Introduction
Nükleer zarf (NE) Sitoplazmadan nükleolazma ayırır. Nükleer gözeneklerin bağlamak bir iç ve bir dış çekirdek zarı (INM sırasıyla Onm,) oluşmaktadır. Her iki membranlarla tarif lümen perinükleer alanı (PNS) olarak adlandırılır. Onm granüllü endoplazmik retikulum (ER) bir uzantısı olan ve INM nükleer lamina yapışır, A ve B tipi ile temsil edilen çekirdek tip V ara ipliklerin bir ağ örgüsü 1,2 lamins. Nucleoskeleton ve hücre iskeleti (LINC) komplekslerinin bağlayıcılar fiziksel iskelet ipliklerin ve moleküler motorlar (Şekil 1A) çekirdeğin iç bağlamak için bütün çekirdek zarfı kapsayan makromoleküler monte edilmiş halleridir. Güneş (Sad1 / Unc84) proteinler ve Nesprins (Nükleer Zarf SPectRINS): Bunlar KD ayrılmaz transmembran proteinlerinin iki aileyi karakterize evrimsel korunmuş motiflerinin arasındaki etkileşimleri oluşur. Memelilerde, Sun1 ve Sun2 arN-terminal bölgesi nucleoplasmic A ve B tipi lamins 3-5 ile doğrudan etkileşip etkileşmediği INM e transmembran proteinleridir. PNS içinde INM diğer tarafında, Sun proteinler 150 C-terminal amino asitler, SUN alanı adı verilen ~ evrimsel korunmamış streç barındırır. SUN etki evrimsel korunmuş Kash ile doğrudan etkileşim (Klarsicht / Anc-1, Syne Homology) etki, Nesprins moleküler imza. Kash etki, bir zar geçiş alanı 6 ve ardından PNS içine çıkıntı ~ 30 C-terminal amino asidi bir streç oluşur. En az dört farklı Nesprin genler (Nesprin1-4) NE 7 lokalize proteinler Kash içeren kodlar. Şaşırtıcı bir 1000 kDa (Nesprin1 dev) için boyutları değişir ~ 50kDa (Nesprin4) den Nesprins, sitoplazmik bölgeleri, çoklu spektrin gibi aktin, plectin ve moleküler motorlar 8- olarak iskelet bileşenleri ile etkileşimi sağlayarak tekrar yanı sıra özel motifler içeriyor 13.
<omurgalı ve omurgasız p class = "jove_content"> Araştırmalar Lamin / Güneş / Nesprin / moleküler motorlar bir evrimsel olarak korunmuş "eksen" nükleer göç ve ankraj kontrol teşkil ettiğini göstermiştir. Linc karmaşık bileşenlerin çeşitli knock-out (KO) fare modelleri tanımlanmış ve memeli gelişim 9,14,15 sırasında KD Sun ve Nesprin proteinlerinin rollerini anlamak için bir çerçeve sağlayan aracı vardı oylandı. Ancak, bu modeller en önemlisi mevcut birçok önemli sakıncaları: of fenotipik katkılarını ayırt olmayan özerk etkileri, 2) zorluk hücre nedeniyle fenotipleri yorumlarken 1) zorluk Kash-az Nesprin vs Kash içeren, 3) 16 izoformları Çok sayıda hücre tiplerinde NE Sun ve Nesprin proteinlerin işlevsel fazlalık hem Kash-etki alanı için eksik farelerde 17 tüm SUN-Kash etkileşimleri ve farelerin 4) perinatal öldürücülüğü inaktive karmaşık ıslah planları gerektirirNesprins1 ve 2 yetişkin analizi 18 fenotip engellemektedir.Bu protokol, böylece yukarıda özetlenen sakıncaları birçok atlayarak bir hücre özerk ve gelişimsel olarak düzenlenen bir şekilde in vivo tüm SUN-Kash etkileşimleri bozmak için tasarlanmış yeni bir fare modeli açıklanmaktadır. Bu Cre / lox tabanlı fare modeli, iki önemli kavramları dayanır: 1) bilinen herhangi bir Nesprin proteininin Kash alanı hücre kültür sistemlerinde KD EGFP hedef ve 2) SUN etki fazla sentezlenmesi, böylece, Kash etki alanları ile etkileşime promiscuously için yeterlidir Herhangi Kash etki tüm endojen Paz etki doyurmak ve dominant-negatif bir şekilde 17 (Şekil 1B) Linc kompleksleri inaktive edecek. Bu protokol, doku hasat ve serebellar Purkinje hücrelerinde tüm SUN-Kash etkileşimlerinin bozulması doğrulamak için kullanılan işlem adımları açıklar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Etik Beyanı: Hayvan denekleri Prosedürler St. Louis Washington Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır.
