Introduction
Ядерная оболочка (СВ) отделяет нуклеоплазму из цитоплазмы. Она состоит из внутреннего и внешнего ядерной мембраны (ИВМ и ONM, соответственно), которые подключаются на ядерные поры. Просвет очерчены обе мембраны называют перинуклеарном пространстве (ПНС). ONM является продолжением шероховатой эндоплазматической сети (ER), и ИВМ придерживается ядерной пластинки, сетчатая промежуточных филаментов ядерной типа V представлена А- и В-типа Ламины 1,2. Линкеры в нуклеоскелета и цитоскелета (ЛИНК) комплексов макромолекул сборки, которые охватывают весь ядерный конверт физически подключить интерьер ядра в цитоскелета нитей и молекулярных моторов (Рис. 1А) Они состоят из взаимодействий между эволюционно консервативных мотивов, которые характеризуют два семейства интегральных трансмембранных белков NE: Солнце (SAD1 / Unc84) белки и Nesprins (ядерная оболочка SPectRINS). У млекопитающих, sun1 и Sun2 сотоке трансмембранных белков НИМ которого N-терминал нуклеоплазме область взаимодействует непосредственно с А- и В-типа ламинов 3-5. С другой стороны, в INM ПНС, Sun белки питают эволюционный-сохраняется участок ~ 150 С-концевых аминокислот называется областью вс SUN домены непосредственно взаимодействуют с эволюционно-консервативными каш (Klarsicht / ANC-1, старое время гомология) домена, молекулярная подпись Nesprins. Кэш домены состоят из участка ~ 30 C-концевых аминокислот, который выступает в ПНС последующим трансмембранного домена 6. По крайней мере, четыре различных генов Nesprin (Nesprin1-4) кодирования KASH содержащие белки, которые локализуются на северо-востоке 7. Цитоплазматические регионы Nesprins, чьи размеры варьируются от ~ 50kDa (Nesprin4) к удивительным 1000 кДа (Nesprin1 гигантского), содержат несколько спектрин повторяет, а также конкретные мотивы позволяет их взаимодействие с цитоскелета компонентов, таких как актин, плектина и молекулярных моторов 8- 13.
<р = класс "jove_content"> Исследования в позвоночных и беспозвоночных животных показали, что Ламин / ВС / Nesprin / молекулярные моторы представляют собой эволюционно консервативный "ось" контрольный ядерной миграции и крепление. Несколько нокаут (КО) мышиных моделях ЛИНК сложных компонентов были описаны и сыграли важную роль в обеспечении рамок для понимания роли Солнца и Nesprin белков на северо-востоке в ходе развития млекопитающих 9,14,15. Тем не менее, эти модели представляют несколько существенных недостатков, в первую очередь: 1) сложности в интерпретации фенотипы в связи с клеточной неавтономных эффектов, 2) трудности в различении фенотипическую вклад каш, содержащих против KASH-менее Nesprin изоформы 16, 3) функциональная избыточность Sun и Nesprin белков в NE в многочисленных типов клеток требует сложных схем разведения, чтобы инактивировать все взаимодействия ВС-Каш у мышей 17 и 4) перинатальный летальность мышей с дефицитом в KASH-области иNesprins1 и 2 исключает анализ взрослого фенотипы 18.Этот протокол описан новый модель мыши, предназначенный для разрушения всех взаимодействий ВС-каш в живом организме, в клетке автономным и развитием регулируемым образом, минуя многие из недостатков, описанных выше. Это / LOX-ориентированная модель мыши Cre опирается на два важных концепций: 1) домен KASH любого известного белка Nesprin достаточно целевой EGFP в NE в системах клеточных культур и 2) SUN домены взаимодействуют разбора с KASH доменов, таким образом, избыточная экспрессия любой домен KASH будет насыщать все эндогенные SUN домены и инактивировать ЛИНК комплексы доминантно-негативной манере 17 (рис 1B). Этот протокол описывает сбор тканей и этапы обработки, используемые для подтверждения нарушения всех взаимодействий ВС-KASH в мозжечка клеток Пуркинье.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
О себе этика: Процедуры с участием животных предметы были одобрены уходу и использованию комитета Институциональные животных (IACUC) Вашингтонского университета в Сент-Луисе с.
