Introduction
La envoltura nuclear (NE) separa el nucleoplasma del citoplasma. Se compone de una membrana nuclear interna y externa (INM y ONM, respectivamente) que se conectan en los poros nucleares. El lumen delimitado por ambas membranas se llama el espacio perinuclear (PNS). La ONM es una extensión del retículo endoplásmico rugoso (ER), y el INM se adhiere a la lámina nuclear, una malla de tipo nuclear-V filamentos intermedios representado por A y de tipo B laminas 1,2. Enlazadores de los complejos Citoesqueleto (LINC) nucleoesqueleto y son conjuntos macromoleculares que abarcan toda la envoltura nuclear para conectar físicamente el interior del núcleo a los filamentos del citoesqueleto y motores moleculares (Figura 1a). Se componen de interacciones entre evolutivamente conservados motivos que caracterizan a dos familias de proteínas transmembrana integrales de la NE: Sol (sad1 / Unc84) proteínas y Nesprins (Nuclear Sobre SPectRINS). En los mamíferos, Sun1 y Sun2 arproteínas transmembrana e del INM cuyo N-terminal nucleoplasmic región interactúa directamente con A y laminas de tipo B 3-5. En el otro lado del INM, dentro del PNS, las proteínas Sun Harbor un estiramiento-evolutiva conservada de ~ 150 aminoácidos C-terminal llamado el dominio dom Dominios SUN interactúan directamente con la KASH-evolutiva conservada (Klarsicht / ANC-1, Syne homología) de dominio, la firma molecular de Nesprins. KASH dominios consisten en un tramo de ~ 30 aminoácidos C-terminal que sobresale en el PNS seguido por un dominio transmembrana 6. Al menos cuatro genes nesprin distintas (Nesprin1-4) codifican KASH contienen proteínas que se localizan en el NE 7. Las regiones citoplasmáticas de Nesprins, cuyos tamaños varían de ~ 50 kDa (Nesprin4) a un sorprendente 1.000 kDa (gigante Nesprin1), contienen múltiples espectrina repite, así como los motivos específicos que permite su interacción con los componentes del citoesqueleto, tales como actina, plectina y motores moleculares 8- 13.
<p class = "jove_content"> Estudios en vertebrados e invertebrados han mostrado que Lamin / Sun / nesprin / motores moleculares constituyen un "eje" conservadas evolutivamente controlar la migración nuclear y anclaje. Varios knock-out (KO) modelos de ratón de componentes complejos LINC se han descrito y fueron fundamentales en la prestación de un marco para comprender las funciones de las proteínas Sol y nesprin en el NE durante el desarrollo de los mamíferos 9,14,15. Sin embargo, estos modelos presentan varios inconvenientes significativos, sobre todo: 1) de dificultad en la interpretación de los fenotipos debido a la celda efectos no autónomos, 2) la dificultad para distinguir las contribuciones fenotípicas de KASH contienen vs. KASH menos nesprin isoformas 16, 3) la redundancia funcional de las proteínas Sun y nesprin en el NE en numerosos tipos de células requiere esquemas de mejoramiento complejos para inactivar todas las interacciones dom-KASH en ratones 17 y 4) la letalidad perinatal de ratones deficientes para el KASH-dominio de ambosNesprins1 y 2 impide el análisis de adultos fenotipos 18.Este protocolo describe un modelo de ratón novedoso diseñado para interrumpir todas las interacciones dom-KASH in vivo, en una célula de manera autónoma y regulado por el desarrollo, evitando así muchos de los inconvenientes descritos anteriormente. Este / modelo de ratón basada en lox Cre se basa en dos conceptos importantes: 1) el dominio KASH de cualquier proteína nesprin conocido es suficiente para dirigir EGFP a la NE en sistemas de cultivo celular y 2) dominios SUN interactuar promiscuamente con dominios Kash, por tanto, la sobreexpresión de cualquier dominio KASH saturará todos los dominios SUN endógenos e inactivar complejos LINC de una manera dominante negativo 17 (Figura 1B). Este protocolo describe la cosecha de tejidos y etapas de procesamiento utilizadas para confirmar la interrupción de todas las interacciones dom-KASH en las células de Purkinje del cerebelo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Declaración de Ética: Procedimientos en seres animales fueron aprobadas por el Cuidado y Uso de Animales Comité Institucional (IACUC) de la Universidad de Washington en St. Louis.