1. Fare Islahı ve Genotiplendirme
- (PCP2Cre CAG-EGFP / KASH2) 19,20 Tg üretmek için Tg (CAG-LacZ / EGFP-KASH2) Tg fareler (PCP2-Cre) fareler Breed. Not: Bu protokol kalanı serebellumdaki Purkinje hücreleri EGFP-KASH2 ekspresyonunu sınırlamak için Tg (PCP2-Cre) fare hattı kullanımı üzerinde odaklanmasına rağmen, benzer bir prosedür başka Tg (Cre) fare ile takip edilebilir ( Şekil 2A).
- Daha önce açıklandığı gibi 19 hem EGFP ve Cre transgenini barındıran yavrular tanımlamak için genotipleme gerçekleştirin.
Diseksiyon ve Doku Koleksiyonu için Materyallerin 2. Hazırlık
- -20 ° C'de% 30 PBS sükroz (1x PBS 30 g sükroz / 100 mi) ve deposunun 100 ml hazırlayın. Doku h günlüktranscardial perfüzyonları bir 35 ml şırınganın içine arvesting, çözündürme ve sukroz çözeltisi yük ~ 30-35 ml olmuştur.
- PBS içinde% 4 PFA 40 ml (10 mi,% 16 paraformaldehit ve 30 ml PBS) hazırlayın. Transcardial perfüzyonları için 35 ml şırınganın içine Yük ~ 30-35 ml% 4 PFA.
- Doku diseksiyon 10 ml PBS ile bir 10 cm'lik bir doku kültürü plağı doldurun.
- 16 mg / ml ketamin ve 3 mg / ml ksilazin içeren bir ketamin / ksilazin kokteyli hazırlanır.
- Diseksiyon için% 70 etanol içinde bir çözelti hazırlayın.
3. Diseksiyon ve Doku Koleksiyonu
- Bir tane 1 ml'lik şırınga kullanılarak, vücut ağırlığının her 25 gramı için, ketamin / ksilazin kokteyli 500 ul enjekte edilir ve 15 dakika ~ bekleyin. Alternatif olarak, ilgi biyolojik sistemine uygun olan başka bir kurumsal onaylı sedasyon yöntemi kullanın.
- Sedasyon üzerine hafifçe dorsal tarafı ile strafor tepsi üzerinde tüm pençeleri pin, ağrı yanıtı eksikliği onaylamak için arka pençe tutamfare aşağı bakacak.
- % 70 etanol ile karın Sprey ve kalp erişmek için göğüs kafesinin üst alt karın bir kesi yapmak.
- Kalbin sağ atrium küçük bir kesi yapmak ve kalbin sol ventrikül içine% 30 sukroz çözeltisi içeren şırınga yerleştirin.
- ~ 2-5 mi başına dakika bir hızda çözelti serpmek. Ne zaman boş şırınga kaldırmak ve% 4 PFA çözümü ile tekrarlayın.
- Strafor tepsiden fare sabitlemesini ve beyin erişmek için başını kesmek.
- Forseps ve makas kullanılarak hayvanın başının etrafında deri kaldırmak. Bir iğne ile kafatasının arka kısmında bir delik Poke ve dikkatli makas ve kesme forseps ile kafatası çıkarın.
- Beyin açıkça erişilebilir bir kez, beyincik kaldırmak ve PBS içinde yerleştirmek için forseps kullanabilir. Bir neşter ile sajital düzlemde beyincik iki eşit parçaya böler ve 4 ° C'de bir gece% 30 sukroz çözeltisi aktarın. Not: hazırlık içinparafin kesitler vardır öncesinde doku gömme ve kesit için% 4 PFA 4 ° C'de gece boyunca beyincik sabitleyin.
4. Doku İşleme ve Kesit
- Kuru buz ve 2-metil bütan içeren bir bulamaç hazırlanır. Banyosunun sıcaklığı 5 dakika boyunca dengelenmeye bırakın.
- OCT bileşiği ile cryomold doldurun ve kalıba iki eşit parçaya bölünmüş beyincik yarısı yerleştirin.