1. Мышь Разведение и генотипирование
- Порода Tg (КАГ-LacZ / EGFP-KASH2) мышей с Tg (PCP2-CRE) мышей, чтобы произвести Tg (PCP2Cre CAG-EGFP / KASH2) 19,20. Примечание: В то время как остальная часть этого протокола ориентирована на использование линии Tg (PCP2-Cre) мыши, чтобы ограничить EGFP-KASH2 выражение клеток Пуркинье в мозжечке, аналогичная процедура может следовать любой другой Tg (CRE) мыши ( 2А).
- Выполните генотипирование для выявления щенков укрывательство как EGFP и CRE трансгены, как описано ранее 19.
2. Подготовка материалов для вскрытия и тканей Коллекция
- Приготовьте 100 мл 30% сахарозы в PBS (30 г сахарозы / 100 мл 1x PBS) и хранят при -20 ° С. День ткани чarvesting, оттепель и нагрузки ~ 30-35 мл раствора сахарозы в 35 мл шприц для transcardial перфузии.
- Подготовка 40 мл 4% PFA в PBS (10 мл 16% параформальдегида и 30 мл PBS). Нагрузка ~ 30-35 мл 4% PFA в 35 мл шприц для transcardial перфузии.
- Заполните 10 см планшет для тканевых культур с 10 мл PBS для рассечения тканей.
- Приготовьте кетамин / ксилазин коктейль, состоящий из 16 мг / мл кетамина и 3 мг / мл ксилазина.
- Готовят раствор 70% -ным этанолом для рассечения.
3. Вскрытие и тканей Коллекция
- Используя 1 мл шприц, вводят 500 мкл кетамин / ксилазина коктейль на 25 г веса тела и ждать ~ 15 мин. В качестве альтернативы, используйте другой метод институционально утвержденный седации, который подходит для биологической системы интересов.
- По седации, мягко ущипнуть заднюю лапу на, чтобы подтвердить отсутствие болевой реакции, контактный все лапы на пенопластовый лоток спинной сторонемышь вниз.
- Спрей живота с 70% этанола и сделать надрез от нижней части живота до верхней части грудной клетки, чтобы получить доступ к сердцу.
- Сделать небольшой надрез в правое предсердие сердца, и вставить в шприц, содержащий 30% раствор сахарозы в левый желудочек сердца.
- Заливать раствор в размере ~ 2-5 мл в мин. Когда пуст, снимите шприц и повторите с 4% раствором PFA.
- Открепить мышь от пенополистирола лоток и обезглавить, чтобы получить доступ мозг.
- Снимите кожу вокруг головы животного, используя щипцы и ножницы. Совать отверстие в задней части черепа с иглой и осторожно удалите череп ножницами и щипцами рассекающих.
- После того, как мозг явно доступны, используйте щипцы для удаления мозжечка и поместить его в PBS. Пополам мозжечка в сагиттальной плоскости со скальпелем и передать 30% раствора сахарозы в течение ночи при 4 ° С. Примечание: Для того, чтобы подготовительныеявляются парафиновые срезы, исправить мозжечок в течение ночи при 4 ° С в 4% PFA до тканей вложения и секционирования.
4. Обработка и тканей Секционирование
- Приготовьте суспензию сухого льда и 2-метил бутана. Дайте температура ванны для уравновешивания в течение 5 мин.
- Заполните cryomold с ОКТ соединения и поместите одну половину пополам мозжечка в форму.
- Использование рассекает микроскоп и пинцет положении мозжечок, так что поверхность пополам (около средней линии мозжечка) вверх.
- Передача cryomold к сухим льдом суспензии в течение 5 мин, пока ОКТ соединение не образуется твердый белый матрицу вокруг образца ткани. Примечание: Замороженные пробы теперь можно хранить при -20 ° С в случае необходимости.
- Этикетка предварительно обработанных поли-лизин слайды для сбора срезов тканей и подготовить криостат в соответствии с инструкциями изготовителя для того, чтобы собрать 15 мкм разделы Сербеллум. Для сбора разделы, тщательно нами раздел OCT стороной с покрытием поли-лизин слайда. Чтобы сохранить ориентацию разделе, не повернуть слайд во время этого шага.