1. Ratón Cría y Genotipado
- Raza ratones Tg Tg (CAG-LacZ / EGFP-KASH2) (PCP2-Cre) ratones para producir Tg (PCP2Cre CAG-EGFP / KASH2) 19,20. Nota: Mientras que el resto de este protocolo se centra en el uso de la línea de Tg (PCP2-Cre) del ratón para restringir EGFP-KASH2 expresión a las células de Purkinje en el cerebelo, un procedimiento similar puede ser seguido con cualquier otro Tg (Cre) ratón ( Figura 2A).
- Realizar genotipado para identificar los cachorros que albergan ambos transgenes EGFP y Cre como se describió anteriormente 19.
2. Preparación de los materiales para la disección y Tissue Collection
- Preparar 100 ml de 30% de sacarosa en PBS (30 g de sacarosa / 100 ml de PBS 1x) y se almacena a -20 ° C. El día de tejido harvesting, deshielo y la carga ~ 30-35 ml de solución de sacarosa en una jeringa de 35 ml para perfusiones transcardial.
- Preparar 40 ml de PFA al 4% en PBS (10 ml 16% de paraformaldehído y 30 ml de PBS). Cargar ~ de 30-35 ml de PFA al 4% en una jeringa de 35 ml para perfusiones transcardial.
- Llenar una placa de cultivo tisular de 10 cm con 10 ml de PBS para la disección de tejidos.
- Preparar un cóctel de ketamina / xilazina que consiste en 16 mg / ml de ketamina y 3 mg / ml de xilazina.
- Preparar una solución de etanol al 70% para la disección.
3. La disección y Tissue Collection
- Usando una jeringa de 1 ml, inyectar 500 l de cóctel de ketamina el / xilazina por cada 25 gramos de peso corporal y esperar a ~ 15 min. Alternativamente, utilizar otro método aprobado institucionalmente sedación que es apropiado para el sistema biológico de interés.
- Tras la sedación, pellizque suavemente la pata trasera para confirmar la falta de respuesta al dolor, fijar todas las patas en una bandeja de espuma de poliestireno con la cara dorsal de ladel ratón hacia abajo.
- Pulverizar el abdomen con 70% de etanol y hacer una incisión desde el abdomen inferior a la parte superior de la caja torácica para obtener acceso al corazón.
- Hacer una pequeña incisión en la aurícula derecha del corazón y de insertar la jeringa que contiene la solución de sacarosa al 30% en el ventrículo izquierdo del corazón.
- Perfundir la solución a una velocidad de ~ 2 a 5 ml por min. Cuando está vacío, retire la jeringa y repita con la solución de PFA 4%.
- Liberar el ratón de la bandeja de espuma de poliestireno y decapitar para acceder al cerebro.
- Retire la piel alrededor de la cabeza del animal con unas pinzas y tijeras. Haga un agujero en la parte posterior del cráneo con una aguja y retire con cuidado el cráneo con tijeras y pinzas de disección.
- Una vez que el cerebro es claramente accesible, utilizar pinzas para quitar el cerebelo y colocarlo en PBS. Dividir en dos el cerebelo en el plano sagital con un escalpelo y transferir a la solución de sacarosa al 30% durante la noche a 4 ° C. Nota: Para prepararson secciones de parafina, fijar el cerebelo durante la noche a 4 ° C en el 4% PFA antes de la incrustación de tejidos y seccionamiento.
4. Procesamiento de tejidos y Seccionamiento
- Preparar una suspensión de hielo seco y butano 2-metilo. Dejar que la temperatura del baño se equilibre durante 5 min.
- Llene una criomolde con compuesto de octubre y coloque una media del cerebelo biseccionado en el molde.
- Usando un microscopio de disección y un par de fórceps posición el cerebelo manera que la superficie dividida en dos partes (cerca de la línea media del cerebelo) quede hacia arriba.
- Transferir el criomolde a la suspensión de hielo seco durante 5 min hasta que el compuesto OCT ha formado un sólido blanco alrededor de matriz de la muestra de tejido. Nota: la muestra congelada ahora se pueden almacenar a -20 ° C si es necesario.