- Bir diseksiyon mikroskobu ve forseps pozisyon bir çift (beyincik orta hat yakınında) iki eşit parçaya bölünmüş bir yüzey yukarı bakacak şekilde beyincik kullanma.
- Ekim bileşiği, bir doku numunesinin yaklaşık beyaz bir katı matris oluşana kadar 5 dakika boyunca kuru buz bulamaca cryomold aktarın. Not: Gerekirse dondurulmuş numune hemen -20 ° C 'de muhafaza edilebilir.
- Etiket cere 15 mikron bölümleri toplamak amacıyla üreticinin talimatlarına göre, doku bölümleri toplamak için poli-lisin slaytlar tedavi edilen ön ve Kriyostat hazırlanmasıbellum. Bölümleri toplamak için dikkatle slayt poli-lizin kaplı tarafı Ekim bölümüne başvurun. Bölümünün yönünü korumak için, bu aşama esnasında slayt dönmez.
- Boyama ve görüntüleme ile devam kadar -20 ° C'de saklayın doku bölümleri.
5. Boyama ve Beyincik Bölümlerin Görüntüleme
- Doku boyamadan önce aşağıdaki çözümleri hazırlayın:
PBS ~ 50 mi
~ PBS içinde% 4 PFA 5-10 mi
~ PBS içinde% 0.5 Triton X-100,% 10 eşek serumu 10-20 mi - Çözülme serebellar kesitler. Önemli olarak, EGFP solmasının engellenmesi için, sürekli ve yoğun herhangi bir ışık kaynağı maruz kaldıkları en aza indirir.
- Hidrofobik bir bariyer kalemini kullanarak, doku kesitlerinde etrafına bir dikdörtgen çizin.
- 5 dakika boyunca% 4 PFA ile bölümleri Post-fix. Hidrofobik bariyer (genellikle ~ 500 ul) tarafından tarif tüm alanı kapsayacak şekilde yeterli sıvı kullanın. , Bir vakum ya da pipet yeniden kullanmasabitleştirici doku kesitlerinde rahatsız etmemek için özellikle dikkatli olmak taşıyın.
- Bir pipet ile hafifçe doku bölümleri bozmadan slayt PBS uygulanır. 5 dakika sonra dikkatlice sıvıyı çıkarmak için vakum veya pipet kullanın. PBS üç kez toplam durulama tekrarlayın.
- Bir pipet kullanarak dikkatli bir şekilde, PBS içinde% 0.5 Triton X-100,% 10 eşek serumu (çözeltisi 900 ul başına 3 ul kalbindin ve / veya Nesprin2 antikoru) uygun bir primer antikor seyreltme uygulanır. Karanlıkta, oda sıcaklığında bir saat süreyle inkübe edilir.
Not: EGFP-KASH2 dondurulmuş kesitler üzerinde doğrudan floresan mikroskobu ile görünür olacaktır, ve bir anti-EGFP antikor kullanılması gerekli değildir. Parafin kesitleri hazırlanmış, ancak EGFP-KASH2 görüntüleme, bir anti-EGFP antikor ile immunodeteksiyon gerektirir. - Antikor çözüm çıkarın ve PBS ile üç kez yıkayın.
- 1 Hazırlama:% 0.5 Triton X-100 içinde Alexa Fluor sekonder antikor seyreltileri 1000,Karanlıkta% 10 eşek PBS serum ve mağaza.
- Yavaşça Nihai PBS durulama çıkarın ve karanlıkta bir saat süreyle ikincil antikor seyreltme uygulanır.
- Ikincil antikor çözüm çıkarın yıkayın ve bölüm üç kez yıkayın. Gerekirse, ilk PBS uygulama esnasında, örneğin DAPI (~ 300nM) olarak nükleer leke, uygulanır.
- Tamamen doku ve doku bölümünde medya montaj yeri ~ 5-7 ul yerinden PBS çözüm kaldırmak. Doku bölümünün üstünde bir cam lamel yerleştirin ve karanlıkta, oda sıcaklığında ~ 15-30 dakika boyunca bekletin.
