Introduction
O envelope nuclear (NE) separa o nucleoplasma do citoplasma. É composto por uma membrana nuclear interna e externa (INM e ONM, respectivamente) que se ligam em poros nucleares. O lúmen delimitada pelas duas membranas é chamada o espaço perinuclear (SNP). A ONM é uma extensão do retículo endoplasmático rugoso (ER), eo INM adere à lâmina nuclear, uma malha de nuclear-V Tipo de filamentos intermediários representados por A e do tipo B lamins 1,2. Ligantes do Nucleoskeleton e do citoesqueleto (LINC) são complexos macromoleculares conjuntos que abrangem todo o envelope nuclear para ligar fisicamente o interior do núcleo de filamentos do citoesqueleto e motores moleculares (Figura 1A). Eles consistem de interações entre motivos evolutivamente conservadas que caracterizam duas famílias de proteínas transmembrana integrantes do NE: Sun (Sad1 / Unc84) proteínas e Nesprins (SPectRINS Envelope Nuclear). Nos mamíferos, Sun1 e Sun2 arproteínas transmembranares e do INM nucleoplásmica cuja região N-terminal interage directamente com A e do tipo B laminas 3-5. Por outro lado do INM, dentro do SNP, proteínas Sun Harbor um estiramento evolutiva-conservada de ~ 150 aminoácidos C-terminais do domínio chamado sol. SUN domínios interagir diretamente com o evolucionário conservado KASH (Klarsicht / Anc-1, Syne homologia) de domínio, a assinatura molecular de Nesprins. Kash domínios consistem de um troço de ~ 30 aminoácidos C-terminais que se projeta para o SNP seguido por um domínio transmembranar 6. Pelo menos quatro genes distintos (Nesprin1-4 Nesprin) codificam proteínas contendo KASH que localizam no NE 7. As regiões citoplasmáticos de Nesprins, cujos tamanhos variam de ~ 50 kDa (Nesprin4) para uma surpreendente 1.000 kDa (Nesprin1 gigante), contêm spectrin múltiplas repetições, bem como os motivos específicos permitindo a sua interação com os componentes do citoesqueleto de actina, tais como, plectina e motores moleculares 8- 13.
<p class = "jove_content"> Estudos em vertebrados e invertebrados mostraram que Lamin / Sun / Nesprin / motores moleculares constituem um "eixo" evolutivamente conservada controlar a migração e ancoragem nuclear. Vários knock-out (KO) modelos do rato do LINC componentes complexos têm sido descritos e eram instrumentais em fornecer um quadro para entender os papéis de proteínas Sun e Nesprin no NE durante o desenvolvimento dos mamíferos 9,14,15. No entanto, estes modelos apresentam várias desvantagens significativas, principalmente: 1) dificuldade em interpretar fenótipos devido à célula efeitos não-autónomos, 2) dificuldade em distinguir as contribuições fenotípicas de KASH contendo vs. KASH-less Nesprin isoformas 16, 3) a redundância funcional de proteínas Sun e Nesprin no NE em numerosos tipos de células requer esquemas de melhoramento complexas para inativar todas as interacções SUN-Kash em camundongos 17 e 4) a letalidade perinatal de camundongos deficientes para a KASH-domínio de ambosNesprins1 e 2 opõe-se à análise de fenótipos adulto 18.Este protocolo descreve um novo modelo de ratinho concebido para romper todas as interacções SOL-Kash in vivo, numa célula de forma autónoma e regulada pelo desenvolvimento, ignorando assim muitas das desvantagens descritas acima. Este modelo de ratinho Cre / à base de LOX assenta em dois conceitos importantes: 1) o domínio KASH de qualquer proteína Nesprin conhecida é suficiente para atingir EGFP ao NE em sistemas de cultura de células e 2) domínios SUN interagir promiscuamente com domínios Kash, portanto, sobre-expressão de qualquer domínio KASH vai saturar todos os domínios SUN endógenos e inactivam os complexos LINC de uma forma dominante negativa 17 (Figura 1B). Este protocolo descreve a colheita de tecidos e etapas de processamento usados para confirmar a interrupção de todas as interações SUN-Kash em células de Purkinje do cerebelo.