- Label diapositivas poli-lisina pre-tratada para la recogida de las secciones de tejido y preparar el criostato de acuerdo con las instrucciones del fabricante con el fin de recoger 15 micras secciones de la cerebellum. Para recoger las secciones, póngase en contacto con atención la sección de octubre con el lado revestido de poli-lisina de la diapositiva. Para preservar la orientación de la sección, no gire la diapositiva durante este paso.
- Secciones de tejido tienda a -20 ° C hasta proceder a la tinción y de imagen.
5. La tinción e Imagen de Cerebelo Secciones
- Preparar las siguientes soluciones antes de la tinción de tejidos:
~ 50 ml de PBS
~ 5-10 ml de PFA al 4% en PBS
~ 10-20 ml de 0,5% Triton X-100, 10% de suero de burro en PBS - Secciones de cerebelo deshielo. Es importante destacar que minimizar su exposición a cualquier fuente de luz continua e intensa para prevenir la decoloración de EGFP.
- El uso de una barrera hidrofóbica lápiz, dibujar un rectángulo alrededor de las secciones de tejido.
- Post-fijar las secciones con 4% PFA durante 5 min. Use suficiente líquido para cubrir toda el área delimitada por la barrera hidrofóbica (normalmente ~ 500 l). El uso de un vacío o pipeta, remover el fijador particularmente cuidado de no molestar a los cortes de tejido.
- Con una pipeta, aplicar suavemente PBS sobre el portaobjetos sin molestar a las secciones de tejido. Después de 5 min utilizar el vacío o pipeta para retirar con cuidado el líquido. Repita el enjuague de PBS un total de tres veces.
- Con una pipeta, aplicar cuidadosamente la dilución adecuada de anticuerpos primarios (3 l Calbindin y / o anticuerpo Nesprin2 por 900 l de solución) en 0,5% de Triton X-100, 10% de suero de burro en PBS. Incubar durante una hora a temperatura ambiente en la oscuridad.
Nota: EGFP-KASH2 será visible por microscopía de fluorescencia directa sobre secciones congeladas, y no es necesario utilizar un anticuerpo anti-EGFP. Sin embargo, si se han preparado las secciones de parafina, formación de imágenes de EGFP-KASH2 requiere inmunodetección con un anticuerpo anti-EGFP. - Retire la solución de anticuerpo y enjuague con PBS tres veces.
- Preparar 1: 1.000 diluciones de Alexa-Fluor anticuerpos secundarios en 0,5% Triton X-100,10% de suero de burro en PBS y almacenar en la oscuridad.
- Retire con cuidado el enjuague final PBS y aplicar la dilución de anticuerpo secundario durante una hora en la oscuridad.
- Retire la solución de anticuerpo secundario, aclarar y lavar la sección tres veces. Si es necesario, aplicar una mancha nuclear, tales como DAPI (~ 300 nM), durante la primera aplicación PBS.
- Completamente eliminar la solución PBS de todo el tejido y el lugar ~ 5.7 l de medios de montaje en la sección de tejido. Coloque un cubreobjetos de vidrio en la parte superior de la sección de tejido y dejar de lado por unos 15-30 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad.
- Utilice un microscopio de fluorescencia equipado con los filtros apropiados para visualizar EGFP y cualesquiera otras longitudes de onda adecuadas para los anticuerpos secundarios utilizados en los pasos 5.8 / 5.9. En rebanadas del cerebelo, utilice un objetivo 20X para ver llantas nucleares EGFP-KASH2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Este protocolo ilustra la utilidad de la (/ EGFP-KASH2 CAG-LacZ) modelo de ratón Tg para restringir EGFP-KASH2 expresión a las células de Purkinje del cerebelo utilizando TG (PCP2-CRE) ratones. En Tg (PCP2Cre CAG-EGFP / KASH2) descendencia, el marco de lectura abierto LacZ / V5 se escinde en P6 por la Cre recombinasa lo que conduce a la expresión de EGFP-KASH2 dirigida específicamente a las células de Purkinje (Figura 2A). Como era de esperar, EGFP-KASH2 está dirigido a la envoltura nuclear como se indica por el patrón de llanta como EGFP-positiva observada alrededor del núcleo (Figura 2B). Para maximizar cualquier fenotipo fisiológico, es importante asegurarse de que EGFP-KASH2 se expresa en la mayoría de las células diana mediante el cálculo del porcentaje de células EGFP-KASH2 positivas que están co-tiñe con un marcador de anticuerpo específico de la célula. En este ejemplo, se detectó la expresión de EGFP-KASH2 en más de 70% de las células de Purkinje Calbindin-positivos (Figura 2B). En estas condiciones, que no observaron ningún fenotipos histológicos o de comportamiento significativos en 10 meses de edad, Tg (PCP2Cre CAG-EGFP / KASH2) ratones 20. Es importante asegurarse de que cualquier fenotipo morfológico o de comportamiento no se debe a la expresión ectópica de EGFP-KASH2 en un tipo de célula / tejido no deseado. Al respecto, EGFP-KASH2 no se observó en la capa de células granulares o la capa molecular de Tg (PCP2Cre CAG-EGFP-KASH2) cerebella (Figura 2B).