- Магазин тканей секции при -20 ° C до приступить окрашивания и визуализации.
5. Окрашивание и визуализации мозжечка разделах
- Подготовьте следующие решения до окрашивания ткани:
~ 50 мл PBS
~ 5-10 мл 4% PFA в PBS
~ 10-20 мл 0,5% Тритон Х-100, 10% сыворотки осла в PBS - Оттепель мозжечка разделов. Важно отметить, что свести к минимуму их воздействие на любого источника постоянного и интенсивного света, чтобы предотвратить выцветание EGFP.
- Использование гидрофобный барьер перо, нарисуйте прямоугольник вокруг участков ткани.
- После исправить разделы с 4% PFA в течение 5 мин. Использование достаточное количество жидкости, чтобы покрыть всю область, очерченной гидрофобного барьера (обычно ~ 500 мкл). Использование вакуума или пипетку, вновьпереместить фиксатор будучи особенно осторожны, чтобы не нарушить срезах тканей.
- С помощью пипетки, осторожно применять PBS на слайде, не нарушая срезах тканей. Через 5 мин использовать вакуум или пипетку тщательно удалить жидкость. Повторите PBS промыть в общей сложности три раза.
- С помощью пипетки, тщательно применять соответствующего разбавления первичных антител (3 мкл кальбиндин и / или Nesprin2 антитела на 900 мкл раствора) в 0,5% Triton X-100, 10% осла сыворотки в PBS. Инкубируют в течение одного часа при комнатной температуре в темноте.
Примечание: EGFP-KASH2 будут видны при непосредственном флуоресцентной микроскопии на замороженных срезах, и нет необходимости использовать антитела анти-EGFP. Однако, если парафиновые срезы были подготовлены, визуализация EGFP-KASH2 требует иммунологического с антителом анти-EGFP. - Удалить решение антител и промыть PBS три раза.
- Приготовьте 1: 1000 разведения Alexa Fluor-вторичными антителами в 0,5% Triton X-100,10% сыворотки осла в PBS и хранить в темноте.
- Осторожно удалить окончательный PBS промыть и применить разбавление вторичных антител в течение одного часа в темноте.
- Удалить решение вторичное антитело, промойте и мыть разделе три раза. При необходимости применяются окрашивающим ядра, например, DAPI (~ 300 нм), в течение первого применения PBS.
- Полностью удалить решение PBS по всему ткани и место ~ 5-7 мкл монтажа СМИ на участке ткани. Поставьте стакан покровное на вершине разделе ткани и отложите в течение ~ 15-30 минут при комнатной температуре в темноте.
- Используйте флуоресцентный микроскоп оснащен соответствующими фильтрами для визуализации EGFP и любые другие длины волн, подходящие для вторичных антител, используемых в шагах 5.8 / 5.9. В мозжечка ломтиками, использовать цель 20X, чтобы посмотреть EGFP-KASH2 ядерных диски.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Этот протокол иллюстрирует полезность (/ EGFP-KASH2 CAG-LacZ) модели мыши ТГ ограничить EGFP-KASH2 выражение мозжечка клеток Пуркинье с использованием ТГ (PCP2-CRE) мышей. В Tg (PCP2Cre CAG-EGFP / KASH2) потомство, то LacZ / V5 открытая рамка считывания вырезали в P6 на рекомбиназой Cre что приводит к экспрессии EGFP-KASH2, предназначенных специально для клеток Пуркинье (рис 2А). Как и ожидалось, EGFP-KASH2 предназначен для ядерной оболочки, как указано EGFP-положительных обода, как наблюдаемой картине вокруг ядра (Фигура 2В). Чтобы максимизировать любой физиологической фенотип, важно обеспечить, чтобы EGFP-KASH2 выражается в большинстве клеток-мишеней путем расчета процента EGFP-позитивных клеток KASH2, которые совместно окрашенных с помощью маркера клеточной специфических антител. В этом примере, выражение EGFP-KASH2 был обнаружен в более чем 70% кальбиндин-положительных клеток Пуркинье (рис 2b). В этих услония, мы не наблюдали каких-либо значительных гистологических или поведенческие фенотипы в 10 месячного Tg (PCP2Cre CAG-EGFP / KASH2) мышей 20. Важно обеспечить, чтобы любые морфологические или поведенческих фенотип не из-за эктопической экспрессии EGFP-KASH2 в непреднамеренного типа клеток / ткани. Для этой области, EGFP-KASH2 не наблюдалось в слое гранул клеток или молекулярном слое Tg (PCP2Cre CAG-EGFP-KASH2) мозжечка (Фигура 2В).