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Protocol
Declaração de Ética: Procedimentos envolvendo indivíduos animais foram aprovados pelo cuidado e uso Comitê Institucional Animal (IACUC) da Universidade de Washington em St. Louis.
1. Rato Reprodução e Genotipagem
- Raça ratos com Tg Tg (CAG-LacZ / EGFP-KASH2) (PCP2-Cre) ratos para produzir Tg (PCP2Cre CAG-EGFP / KASH2) 19,20. Nota: Embora o restante deste protocolo centra-se na utilização da linha de Tg (PCP2-Cre) do rato para restringir a expressão EGFP-KASH2 para células de Purkinje no cerebelo, um procedimento semelhante pode ser seguido com qualquer outra Tg (CRE) de ratinho ( A Figura 2A).
- Realizar genotipagem para identificar filhotes abrigando ambos os transgenes EGFP e Cre como descrito anteriormente 19.
2. Preparação de Materiais para Dissecção e Tissue Colecção
- Preparação de 100 ml de 30% de sacarose em PBS (30 g de sacarose / 100 ml de PBS 1x) e armazenar a -20 ° C. O dia de tecido harvesting, degelo e de carga ~ 30-35 ml da solução de sacarose em uma seringa de 35 ml para perfusões transcardial.
- Preparar 40 ml de 4% de PFA em PBS (10 mL 16% de paraformaldeído e 30 ml de PBS). Carga ~ 30-35 ml de 4% de PFA em uma seringa de 35 ml para perfusões transcardial.
- Encha uma placa de cultura de tecido de 10 cm com 10 ml de PBS por dissecção de tecidos.
- Preparar um cocktail de cetamina / xilazina que consiste em 16 mg / ml de cetamina e 3 mg / ml de xilazina.
- Prepara-se uma solução de etanol a 70% para a dissecação.
3. Dissecção e Recolha de Tecidos
- Usando uma seringa de 1 ml, injectar 500 ul do cocktail de cetamina / xilazina por 25 gramas de peso corporal e esperar para ~ 15 min. Em alternativa, utilizar um outro método de sedação institucional aprovado que é apropriado para o sistema biológico de interesse.
- Após sedação, aperte suavemente a pata traseira para confirmar a falta de resposta à dor, o pino todas as patas em uma bandeja de isopor com o lado dorsal dorato virado para baixo.
- Pulverizar o abdômen com 70% de etanol e fazer uma incisão de abdômen inferior para a parte superior da caixa torácica para ter acesso ao coração.
- Fazer uma pequena incisão no átrio direito do coração e inserir a seringa contendo a solução de sacarose a 30% para o ventrículo esquerdo do coração.
- Perfundir a solução a uma taxa de ~ 2-5 ml por min. Quando vazio, remover a seringa e repita com a solução PFA 4%.
- Desafixar o rato da bandeja de isopor e decapitar para acessar o cérebro.
- Retire a pele ao redor da cabeça do animal usando uma pinça e tesouras. Fazer um buraco na parte posterior do crânio com uma agulha e remova cuidadosamente o crânio com tesouras e pinças de dissecação.
- Uma vez que o cérebro é claramente acessíveis, utilizar uma pinça para remover o cerebelo e colocá-lo em PBS. Dividir o cerebelo no plano sagital com um bisturi e transferir para a solução de sacarose a 30% durante a noite a 4 ° C. Nota: Para prepararsão secções de parafina, fixar o cerebelo durante a noite a 4 ° C em 4% de PFA antes da incorporação do tecido e de corte.
4. Tissue Processing e Seccionamento
- Prepara-se uma suspensão de gelo seco e 2-metilbutano. Permitir que a temperatura do banho a equilibrar durante 5 min.
- Encher um composto com cryomold PTU e colocar uma metade do cerebelo bissectado no molde.
- Usando um microscópio de dissecção e um par de fórceps posição do cerebelo, de modo que a superfície bissectado (perto da linha média do cerebelo) é voltada para cima.
- Transferir a cryomold para a pasta de gelo seco durante 5 minutos até que o composto de outubro formou uma matriz sólida em torno das branco espécime de tecido. Nota: Os espécimes congelados podem agora ser armazenados a -20 ° C se necessário.