Por último, es vital para confirmar el alcance de LINC interrupción complejo en células que expresan EGFP-KASH2. Esto puede lograrse utilizando anticuerpos anti-nesprin de alta calidad para enfatizar su desplazamiento desde el NE de células que expresan EGFP-KASH2. Como se muestra en la Figura 3, endógeno Nesprin2 se desplaza de la envoltura nuclear de las células de Purkinje que expresan EGFP-KASH2 (Figura 3 panel superior, flechas amarillas) mientras que las células de Purkinje que no expresan EGFP-KASH2 retaen endógena Nesprin2 la envoltura nuclear (panel superior Figura 3, flecha blanco). Como era de esperar, los compañeros de camada de control, que no expresan Cre-recombinasa, muestran Nesprin2 en la envoltura nuclear de toda la población de células de Purkinje (Figura 3 flechas blancas de fondo). Varios informes han confirmado la expresión de EGFP-KASH2, acompañado por el desplazamiento de Nesprins endógenos, en los tejidos y tipos de células adicionales tales como fibras de músculo esquelético y conos fotorreceptores 19,21.
Figura 1. complejos LINC conectan el núcleo hasta el citoesqueleto y se interrumpen por la sobreexpresión de EGFP-KASH2. (A) Representación de los complejos de LINC que conectan el interior del núcleo al citoesqueleto citoplásmica. Tenga en cuenta que los dominios SUN promiscuamente interactúan con dominios KASHde todas Nesprins (Nesprins 1-4). (B) La sobreexpresión de EGFP-KASH2 desplaza Nesprins endógenos de la envoltura nuclear a la ER, de una forma dominante negativa, desconectando de este modo el núcleo desde el citoesqueleto citoplásmico circundante.
Figura 2. La sobreexpresión de EGFP-KASH2 dirige específicamente a las células de Purkinje cerebelosos. (A) Cría de Tg (CAG-LacZ / EGFP-KASH2) de Tg (PCP2-Cre) ratones resulta en Tg (PCP2Cre CAG-EGFP-KASH2) descendencia en el que la recombinasa Cre se expresa específicamente en las células de Purkinje del cerebelo. Tras la expresión (P6), la recombinasa Cre se transloca en el núcleo donde se escinde el ORF LacZ e induce la expresión de EGFP-KASH2. (B) Tg (PCP2Cre CAG-EGFP-KASH2) ratones expresan específicamente EGFP-KASH2 en las células de Purkinje del cerebelo identified con Calbindin (en color rojo). Tenga en cuenta que tanto las neuronas granulares del cerebelo y las interneuronas de la capa molecular son negativas para la expresión EGFP-KASH2. Abreviaturas: MoL: capa molecular, PCL: la capa de células de Purkinje y GCL: capa de células granulares.
