere en hvilken som helst fysiologisk fenotype, er det viktig å sikre at EGFP-KASH2 uttrykkes i et flertall av målceller ved å beregne prosentandelen av EGFP-KASH2 positive celler som er ko-farget med en celle-spesifikt antistoff markør. I dette eksempel ble EGFP-KASH2 ekspresjon detektert i mer enn 70% av Calbindin-positive Purkinje celler (figur 2B). I disse forholdene, har vi ikke observere noen betydelig histologisk eller behavioral fenotyper i 10 måneder gamle Tg (PCP2Cre CAG-EGFP / KASH2) mus 20. Det er viktig å sikre at eventuelle morfologiske eller atferds fenotype er ikke på grunn av ektopisk uttrykk for EGFP-KASH2 en utilsiktet celletype / vev. Å så henseende ble EGFP-KASH2 ikke observert i granulat celle laget eller den molekylære lag av Tg (PCP2Cre CAG-EGFP-KASH2) cerebella (figur 2B).
Endelig er det viktig å bekrefte graden av LINC kompleks forstyrrelse i celler som uttrykker EGFP-KASH2. Dette kan oppnås ved hjelp av høy-kvalitets anti-Nesprin antistoffer for å fremheve deres forskyvning fra NE av celler som uttrykker EGFP-KASH2. Som vist i figur 3, er endogen Nesprin2 fortrengt fra atom konvolutt av Purkinje celler som uttrykker EGFP-KASH2 (figur 3 toppanelet, gule piler) mens Purkinje celler som ikke uttrykker EGFP-KASH2 beholde endogen Nesprin2 ved kjernekraft konvolutten (Figur 3 (figur 3 nederste hvite piler). Flere rapporter har nå bekreftet uttrykk for EGFP-KASH2, ledsaget av forskyvning av endogene Nesprins, i flere vev og celletyper som for eksempel skjelettmuskelfibre og kjegle fotoreseptorene 19,21.
Figur 1. LINC komplekser koble kjernen til cytoskjelettet og blir forstyrret av overekspresjon av EGFP-KASH2. (A) Visning av LINC komplekser som forbinder det indre av kjernen til cytoplasma cytoskjelettet. Legg merke til at sol domener samhandle promiskuøst med Kash domener fra hele Nesprins (Nesprins 1-4). (B) Overuttrykte of EGFP-KASH2 fortrenger endogene Nesprins fra atom konvolutt til ER, i en dominant negativ måte, og dermed kobler kjernen fra omkringliggende cytoplasma cytoskeleton. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Overuttrykte EGFP-KASH2 spesielt rettet mot lillehjernen Purkinje celler. (A) Avl av Tg (CAG-LacZ / EGFP-KASH2) til Tg (PCP2-Cre) mus resultater i Tg (PCP2Cre CAG-EGFP-KASH2) avkom hvori Cre rekombinase uttrykkes spesifikt i lillehjernen Purkinje celler. Ved uttrykk (P6), translocates Cre rekombinase inn i kjernen hvor det excises LacZ ORF og induserer EGFP-KASH2 uttrykk. (B) Tg (PCP2Cre CAG-EGFP-KASH2) Mus spesifikt uttrykker EGFP-KASH2 i lillehjernen Purkinje celler identifisert med Calbindin (farget i rødt). Legg merke til at begge lillehjernen granule nevroner og interneurons av molekylære lag er negative for EGFP-KASH2 uttrykk. Forkortelser: MOL: Molecular lag, PCL: Purkinje celle laget og GCL. Granule cellelag Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Forstyrrelse av endogene LINC komplekser i lillehjernen Purkinje celler. Enkelt konfokal planet viser uttrykk for EGFP-KASH2 som fortrenger endogen Nesprin2 (farget i rødt) fra atom konvolutt av Purkinje celler (gule piler øverst). Merk at Purkinje celler som mangler EGFP-KASH2 uttrykk opprett endogen Nesprin2 på sitt kjernefysiske konvolutten (white pil øverst). I Tg (CAG-LacZ / EGFP-KASH2) kontrollkullsøsken, er ingen EGFP signal observert og Nesprin2 oppdages ved kjernekraft konvolutten av alle Purkinje celler (hvite piler nederst). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den mest kritiske trinn for å kunne studere rollen til LINC kompleksene in vivo ved hjelp av Tg (CAG-LacZ / EGFP-KASH2) modell er å identifisere en egnet Cre muselinje (r). Faktisk, hvis Cre er aktive i andre celletyper som er involvert i lignende baner, kan det komplisere tolkningen av resultatene. Derfor er det viktig å undersøke nærliggende celler, som vist her i de molekylære og granule cellelagene i lillehjernen (figur 2B). Likeledes, for å maksimere eventuelle fysiologisk relevante fenotyper er det viktig å identifisere en Cre Cre-stamme med utstrakt ekspresjon på tvers av celletype av interesse. Det er også viktig å foreta en grundig karakterisering av ekspresjonen mønster av LINC komplekse komponenter under utviklingen av systemet er av interesse. Faktisk er en ulempe av Tg (CAG-LacZ / EGFP-KASH2) musemodell at det ikke gir noen informasjon om hvilke Sun proteiner eller Nesprins variantene er involvert i den biologiske system under betraktning. Imidlertid kan dette problemet løses ved å gjennomføre en grundig karakterisering både på transkripsjon og protein nivåer. Faktisk har slike studier foretatt ved flere anledninger som førte til viktige funn om rollen til spesifikke LINC komplekse komponenter under CNS utvikling og homeostase 21,22.
Til slutt, mens denne protokollen er fokusert på bruken av faste CNS-vev, Tg (CAG-LacZ / EGFP-KASH2) mus kan brukes til å isolere og kultur primære celler for å studere effekten av å forstyrre LINC kompleksene in vitro. Ved hjelp av denne ordningen, er det mulig å isolere og rense primærkulturer av EGFP-KASH2-positive celler for applikasjoner som time-lapse video mikroskopi. Dette forbigår lave transfeksjonseffektiviteter eller lentiviral produksjon som kreves for primærkultursystemer, så som nevroner.
Oppsummert Tg (CAG-LacZ / EGFP-KASH2) mus åpne opp nye og spennende muligheter for å studere på moroaDette skjer av LINC kompleksene in vivo under embryonal og postnatale pattedyr utviklingsmessige prosesser i et bredt utvalg av vev og celletyper for å løse grunnleggende cellebiologiske spørsmål.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne takker de ansatte på morfologi og Imaging kjerne av molekylær genetikk kjernen (Department of Ophthalmology og Visual Sciences) og av musen Genetics Kjerne ved Washington University i St. Louis School of Medicine. Forfatterne er støttet av den lille stipendprogram fra The McDonnell Senter for celle- og molekylærnevrobiologi, Hope Senter for nevrologiske lidelser, National Eye Institute (# R01EY022632 til DH), en National Eye Institute senter Kjerne Grant (# P30EY002687) og en ubegrenset tilskudd fra Forsknings å hindre blindhet til Institutt for Ophthalmology og Visual Sciences.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S0389 | |
| 10x PBS | Gibco | 14200-075 | |
| 16% Paraformaldehyde Solution | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| OCT Compound | Tissue-Tek | 4583 | |
| Adhesion Slides | StatLab | M1000W | |
| Donkey Serum | Sigma Aldrich | D9663 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T9284 | |
| ImmuEdge Pen | Vector Laboratories | H-4000 | |
| Anti-Calbindin Antibody | Sigma Aldrich | C9848 | |
| Anti-EGFP Antibody | Abcam | ab13970 | |
| Anti-Nesprin2 Antibody | Previously described in Ref. 21 | ||
| Fluorescent Mounting Media | Dako | S3023 | |
| 2-methyl butane | Sigma Aldrich | O3551 |
References
- Hutchison, C. J. Lamins: building blocks or regulators of gene expression? Nature reviews. Molecular cell biology. 3, 848-858 (2002).