- Etiqueta pré-tratados lâminas poli-lisina para a recolha de tecidos e secções do crióstato preparar de acordo com as instruções do fabricante, a fim de recolher 15 um secções do Cerebellum. Para coletar as seções, entre em contato com cuidado a seção de outubro com o lado revestido a poli-lisina do slide. Para preservar a orientação da secção, não rodam a lâmina durante este passo.
- Cortes de tecido loja C a -20 ° até prosseguir com coloração e tratamento de imagens.
5. Coloração e imagem das Cerebelo Secções
- Prepare as seguintes soluções antes da coloração de tecidos:
~ 50 ml de PBS
~ 5-10 ml de 4% de PFA em PBS
~ 10-20 ml de 0,5% de Triton X-100, 10% de soro de burro em PBS - Seções cerebelar descongelar. Importante, minimizar sua exposição a qualquer fonte de luz contínua e intensa para evitar o desbotamento de EGFP.
- Usando uma caneta barreira hidrofóbica, desenhe um retângulo em torno das secções de tecido.
- Post-fixar as seções com PFA 4% para 5 min. Use líquido suficiente para cobrir toda a área delineada pela barreira hidrofóbica (usualmente ~ 500 mL). Usando um aspirador ou pipeta, remover o fixador ser particularmente cuidadosos para não perturbar as secções de tecido.
- Com uma pipeta, aplicar suavemente PBS na lâmina sem perturbar as secções de tecido. Após 5 min usar o vácuo ou pipeta para remover cuidadosamente o líquido. Repetir a lavagem de PBS um total de três vezes.
- Usando uma pipeta, aplicam-se cuidadosamente uma diluição adequada de anticorpos primários (3 ul Calbindina e / ou anticorpo Nesprin2 por 900 ul de solução) em 0,5% de Triton X-100, 10% de soro de burro em PBS. Incuba-se durante uma hora à temperatura ambiente no escuro.
Nota: EGFP-KASH2 será visível por microscopia de fluorescência directa em secções congeladas, e não é necessário utilizar um anticorpo anti-EGFP. No entanto, se secções de parafina foram preparadas, imagiologia de EGFP-KASH2 requer imunodetecção com um anticorpo anti-EGFP. - Remover a solução de anticorpos e enxaguar com PBS três vezes.
- Prepare 1: 1000 de anticorpos secundários diluições Alexa Fluor-em 0,5% de Triton X-100,10% de soro de burro em PBS e armazenar no escuro.
- Suavemente remover o enxaguamento final PBS e aplicar a diluição do anticorpo secundário durante uma hora no escuro.
- Remover a solução de anticorpo secundário, enxaguar e lavar a secção de três vezes. Se necessário, aplicar um corante nuclear, tais como DAPI (~ 300 nM), durante a primeira aplicação de PBS.
- Completamente remover a solução PBS de todo o tecido e lugar ~ 5-7 ul de montagem de mídia na secção de tecido. Coloque uma lamela de vidro na parte superior da secção de tecido e retiradas para ~ 15-30 min à temperatura ambiente no escuro.
- Usar um microscópio de fluorescência equipado com os filtros apropriados para visualizar EGFP e quaisquer outros comprimentos de onda adequados para os anticorpos secundários utilizados em passos de 5,8 / 5,9. Em fatias do cerebelo, utilizar uma objectiva de 20x para visualizar EGFP-KASH2 jantes nucleares.
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Representative Results
Este protocolo ilustra a utilidade do (EGFP-KASH2 / CAG-LacZ) modelo de ratinho Tg para restringir a expressão EGFP-KASH2 para células de Purkinje do cerebelo usando Tg (PCP2-CRE) ratinhos. Em Tg (PCP2Cre CAG-EGFP / KASH2) prole, a grelha de leitura aberta de LacZ / V5 é excisado em P6 pela recombinase Cre conduzindo assim à expressão de EGFP-KASH2 especificamente direccionada para células de Purkinje (Figura 2A). Como esperado, EGFP-KASH2 é voltado para o envelope nuclear, tal como indicado pelo padrão como aro-EGFP-positiva observada em torno do núcleo (Figura 2B). Para maximizar qualquer fenótipo fisiológico, é importante para garantir que EGFP-KASH2 é expresso na maioria das células alvo através do cálculo da percentagem de células positivas para EGFP-KASH2 que são co-coradas com um anticorpo específico para o marcador de células. Neste exemplo, a expressão EGFP-KASH2 foi detectado em mais de 70% das células de Purkinje Calbindina-positivas (Figura 2B). Nestas condições, não observamos nenhum fenótipos histológicos ou comportamentais significativos em 10 meses de idade Tg (PCP2Cre CAG-EGFP / KASH2) camundongos 20. É importante assegurar que qualquer fenótipo morfológica ou comportamental não é devido à expressão ectópica de EGFP-KASH2 num tipo de célula / tecido não intencional. Para este propósito, EGFP-KASH2 não foi observada na camada de células granulares ou a camada molecular de Tg (PCP2Cre CAG-EGFP-KASH2) cerebelo (Figura 2B).