Наконец, важно, чтобы подтвердить степень ЛИНК сложной нарушения в клетках, экспрессирующих EGFP-KASH2. Это может быть достигнуто с использованием высококачественных анти-Nesprin антитела, чтобы подчеркнуть их смещение от NE клеток, экспрессирующих EGFP-KASH2. Как показано на рисунке 3, эндогенная Nesprin2 смещается от ядерной оболочки клеток Пуркинье, которые выражают EGFP-KASH2 (рис 3 верхняя панель, желтые стрелки), а клетки Пуркинье, которые не выразить EGFP-KASH2 Ретаэндогенного Nesprin2 в ядерной оболочке (Рисунок 3 верхняя панель, белая стрелка). Как и ожидалось, контрольные помета, которые не экспрессируют Cre-рекомбиназу, отображения Nesprin2 на ядерной оболочке всей клеток Пуркинье населения (рис 3 нижние белые стрелки). Несколько докладов уже подтвердили выражение EGFP-KASH2, сопровождается смещением эндогенных Nesprins, в дополнительных тканей и типов клеток, таких, как скелетных мышечных волокон и колбочек фоторецепторов 19,21.
Рисунок 1. ЛИНК комплексы подключения ядра к цитоскелета и нарушается избыточной экспрессии EGFP-KASH2. (A) изображение ЛИНК комплексов, которые соединяют интерьер ядра в цитоплазме цитоскелета. Обратите внимание, что SUN домены взаимодействуют с беспорядочно KASH доменовот всех Nesprins (Nesprins 1-4). (Б) Сверхэкспрессия EGFP-KASH2 вытесняет эндогенные Nesprins от ядерной оболочки в ER, в доминирующей негативном, таким образом, отсоединив ядро из окружающего цитоплазматической цитоскелета.
Рисунок 2. Избыточная экспрессия EGFP-KASH2 конкретно направлены на клетках Пуркинье мозжечка. (А) Разведение Tg (CAG-LacZ / EGFP-KASH2), чтобы Tg (PCP2-CRE) Результаты мыши в Tg (PCP2Cre CAG-EGFP-KASH2) потомства в котором Cre рекомбиназа выражается в частности в клетках Пуркинье мозжечка. При экспрессии (P6), АП рекомбиназа транслоцируется в ядро, где он акцизов на LacZ ORF и индуцирует экспрессию EGFP-KASH2. (B), ТГ (PCP2Cre CAG-EGFP-KASH2) мышей, специально выразить EGFP-KASH2 в клетках Пуркинье мозжечка IDENTIFIED с кальбиндин (окрашены в красный цвет). Отметим, что оба мозжечка гранул нейроны и интернейронов молекулярного слоя отрицательный выражения EGFP-KASH2. Сокращения: Минтруда: Молекулярная слой, PCL: Пуркинье слой клеток и ВКТ: Зерно слой клеток.