Figura 3. La alteración de los complejos LINC endógenos en las células de Purkinje del cerebelo. Solo plano confocal que muestra la expresión de EGFP-KASH2 que desplaza Nesprin2 endógena (en color rojo) de la envoltura nuclear de las células de Purkinje (flechas amarillas arriba). Ten en cuenta que las células de Purkinje que carecen de expresión EGFP-KASH2 mantienen endógena Nesprin2 en su envoltura nuclear (blanco flecha arriba). En Tg (CAG-LacZ / EGFP-KASH2) compañeros de camada de control, no se observa ninguna señal de EGFP y Nesprin2 es detectado en la envoltura nuclear de todos Purki
Este protocolo ilustra la utilidad dela Tg (CAG-LacZ / EGFP-KASH2) modelo de ratón para restringir EGFP-KASH2 expresión a las células de Purkinje del cerebelo utilizando Tg (PCP2-Cre) ratones. En Tg (PCP2Cre CAG-EGFP / KASH2) descendencia, el marco de lectura abierto LacZ / V5 se escinde en P6 por la Cre recombinasa lo que conduce a la expresión de EGFP-KASH2 dirigida específicamente a las células de Purkinje (Figura 2A). Como era de esperar, EGFP-KASH2 está dirigido a la envoltura nuclear como se indica por el patrón de llanta como EGFP-positiva observada alrededor del núcleo (Figura 2B). Para maximizar cualquier fenotipo fisiológico, es importante asegurarse de que EGFP-KASH2 se expresa en la mayoría de las células diana mediante el cálculo del porcentaje de células EGFP-KASH2 positivas que están co-tiñe con un marcador de anticuerpo específico de la célula. En este ejemplo, se detectó la expresión de EGFP-KASH2 en más de 70% de las células de Purkinje Calbindin-positivos (Figura 2B). En estas condiciones, no observamos ninguna histológico o behaviora significatival fenotipos en 10 meses de edad, los ratones Tg (PCP2Cre CAG-EGFP / KASH2) 20. Es importante asegurarse de que cualquier fenotipo morfológico o de comportamiento no se debe a la expresión ectópica de EGFP-KASH2 en un tipo de célula / tejido no deseado. Al respecto, EGFP-KASH2 no se observó en la capa de células granulares o la capa molecular de Tg (PCP2Cre CAG-EGFP-KASH2) cerebella (Figura 2B).
Por último, es vital para confirmar el alcance de LINC interrupción complejo en células que expresan EGFP-KASH2. Esto puede lograrse utilizando anticuerpos anti-nesprin de alta calidad para enfatizar su desplazamiento desde el NE de células que expresan EGFP-KASH2. Como se muestra en la Figura 3, endógeno Nesprin2 se desplaza de la envoltura nuclear de las células de Purkinje que expresan EGFP-KASH2 (Figura 3 panel superior, flechas amarillas) mientras que las células de Purkinje que no expresan EGFP-KASH2 retener endógena Nesprin2 en la envoltura nuclear (Figura 3 (Figura 3 flechas blancas de fondo). Varios informes han confirmado la expresión de EGFP-KASH2, acompañado por el desplazamiento de Nesprins endógenos, en los tejidos y tipos de células adicionales tales como fibras de músculo esquelético y conos fotorreceptores 19,21.
Figura 1. complejos LINC conectan el núcleo hasta el citoesqueleto y se interrumpen por la sobreexpresión de EGFP-KASH2. (A) Representación de los complejos de LINC que conectan el interior del núcleo al citoesqueleto citoplásmica. Tenga en cuenta que los dominios SUN interactúan promiscuamente con dominios KASH de todo Nesprins (Nesprins 1-4). (B) La sobreexpresión of EGFP-KASH2 desplaza Nesprins endógenos de la envoltura nuclear a la sala de emergencia, de manera negativa dominante, desconectando así el núcleo del citoesqueleto citoplásmica circundante. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. La sobreexpresión de EGFP-KASH2 dirige específicamente a las células de Purkinje cerebelosos. (A) Cría de Tg (CAG-LacZ / EGFP-KASH2) de Tg (PCP2-Cre) ratones resulta en Tg (PCP2Cre CAG-EGFP-KASH2) descendencia en el que la recombinasa Cre se expresa específicamente en las células de Purkinje del cerebelo. Tras la expresión (P6), la recombinasa Cre se transloca en el núcleo donde se escinde el ORF LacZ e induce la expresión de EGFP-KASH2. (B) Tg (PCP2Cre CAG-EGFP-KASH2) Ratones específicamente expresar EGFP-KASH2 en las células de Purkinje del cerebelo identificados con Calbindin (coloreado en rojo). Tenga en cuenta que tanto las neuronas granulares del cerebelo y las interneuronas de la capa molecular son negativas para la expresión EGFP-KASH2. Abreviaturas: MoL: capa molecular, PCL: capa de células de Purkinje y GCL:. Capa de células granulares Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. La alteración de los complejos LINC endógenos en las células de Purkinje del cerebelo. Solo plano confocal que muestra la expresión de EGFP-KASH2 que desplaza Nesprin2 endógena (en color rojo) de la envoltura nuclear de las células de Purkinje (flechas amarillas arriba). Tenga en cuenta que las células de Purkinje que carecen de expresión EGFP-KASH2 mantienen endógena Nesprin2 en su envoltura nuclear (white flecha arriba). En Tg (CAG-LacZ / EGFP-KASH2) de camada de control, no se observa ninguna señal de EGFP y Nesprin2 se detecta en la envoltura nuclear de todas las células de Purkinje (flechas blancas abajo). Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