Por fim, é vital para confirmar o grau de perturbação de PT complexo em células que expressam EGFP-KASH2. Isto pode ser conseguido usando anticorpos anti-Nesprin de alta qualidade para enfatizar o seu deslocamento a partir do NE de células que expressam EGFP-KASH2. Como mostrado na Figura 3, Nesprin2 endógena é deslocado a partir do envelope nuclear das células de Purkinje, que expressam EGFP-KASH2 (Figura 3 painel superior, as flechas amarelas) enquanto que as células de Purkinje, que não expressam EGFP-KASH2 retaem Nesprin2 endógeno no envelope nuclear (Figura 3 painel superior, seta branca). Como esperado, da mesma ninhada de controlo, que não expressam Cre-recombinase, exibir Nesprin2 para o envelope nuclear de toda a população de células de Purkinje (Figura 3 setas brancas inferior). Diversos relatórios têm agora confirmado a expressão de EGFP-KASH2, acompanhada pelo deslocamento de Nesprins endógenos, em outros tecidos e tipos de células, tais como as fibras do músculo esquelético e fotorreceptores cone 19,21.
Figura 1. complexos LINC ligar o núcleo para o citoesqueleto e são interrompidas pela sobre-expressão da EGFP-KASH2. (A) Representação de complexos LINC que ligam o interior do núcleo para o citoesqueleto citoplasmática. Note que domínios SUN interagir promiscuamente com domínios Kasha partir de todos os Nesprins (Nesprins 1-4). (B) A sobre-expressão de EGFP-KASH2 desloca Nesprins endógenos do envelope nuclear para o ER, de uma forma negativa dominante, desligando assim o núcleo do citoesqueleto citoplasmática circundante.
Figura 2. A sobre-expressão de EGFP-KASH2 especificamente direcionados para células de Purkinje do cerebelo. (A) Criação de Tg (CAG-LacZ / EGFP-KASH2) para Tg (PCP2-Cre) resultados em ratos Tg (PCP2Cre CAG-EGFP-KASH2) prole em que a recombinase Cre é expresso especificamente nas células de Purkinje do cerebelo. Após expressão (P6), a recombinase Cre transloca-se para o núcleo onde se excisa a ORF de LacZ e induz a expressão EGFP-KASH2. (B) Tg (PCP2Cre CAG-EGFP-KASH2) camundongos especificamente expressar EGFP-KASH2 em células de Purkinje do cerebelo IDENTIFicado com Calbindina (coloridas em vermelho). Note-se que ambos os neurônios granulares do cerebelo e interneurônios da camada molecular são negativos para a expressão EGFP-KASH2. Abreviaturas: MoL: camada molecular, PCL: camada de Purkinje célula e GCL: camada de células granulares.