- EGFP ve adımları 5,8 / 5,9 kullanılan ikincil antikorlar için uygun olan herhangi bir başka dalga boylarını görselleştirmek için uygun filtreler ile donatılmış bir fluoresans mikroskopu kullanın. Serebellar dilimleri, EGFP-KASH2 nükleer jantlar görüntülemek için bir 20X objektif kullanın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu protokol, Tg (PCP2-Cre) fareler kullanılarak beyincik Purkinje hücreleri için EGFP ekspresyonu KASH2 kısıtlamak için Tg (CAG-LacZ / EGFP-KASH2) fare modelinde yararını göstermektedir. Tg olarak (PCP2Cre CAG-EGFP / KASH2) yavruları, LacZ / V5 açık okuma çerçevesi bu şekilde özellikle Purkinje hücreleri (Şekil 2A) için hedeflenen EGFP-KASH2 ekspresyonuna yol açan Cre rekombinaz tarafından P6 eksize edilir. Beklendiği gibi çekirdeğe (Şekil 2B) çevresinde gözlenmiştir EGFP-pozitif kenarı benzeri deseninin gösterdiği gibi, EGFP-KASH2 çekirdek zarfına hedeflenmektedir. Herhangi bir fizyolojik fenotipi en üst düzeye çıkarmak için, bir hücreye özel bir antikor işaretleyici ile birlikte boyandı EGFP-KASH2 pozitif hücrelerin yüzdesi hesaplanarak EGFP-KASH2 hedeflenen hücrelerin büyük bir çoğunluğu ifade sağlamak için önemlidir. Bu örnekte, EGFP-KASH2 sentezleme Calbindin pozitif Purkinje hücreleri (Şekil 2B) daha fazlasını,% 70 tespit edilmiştir. Bu Klima cihazlara iseleri, biz 10 aylık Tg (PCP2Cre CAG-EGFP / KASH2) fareler 20 önemli histolojik veya davranışsal fenotipleri dikkat etmedi. Bu, herhangi bir morfolojik veya davranışsal fenotip istenmeyen hücre tipi / doku EGFP-KASH2 ektopik ekspresyonu nedeniyle değil sağlamak için önemlidir. Bu açıdan için EGFP-KASH2 tanecik hücre katmanlarında ya da Tg (PCP2Cre CAG-EGFP-KASH2) cerebella (Şekil 2B) moleküler tabakasında gözlenmedi.
Son olarak, EGFP-KASH2 ifade eden hücrelerde Linc karmaşık bozulma derecesini onaylamak için hayati önem taşımaktadır. Bu EGFP-KASH2 ifade eden hücrelerin, KD bunların yerinden vurgulamak yüksek kaliteli anti-Nesprin antikorlar kullanılarak elde edilebilir. Şekil 3'te gösterildiği gibi, Purkinje hücreleri EGFP-KASH2 Reta ifade ettiklerini ise, endojen Nesprin2 EGFP-KASH2 eksprese Purkinje hücrelerinin çekirdek zarfına (Şekil 3 üst panel, san oklar) kaydırılırNükleer zarf endojen Nesprin2 (Şekil 3 üst panel, beyaz ok). Beklendiği gibi, Cre rekombinaz-ifade etmeyen kontrol litermatlarının, bütün Purkinje hücresi nüfusu (Şekil 3, alt beyaz oklar) nükleer zarfa Nesprin2 gösterir. Çeşitli raporlar, artık bu tür iskelet kas lifleri ve koni fotoreseptörlerin 19,21 gibi ek doku ve hücre tipi endojen Nesprins, yer değiştirmesi eşlik EGFP-KASH2 ekspresyonunu, doğruladı.
Şekil 1. Linc kompleksleri sitoskeletona çekirdeği bağlamak ve EGFP-KASH2 aşın tarafından bozulur. Sitoplazmik sitoskeletona çekirdeğin içinin bağlamak Linc kompleksleri (A) Tasvir. SUN etki Kash alanları ile promiscuously etkileşim unutmayınTüm Nesprins den (Nesprins 1-4). EGFP-KASH2 (B) aşırı ekspresyonu, böylece çevredeki sitoplazmik iskeletinin gelen çekirdek kesme, bir baskın negatif bir şekilde, ER çekirdek zarfına endojen Nesprins değiştirir.