- Stuurman, N., Heins, S., Aebi, U. Nuclear lamins: their structure, assembly, and interactions. Journal of structural biology. 122, 42-66 (1998).
- Crisp, M., et al. Coupling of the nucleus and cytoplasm: role of the LINC complex. The Journal of cell biology. 172, 41-53 (2006).
- Haque, F., et al. SUN1 interacts with nuclear lamin A and cytoplasmic nesprins to provide a physical connection between the nuclear lamina and the cytoskeleton. Molecular and cellular biology. 26, 3738-3751 (2006).
- Hodzic, D. M., Yeater, D. B., Bengtsson, L., Otto, H., Stahl, P. D. Sun2 is a novel mammalian inner nuclear membrane protein. The Journal of biological chemistry. 279, 25805-25812 (2004).
- Starr, D. A.
- Mellad, J. A., Warren, D. T., Shanahan, C. M. Nesprins LINC the nucleus and cytoskeleton. Current opinion in cell biology. 23, 47-54 (2011).
- Fridolfsson, H. N., Starr, D. A. Kinesin-1 and dynein at the nuclear envelope mediate the bidirectional migrations of nuclei. The Journal of cell biology. 191, 115-128 (2010).
- Meyerzon, M., Fridolfsson, H. N., Ly, N., McNally, F. J., Starr, D. A. UNC-83 is a nuclear-specific cargo adaptor for kinesin-1-mediated nuclear migration. Development. 136, 2725-2733 (2009).
- Padmakumar, V. C., et al. Enaptin, a giant actin-binding protein, is an element of the nuclear membrane and the actin cytoskeleton. Experimental cell research. 295, 330-339 (2004).
- Roux, K. J., et al. Nesprin 4 is an outer nuclear membrane protein that can induce kinesin-mediated cell polarization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 2194-2199 (2009).
- Wilhelmsen, K., et al. a novel outer nuclear membrane protein, associates with the cytoskeletal linker protein plectin. The Journal of cell biology. 171, 799-810 (2005).
- Wilson, M. H., Holzbaur, E. L. Nesprins anchor kinesin-1 motors to the nucleus to drive nuclear distribution in muscle cells. Development. 142, 218-228 (2015).
- Yu, J., et al. KASH protein Syne-2/Nesprin-2 and SUN proteins SUN1/2 mediate nuclear migration during mammalian retinal development. Human molecular genetics. 20, 1061-1073 (2011).
- Zhang, X., et al. Syne-1 and Syne-2 play crucial roles in myonuclear anchorage and motor neuron innervation. Development. 134, 901-908 (2007).
- Zhang, J., et al. Nesprin 1 is critical for nuclear positioning and anchorage. Human molecular genetics. 19, 329-341 (2010).
- Stewart-Hutchinson, P. J., Hale, C. M., Wirtz, D., Hodzic, D. Structural requirements for the assembly of LINC complexes and their function in cellular mechanical stiffness. Experimental cell research. 314, 1892-1905 (2008).
- Zhang, X., et al. SUN1/2 and Syne/Nesprin-1/2 complexes connect centrosome to the nucleus during neurogenesis and neuronal migration in mice. Neuron. 64, 173-187 (2009).
- Razafsky, D., Hodzic, D. Temporal and tissue-specific disruption of LINC complexes in vivo. Genesis. 52, 359-365 (2014).
- Razafsky, D., Hodzic, D. A variant of Nesprin1 giant devoid of KASH domain underlies the molecular etiology of autosomal recessive cerebellar ataxia type I. Neurobiology of disease. 78, 57-67 (2015).
- Razafsky, D., Blecher, N., Markov, A., Stewart-Hutchinson, P. J., Hodzic, D. LINC complexes mediate the positioning of cone photoreceptor nuclei in mouse retina. PloS one. 7, e47180 (2012).
- Razafsky, D. S., Ward, C. L., Kolb, T., Hodzic, D. Developmental regulation of linkers of the nucleoskeleton to the cytoskeleton during mouse postnatal retinogenesis. Nucleus. 4, 399-409 (2013).