El paso más crítico para estudiar con éxito el papel de los complejos de LINC in vivo utilizando el modelo de Tg (CAG-LacZ / EGFP-KASH2) es identificar una línea de ratones Cre adecuado (s). En efecto, si Cre está activo en otros tipos de células implicados en las vías similares, se puede complicar la interpretación de los resultados. Por lo tanto, es importante examinar las células cercanas, como se muestra aquí en las capas celulares moleculares y granulares del cerebelo (Figura 2B). Del mismo modo, para maximizar cualquier fenotipos fisiológicamente relevantes es importante para identificar una cepa Cre con expresión Cre generalizada en todo el tipo celular de interés. También es vital para llevar a cabo una caracterización en profundidad del patrón de expresión de componentes complejos LINC durante el desarrollo del sistema de interés. De hecho, un inconveniente del (/ EGFP-KASH2 CAG-LacZ) modelo de ratón Tg es que no proporciona ninguna información en cuanto a que las proteínas Sun o variantes Nesprins están involucrados en el sistema biológico uconsideración nder. Sin embargo, este problema se puede superar mediante la realización de una caracterización rigurosa, tanto a nivel de transcripción y proteínas. De hecho, este tipo de estudios se han realizado en varias ocasiones que condujeron a conclusiones importantes sobre el papel de los componentes complejos específicos LINC durante el desarrollo del SNC y la homeostasis 21,22.
Por último, mientras que este protocolo se centra en el uso de tejidos del SNC fijos, Tg (CAG-LacZ / EGFP-KASH2) los ratones se puede utilizar para aislar y cultivar células primarias para estudiar el efecto de interrumpir complejos LINC in vitro. Utilizando este esquema, es posible aislar y purificar cultivos primarios de células EGFP-KASH2-positivos para aplicaciones tales como la microscopía de vídeo de lapso de tiempo. Esto evita bajas eficiencias de transfección o la producción lentiviral requerida para sistemas de cultivo primarios, tales como neuronas.
En resumen, los (/ EGFP-KASH2 CAG-lacZ) ratones Tg abren nuevas y excitantes posibilidades para el estudio de la diversióncción de complejos LINC en vivo durante los procesos de desarrollo de mamíferos embrionarias y postnatales en una amplia variedad de tejidos y tipos celulares para abordar cuestiones básicas de biología celular.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Los autores agradecen al personal del núcleo Morfología e Imagen, del núcleo de Genética Molecular (Departamento de Oftalmología y Ciencias Visuales) y del ratón Genética Core en la Universidad de Washington en St. Louis Escuela de Medicina. Los autores son apoyados por el programa de pequeñas donaciones del centro McDonnell Celular y Neurobiología Molecular, el Centro Esperanza de Trastornos Neurológicos, el Instituto Nacional del Ojo (# R01EY022632 a DH), un Instituto Oftalmológico Centro Nacional Core Grant (# P30EY002687) y un subvención sin restricciones de Investigación de Prevención de la Ceguera en el Departamento de Oftalmología y Ciencias Visuales.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S0389 | |
| 10x PBS | Gibco | 14200-075 | |
| 16% Paraformaldehyde Solution | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| OCT Compound | Tissue-Tek | 4583 | |
| Adhesion Slides | StatLab | M1000W | |
| Donkey Serum | Sigma Aldrich | D9663 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T9284 | |
| ImmuEdge Pen | Vector Laboratories | H-4000 | |
| Anti-Calbindin Antibody | Sigma Aldrich | C9848 | |
| Anti-EGFP Antibody | Abcam | ab13970 | |
| Anti-Nesprin2 Antibody | Previously described in Ref. 21 | ||
| Fluorescent Mounting Media | Dako | S3023 | |
| 2-methyl butane | Sigma Aldrich | O3551 |
References
- Hutchison, C. J. Lamins: building blocks or regulators of gene expression? Nature reviews. Molecular cell biology. 3, 848-858 (2002).