Figura 3. O rompimento de complexos LINC endógenos em células de Purkinje do cerebelo. Avião confocal mostrando a expressão única de EGFP-KASH2 que desloca Nesprin2 endógena (coloridas em vermelho) do envelope nuclear de células de Purkinje (setas amarelas em cima). Note-se que as células de Purkinje sem expressão EGFP-KASH2 manter Nesprin2 endógena em seu envelope nuclear (topo seta branca). Em Tg (CAG-LacZ / EGFP-KASH2) da mesma ninhada de controlo, nenhum sinal de EGFP é observado e é detectado Nesprin2 para o envelope nuclear de todos Purki
Este protocolo ilustra a utilidade dea Tg (CAG-LacZ / EGFP-KASH2) modelo de ratinho para restringir a expressão EGFP-KASH2 para células de Purkinje do cerebelo usando Tg (PCP2-CRE) ratinhos. Em Tg (PCP2Cre CAG-EGFP / KASH2) prole, a grelha de leitura aberta de LacZ / V5 é excisado em P6 pela recombinase Cre conduzindo assim à expressão de EGFP-KASH2 especificamente direccionada para células de Purkinje (Figura 2A). Como esperado, EGFP-KASH2 é voltado para o envelope nuclear, tal como indicado pelo padrão como aro-EGFP-positiva observada em torno do núcleo (Figura 2B). Para maximizar qualquer fenótipo fisiológico, é importante para garantir que EGFP-KASH2 é expresso na maioria das células alvo através do cálculo da percentagem de células positivas para EGFP-KASH2 que são co-coradas com um anticorpo específico para o marcador de células. Neste exemplo, a expressão EGFP-KASH2 foi detectado em mais de 70% das células de Purkinje Calbindina-positivas (Figura 2B). Nestas condições, não observamos qualquer histológica significativa ou BEHAVIORAl fenótipos em 10 meses de idade Tg (PCP2Cre CAG-EGFP / KASH2) camundongos 20. É importante assegurar que qualquer fenótipo morfológica ou comportamental não é devido à expressão ectópica de EGFP-KASH2 num tipo de célula / tecido não intencional. Para este propósito, EGFP-KASH2 não foi observada na camada de células granulares ou a camada molecular de Tg (PCP2Cre CAG-EGFP-KASH2) cerebelo (Figura 2B).
Por fim, é vital para confirmar o grau de perturbação de PT complexo em células que expressam EGFP-KASH2. Isto pode ser conseguido usando anticorpos anti-Nesprin de alta qualidade para enfatizar o seu deslocamento a partir do NE de células que expressam EGFP-KASH2. Como mostrado na Figura 3, Nesprin2 endógena é deslocado a partir do envelope nuclear das células de Purkinje, que expressam EGFP-KASH2 (Figura 3 painel superior, as flechas amarelas) enquanto que as células de Purkinje, que não expressam EGFP-KASH2 reter Nesprin2 endógeno para o envelope nuclear (Figura 3 (Figura 3 setas brancas inferior). Diversos relatórios têm agora confirmado a expressão de EGFP-KASH2, acompanhada pelo deslocamento de Nesprins endógenos, em outros tecidos e tipos de células, tais como as fibras do músculo esquelético e fotorreceptores cone 19,21.
Figura 1. complexos LINC ligar o núcleo para o citoesqueleto e são interrompidas pela sobre-expressão da EGFP-KASH2. (A) Representação de complexos LINC que ligam o interior do núcleo para o citoesqueleto citoplasmática. Note que domínios SUN interagir promiscuamente com domínios Kash de todo Nesprins (Nesprins 1-4). (B) o A sobreexpressãof EGFP-KASH2 desloca Nesprins endógenos do envelope nuclear ao pronto-socorro, de uma forma negativa dominante, desligando assim o núcleo do citoesqueleto citoplasmática circundante. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. A sobre-expressão de EGFP-KASH2 especificamente direcionados para células de Purkinje do cerebelo. (A) Criação de Tg (CAG-LacZ / EGFP-KASH2) para Tg (PCP2-Cre) resultados em ratos Tg (PCP2Cre CAG-EGFP-KASH2) prole em que a recombinase Cre é expresso especificamente nas células de Purkinje do cerebelo. Após expressão (P6), a recombinase Cre transloca-se para o núcleo onde se excisa a ORF de LacZ e induz a expressão EGFP-KASH2. (B) Tg (PCP2Cre CAG-EGFP-KASH2) Camundongos especificamente expressar EGFP-KASH2 em células de Purkinje do cerebelo identificadas com Calbindina (coloridas em vermelho). Note-se que ambos os neurônios granulares do cerebelo e interneurônios da camada molecular são negativos para a expressão EGFP-KASH2. Abreviaturas: MoL: camada molecular, PCL: camada de Purkinje célula e GCL:. Camada de células granulares Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. O rompimento de complexos LINC endógenos em células de Purkinje do cerebelo. Avião confocal mostrando a expressão única de EGFP-KASH2 que desloca Nesprin2 endógena (coloridas em vermelho) do envelope nuclear de células de Purkinje (setas amarelas em cima). Note-se que as células de Purkinje sem expressão EGFP-KASH2 manter Nesprin2 endógena em seu envelope nuclear (Whitarrow e superior). Em Tg (CAG-LacZ / EGFP-KASH2) ninhada de controle, nenhum sinal EGFP é observado e Nesprin2 é detectado no envelope nuclear de todas as células de Purkinje (setas brancas baixo). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