Рисунок 3. Нарушение эндогенных ЛИНК комплексов в клетках Пуркинье мозжечка. Одноместный самолет конфокальной показывая выражение EGFP-KASH2, что вытесняет эндогенные Nesprin2 (окрашены в красный цвет) от ядерной оболочки клеток Пуркинье (желтые стрелки вверху). Обратите внимание, что Пуркинье клетки, лишенные экспрессии EGFP-KASH2 поддерживать эндогенное Nesprin2 на их ядерной оболочке (белая стрелка вверху). В ТГ (КАГ-LacZ / EGFP-KASH2) управления помета, не EGFP сигнал не наблюдается и Nesprin2 обнаружен на ядерной оболочке всех Purki
Этот протокол иллюстрирует полезностьтемпературы стеклования (КАГ-LacZ / EGFP-KASH2) модель мыши, чтобы ограничить EGFP-KASH2 выражение мозжечка клеток Пуркинье с использованием ТГ (PCP2-CRE) мышей. В Tg (PCP2Cre CAG-EGFP / KASH2) потомство, то LacZ / V5 открытая рамка считывания вырезали в P6 на рекомбиназой Cre что приводит к экспрессии EGFP-KASH2, предназначенных специально для клеток Пуркинье (рис 2А). Как и ожидалось, EGFP-KASH2 предназначен для ядерной оболочки, как указано EGFP-положительных обода, как наблюдаемой картине вокруг ядра (Фигура 2В). Чтобы максимизировать любой физиологической фенотип, важно обеспечить, чтобы EGFP-KASH2 выражается в большинстве клеток-мишеней путем расчета процента EGFP-позитивных клеток KASH2, которые совместно окрашенных с помощью маркера клеточной специфических антител. В этом примере, выражение EGFP-KASH2 был обнаружен в более чем 70% кальбиндин-положительных клеток Пуркинье (рис 2b). В этих условиях, мы не наблюдали каких-либо значительных гистологических или behavioraл фенотипы в 10 месячного Tg (PCP2Cre CAG-EGFP / KASH2) мышей. 20 Важно обеспечить, чтобы любые морфологические или поведенческих фенотип не из-за эктопической экспрессии EGFP-KASH2 в непреднамеренного типа клеток / ткани. Для этой области, EGFP-KASH2 не наблюдалось в слое гранул клеток или молекулярном слое Tg (PCP2Cre CAG-EGFP-KASH2) мозжечка (Фигура 2В).
Наконец, важно, чтобы подтвердить степень ЛИНК сложной нарушения в клетках, экспрессирующих EGFP-KASH2. Это может быть достигнуто с использованием высококачественных анти-Nesprin антитела, чтобы подчеркнуть их смещение от NE клеток, экспрессирующих EGFP-KASH2. Как показано на рисунке 3, эндогенная Nesprin2 смещается от ядерной оболочки клеток Пуркинье, которые выражают EGFP-KASH2 (рис 3 верхняя панель, желтые стрелки), а клетки Пуркинье, которые не экспрессируют EGFP-KASH2 сохранить эндогенного Nesprin2 на ядерной оболочке (рис 3 (рис 3 нижние белые стрелки). Несколько докладов уже подтвердили выражение EGFP-KASH2, сопровождается смещением эндогенных Nesprins, в дополнительных тканей и типов клеток, таких, как скелетных мышечных волокон и колбочек фоторецепторов 19,21.
Рисунок 1. ЛИНК комплексы подключения ядра к цитоскелета и нарушается избыточной экспрессии EGFP-KASH2. (A) изображение ЛИНК комплексов, которые соединяют интерьер ядра в цитоплазме цитоскелета. Обратите внимание, что SUN домены взаимодействуют с беспорядочно KASH доменов со всего Nesprins (Nesprins 1-4). (Б) Избыточная ое EGFP-KASH2 вытесняет эндогенные Nesprins от ядерной оболочки в ER, в доминирующей негативном, таким образом, отсоединив ядро из окружающего цитоплазматической цитоскелета. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2. Избыточная экспрессия EGFP-KASH2 конкретно направлены на клетках Пуркинье мозжечка. (А) Разведение Tg (CAG-LacZ / EGFP-KASH2), чтобы Tg (PCP2-CRE) Результаты мыши в Tg (PCP2Cre CAG-EGFP-KASH2) потомства в котором Cre рекомбиназа выражается в частности в клетках Пуркинье мозжечка. При экспрессии (P6), АП рекомбиназа транслоцируется в ядро, где он акцизов на LacZ ORF и индуцирует экспрессию EGFP-KASH2. (Б) Tg (PCP2Cre CAG-EGFP-KASH2) Мышей, специально выразить EGFP-KASH2 в мозжечка клеток Пуркинье, выявленных с кальбиндин (окрашены в красный цвет). Отметим, что оба мозжечка гранул нейроны и интернейронов молекулярного слоя отрицательный выражения EGFP-KASH2. Сокращения: Минтруда: Молекулярная слой, PCL: Пуркинье слой клеток и ВКТ:. Гранула слой клеток Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3. Нарушение эндогенных ЛИНК комплексов в клетках Пуркинье мозжечка. Одноместный самолет конфокальной показывая выражение EGFP-KASH2, что вытесняет эндогенные Nesprin2 (окрашены в красный цвет) от ядерной оболочки клеток Пуркинье (желтые стрелки вверху). Обратите внимание, что Пуркинье клетки, лишенные экспрессии EGFP-KASH2 поддерживать эндогенное Nesprin2 на их ядерной оболочке (йотуе стрелка сверху). В ТГ (КАГ-LacZ / EGFP-KASH2) управления помета, не EGFP сигнал не наблюдается и Nesprin2 обнаружен на ядерной оболочке всех клеток Пуркинье (белые стрелки снизу). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Наиболее важным шагом для успешного изучения роли ЛИНК комплексов в естественных условиях, используя (/ EGFP-KASH2 CAG-LacZ) модель ТГ является определение подходящего мыши линии (ы) CRE. В самом деле, если Cre активен в других типов клеток, участвующих в подобных путей, это может усложнить интерпретацию результатов. Следовательно, важно, чтобы исследовать соседние клетки, как показано здесь в слоях молекулярных и клеточных гранул мозжечка (Фигура 2В). Кроме того, чтобы максимизировать любые физиологические соответствующие фенотипы важно определить нагрузку Cre с широким экспрессии Cre через типа клеток, представляющих интерес. Это также очень важно, чтобы провести углубленный характеристику паттерна экспрессии ЛИНК сложных компонентов во время разработки системы интересов. Действительно, недостаток (/ EGFP-KASH2 CAG-LacZ) мышиной модели Tg в том, что он не обеспечивает какую-либо информацию о том, какие белки Sun или варианты Nesprins участвуют в биологической системе UNDER рассмотрение. Тем не менее, эта проблема может быть преодолена путем проведения строгого характеристику как на транскриптов и белковых уровней. На самом деле, такие исследования были проведены в ряде случаев, которые привели к важным выводам о роли конкретных сложных компонентов ЛИНК при разработке ЦНС и гомеостаза 21,22.
Наконец, в то время как этот протокол ориентирован на использование основных тканей ЦНС, ТГ (КАГ-LacZ / EGFP-KASH2) мыши могут быть использованы для выделения и первичной культуры клеток для изучения влияния нарушая ЛИНК комплексы в пробирке. Используя эту схему, можно выделить и очистить первичных культур EGFP-KASH2-позитивных клеток для таких приложений, как покадровой видео микроскопии. Это обходит эффективность трансфекции или низкие Lentiviral производство, необходимое для первичных систем культуры, такие, как нейроны.
В целом, ТГ (КАГ-LacZ / EGFP-KASH2) мышей открыть новые и захватывающие возможности для изучения веселоие из ЛИНК комплексов в естественных условиях во время эмбрионального и постнатального развития млекопитающих процессов в самых разнообразных тканей и типов клеток для решения основных вопросов клеточной биологии.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего раскрывать.
Acknowledgments
Авторы выражают благодарность сотрудникам ядра морфологический и изображений, ядра Молекулярная генетика (Отдел офтальмологии и визуальных наук) и мыши генетики Ядра в Вашингтонском университете в Сент-Луисе школы медицины. Авторы поддержке программы малых грантов от McDonnell Центра клеточной и молекулярной нейробиологии, Надежда Центра неврологических расстройств, Национальный институт глаз (# R01EY022632 ЦТ), Национальный институт глазной центр Основные Грант (# P30EY002687) и неограниченный грант от исследований в области профилактики слепоты в отделении офтальмологии и визуальных наук.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S0389 | |
| 10x PBS | Gibco | 14200-075 | |
| 16% Paraformaldehyde Solution | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| OCT Compound | Tissue-Tek | 4583 | |
| Adhesion Slides | StatLab | M1000W | |
| Donkey Serum | Sigma Aldrich | D9663 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T9284 | |
| ImmuEdge Pen | Vector Laboratories | H-4000 | |
| Anti-Calbindin Antibody | Sigma Aldrich | C9848 | |
| Anti-EGFP Antibody | Abcam | ab13970 | |
| Anti-Nesprin2 Antibody | Previously described in Ref. 21 | ||
| Fluorescent Mounting Media | Dako | S3023 | |
| 2-methyl butane | Sigma Aldrich | O3551 |
References
- Hutchison, C. J. Lamins: building blocks or regulators of gene expression? Nature reviews. Molecular cell biology. 3, 848-858 (2002).