- Stuurman, N., Heins, S., Aebi, U. Nuclear lamins: their structure, assembly, and interactions. Journal of structural biology. 122, 42-66 (1998).
- Crisp, M., et al. Coupling of the nucleus and cytoplasm: role of the LINC complex. The Journal of cell biology. 172, 41-53 (2006).
- Haque, F., et al. SUN1 interacts with nuclear lamin A and cytoplasmic nesprins to provide a physical connection between the nuclear lamina and the cytoskeleton. Molecular and cellular biology. 26, 3738-3751 (2006).
- Hodzic, D. M., Yeater, D. B., Bengtsson, L., Otto, H., Stahl, P. D. Sun2 is a novel mammalian inner nuclear membrane protein. The Journal of biological chemistry. 279, 25805-25812 (2004).
- Starr, D. A.
- Mellad, J. A., Warren, D. T., Shanahan, C. M. Nesprins LINC the nucleus and cytoskeleton. Current opinion in cell biology. 23, 47-54 (2011).
- Fridolfsson, H. N., Starr, D. A. Kinesin-1 and dynein at the nuclear envelope mediate the bidirectional migrations of nuclei. The Journal of cell biology. 191, 115-128 (2010).
- Meyerzon, M., Fridolfsson, H. N., Ly, N., McNally, F. J., Starr, D. A. UNC-83 is a nuclear-specific cargo adaptor for kinesin-1-mediated nuclear migration. Development. 136, 2725-2733 (2009).
- Padmakumar, V. C., et al. Enaptin, a giant actin-binding protein, is an element of the nuclear membrane and the actin cytoskeleton. Experimental cell research. 295, 330-339 (2004).
- Roux, K. J., et al. Nesprin 4 is an outer nuclear membrane protein that can induce kinesin-mediated cell polarization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 2194-2199 (2009).
- Wilhelmsen, K., et al. a novel outer nuclear membrane protein, associates with the cytoskeletal linker protein plectin. The Journal of cell biology. 171, 799-810 (2005).
- Wilson, M. H., Holzbaur, E. L. Nesprins anchor kinesin-1 motors to the nucleus to drive nuclear distribution in muscle cells. Development. 142, 218-228 (2015).
- Yu, J., et al. KASH protein Syne-2/Nesprin-2 and SUN proteins SUN1/2 mediate nuclear migration during mammalian retinal development. Human molecular genetics. 20, 1061-1073 (2011).
- Zhang, X., et al. Syne-1 and Syne-2 play crucial roles in myonuclear anchorage and motor neuron innervation. Development. 134, 901-908 (2007).
- Zhang, J., et al. Nesprin 1 is critical for nuclear positioning and anchorage. Human molecular genetics. 19, 329-341 (2010).
- Stewart-Hutchinson, P. J., Hale, C. M., Wirtz, D., Hodzic, D. Structural requirements for the assembly of LINC complexes and their function in cellular mechanical stiffness. Experimental cell research. 314, 1892-1905 (2008).
- Zhang, X., et al. SUN1/2 and Syne/Nesprin-1/2 complexes connect centrosome to the nucleus during neurogenesis and neuronal migration in mice. Neuron. 64, 173-187 (2009).
- Razafsky, D., Hodzic, D. Temporal and tissue-specific disruption of LINC complexes in vivo. Genesis. 52, 359-365 (2014).
- Razafsky, D., Hodzic, D. A variant of Nesprin1 giant devoid of KASH domain underlies the molecular etiology of autosomal recessive cerebellar ataxia type I. Neurobiology of disease. 78, 57-67 (2015).
- Razafsky, D., Blecher, N., Markov, A., Stewart-Hutchinson, P. J., Hodzic, D. LINC complexes mediate the positioning of cone photoreceptor nuclei in mouse retina. PloS one. 7, e47180 (2012).
- Razafsky, D. S., Ward, C. L., Kolb, T., Hodzic, D. Developmental regulation of linkers of the nucleoskeleton to the cytoskeleton during mouse postnatal retinogenesis. Nucleus. 4, 399-409 (2013).