O passo mais importante para estudar o papel com sucesso de complexos LINC in vivo utilizando o modelo de Tg (CAG-LacZ / EGFP-KASH2) é identificar uma linha de murganho adequados Cre (s). Com efeito, se Cre está activo em outros tipos de células-envolvidas em vias semelhantes, que podem complicar a interpretação dos resultados. Por isso, é importante examinar as células vizinhas, como mostrado nas camadas celulares e moleculares granulares do cerebelo (Figura 2B). Do mesmo modo, para maximizar a quaisquer fenótipos fisiologicamente relevantes é importante para identificar uma estirpe com expressão de Cre Cre generalizada em todo o tipo de células de interesse. Também é vital para realizar uma caracterização detalhada do padrão de LINC componentes complexos expressão durante o desenvolvimento do sistema de interesse. Com efeito, uma desvantagem da (/ EGFP-KASH2 CAG-LacZ) modelo de ratinho Tg é que ele não fornece qualquer informação sobre qual Sun proteínas ou variantes Nesprins estão envolvidos no sistema biológico uconsideração nder. No entanto, este problema pode ser superado mediante a realização de uma caracterização rigorosa em ambos os níveis de transcrição e proteínas. Na verdade, tais estudos foram realizados em várias ocasiões que levou a conclusões importantes sobre o papel dos componentes complexos específicos LINC durante o desenvolvimento do SNC e homeostase 21,22.
Finalmente, enquanto que este protocolo é focado na utilização de tecidos fixos do SNC, Tg (CAG-LacZ / EGFP-KASH2) ratinhos podem ser utilizados para isolar e células primárias de cultura para estudar o efeito de perturbar complexos LINC in vitro. Usando este esquema, é possível isolar e purificar culturas primárias de células EGFP-KASH2-positivos para aplicações tais como microscopia de lapso de tempo vídeo. Isso ignora a eficiência de transfecção baixos ou produção de lentivírus necessário para sistemas de cultura primários, como neurônios.
Em resumo, os (/ EGFP-KASH2 CAG-LacZ) camundongos Tg abrir novas e excitantes possibilidades para estudar a diversãocção de complexos LINC in vivo durante processos de desenvolvimento embrionário e pós-natal de mamífero em uma ampla variedade de tecidos e tipos de células para responder a questões básicas da biologia celular.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Os autores agradecem à equipe do núcleo de Morfologia e Imaging, do núcleo (Departamento de Oftalmologia e Ciências Visuais) e do rato Genetics Núcleo da Universidade Washington em St. Louis Faculdade de Medicina Molecular Genetics. Os autores são apoiados pelo programa pequeno concessão do centro McDonnell para Celular e Neurobiologia Molecular, o Centro de Esperança para Doenças Neurológicas, o National Eye Institute (# R01EY022632 a DH), um Centro National Eye Institute Núcleo Grant (# P30EY002687) e um donativo incondicional da Investigação para Prevenir Cegueira ao Departamento de Oftalmologia e Ciências Visuais.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S0389 | |
| 10x PBS | Gibco | 14200-075 | |
| 16% Paraformaldehyde Solution | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| OCT Compound | Tissue-Tek | 4583 | |
| Adhesion Slides | StatLab | M1000W | |
| Donkey Serum | Sigma Aldrich | D9663 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T9284 | |
| ImmuEdge Pen | Vector Laboratories | H-4000 | |
| Anti-Calbindin Antibody | Sigma Aldrich | C9848 | |
| Anti-EGFP Antibody | Abcam | ab13970 | |
| Anti-Nesprin2 Antibody | Previously described in Ref. 21 | ||
| Fluorescent Mounting Media | Dako | S3023 | |
| 2-methyl butane | Sigma Aldrich | O3551 |
References
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