- Stuurman, N., Heins, S., Aebi, U. Nuclear lamins: their structure, assembly, and interactions. Journal of structural biology. 122, 42-66 (1998).
- Crisp, M., et al. Coupling of the nucleus and cytoplasm: role of the LINC complex. The Journal of cell biology. 172, 41-53 (2006).
- Haque, F., et al. SUN1 interacts with nuclear lamin A and cytoplasmic nesprins to provide a physical connection between the nuclear lamina and the cytoskeleton. Molecular and cellular biology. 26, 3738-3751 (2006).
- Hodzic, D. M., Yeater, D. B., Bengtsson, L., Otto, H., Stahl, P. D. Sun2 is a novel mammalian inner nuclear membrane protein. The Journal of biological chemistry. 279, 25805-25812 (2004).
- Starr, D. A. KASH and SUN proteins. Current biology : CB. 21, R414-R415 (2011).
- Mellad, J. A., Warren, D. T., Shanahan, C. M. Nesprins LINC the nucleus and cytoskeleton. Current opinion in cell biology. 23, 47-54 (2011).
- Fridolfsson, H. N., Starr, D. A. Kinesin-1 and dynein at the nuclear envelope mediate the bidirectional migrations of nuclei. The Journal of cell biology. 191, 115-128 (2010).
- Meyerzon, M., Fridolfsson, H. N., Ly, N., McNally, F. J., Starr, D. A. UNC-83 is a nuclear-specific cargo adaptor for kinesin-1-mediated nuclear migration. Development. 136, 2725-2733 (2009).
- Padmakumar, V. C., et al. Enaptin, a giant actin-binding protein, is an element of the nuclear membrane and the actin cytoskeleton. Experimental cell research. 295, 330-339 (2004).
- Roux, K. J., et al. Nesprin 4 is an outer nuclear membrane protein that can induce kinesin-mediated cell polarization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 2194-2199 (2009).
- Wilhelmsen, K., et al. a novel outer nuclear membrane protein, associates with the cytoskeletal linker protein plectin. The Journal of cell biology. 171, 799-810 (2005).
- Wilson, M. H., Holzbaur, E. L. Nesprins anchor kinesin-1 motors to the nucleus to drive nuclear distribution in muscle cells. Development. 142, 218-228 (2015).
- Yu, J., et al. KASH protein Syne-2/Nesprin-2 and SUN proteins SUN1/2 mediate nuclear migration during mammalian retinal development. Human molecular genetics. 20, 1061-1073 (2011).
- Zhang, X., et al. Syne-1 and Syne-2 play crucial roles in myonuclear anchorage and motor neuron innervation. Development. 134, 901-908 (2007).
- Zhang, J., et al. Nesprin 1 is critical for nuclear positioning and anchorage. Human molecular genetics. 19, 329-341 (2010).
- Stewart-Hutchinson, P. J., Hale, C. M., Wirtz, D., Hodzic, D. Structural requirements for the assembly of LINC complexes and their function in cellular mechanical stiffness. Experimental cell research. 314, 1892-1905 (2008).
- Zhang, X., et al. SUN1/2 and Syne/Nesprin-1/2 complexes connect centrosome to the nucleus during neurogenesis and neuronal migration in mice. Neuron. 64, 173-187 (2009).
- Razafsky, D., Hodzic, D. Temporal and tissue-specific disruption of LINC complexes in vivo. Genesis. 52, 359-365 (2014).
- Razafsky, D., Hodzic, D. A variant of Nesprin1 giant devoid of KASH domain underlies the molecular etiology of autosomal recessive cerebellar ataxia type I. Neurobiology of disease. 78, 57-67 (2015).
- Razafsky, D., Blecher, N., Markov, A., Stewart-Hutchinson, P. J., Hodzic, D. LINC complexes mediate the positioning of cone photoreceptor nuclei in mouse retina. PloS one. 7, e47180 (2012).
- Razafsky, D. S., Ward, C. L., Kolb, T., Hodzic, D. Developmental regulation of linkers of the nucleoskeleton to the cytoskeleton during mouse postnatal retinogenesis. Nucleus. 4, 399-409 (2013).