Tg (PCP2-Cre) Tg fareler sonuçları (PCP2Cre CAG-EGFP-KASH2) yavrular Tg (CAG-LacZ / EGFP-KASH2) ve EGFP-KASH2 Şekil 2. aşırı ekspresyonu özellikle serebellar Purkinje hücreleri hedefleyen. (A) Damızlık burada Cre rekombinaz beyincik Purkinje hücreleri spesifik olarak ifade edilir. İfade (P6) üzerine, Cre rekombinaz bu LacZ ORF excises ve EGFP-KASH2 ekspresyonunu indükler çekirdek içine geçiş yapar. (B) Tg (PCP2Cre CAG-EGFP-KASH2) fareler özellikle serebellar Purkinje hücrelerinde IDENTIF EGFP-KASH2 ekspresKalbindin ile ied (kırmızı renkli). Moleküler tabakasının her iki serebellar granül nöronlar ve ara EGFP-KASH2 ifadesi için negatif olduğuna dikkat edin. Kısaltmalar: Mol: Moleküler tabaka PCL: Purkinje hücre tabakası ve GCL: Granül hücre tabakası.
Şekil serebellar Purkinje hücrelerinde endojen Linc komplekslerinin 3. bozulması. EGFP-KASH2 Tek konfokal düzlemi gösteren ifade Purkinje hücrelerinin çekirdek zarftan (kırmızı renkli) endojen Nesprin2 (üst sarı oklar) değiştirir. EGFP-KASH2 ifadesini eksik Purkinje hücreleri nükleer zarf endojen Nesprin2 (beyaz ok üst) korumak olduğunu unutmayın. Tg (CAG-LacZ / EGFP-KASH2) kontrol littermates, hiçbir EGFP sinyali görülmektedir ve Nesprin2 tüm Purki nükleer zarf tespit edilir
Bu protokol yararlılığını göstermektedirTg (CAG-LacZ / EGFP-KASH2) fare modeli Tg (PCP2-Cre) fareler kullanılarak serebellar Purkinje hücrelerine EGFP-KASH2 ifade özgürlüğünü kısıtlamaya. Tg olarak (PCP2Cre CAG-EGFP / KASH2) yavruları, LacZ / V5 açık okuma çerçevesi bu şekilde özellikle Purkinje hücreleri (Şekil 2A) için hedeflenen EGFP-KASH2 ekspresyonuna yol açan Cre rekombinaz tarafından P6 eksize edilir. Beklendiği gibi çekirdeğe (Şekil 2B) çevresinde gözlenmiştir EGFP-pozitif kenarı benzeri deseninin gösterdiği gibi, EGFP-KASH2 çekirdek zarfına hedeflenmektedir. Herhangi bir fizyolojik fenotipi en üst düzeye çıkarmak için, bir hücreye özel bir antikor işaretleyici ile birlikte boyandı EGFP-KASH2 pozitif hücrelerin yüzdesi hesaplanarak EGFP-KASH2 hedeflenen hücrelerin büyük bir çoğunluğu ifade sağlamak için önemlidir. Bu örnekte, EGFP-KASH2 sentezleme Calbindin pozitif Purkinje hücreleri (Şekil 2B) daha fazlasını,% 70 tespit edilmiştir. Bu koşullarda, herhangi bir önemli histolojik ya behaviora gözlenmedi10 aylık Tg (PCP2Cre CAG-EGFP / KASH2) farelerde 20 l fenotipleri. Bu, herhangi bir morfolojik veya davranışsal fenotip istenmeyen hücre tipi / doku EGFP-KASH2 ektopik ekspresyonu nedeniyle değil sağlamak için önemlidir. Bu açıdan için EGFP-KASH2 tanecik hücre katmanlarında ya da Tg (PCP2Cre CAG-EGFP-KASH2) cerebella (Şekil 2B) moleküler tabakasında gözlenmedi.
Son olarak, EGFP-KASH2 ifade eden hücrelerde Linc karmaşık bozulma derecesini onaylamak için hayati önem taşımaktadır. Bu EGFP-KASH2 ifade eden hücrelerin, KD bunların yerinden vurgulamak yüksek kaliteli anti-Nesprin antikorlar kullanılarak elde edilebilir. Şekil 3'te gösterildiği gibi, endojen Nesprin2 EGFP-KASH2 eksprese Purkinje hücrelerinin çekirdek zarfına (Şekil 3 üst panel, san oklar) kaydırılır EGFP-KASH2 çekirdek zarfına endojen Nesprin2 korumak ifade yoktur Purkinje hücreleri (Şekil ise 3 (Şekil 3, alt beyaz oklar) nükleer zarfa Nesprin2 gösterir. Çeşitli raporlar, artık bu tür iskelet kas lifleri ve koni fotoreseptörlerin 19,21 gibi ek doku ve hücre tipi endojen Nesprins, yer değiştirmesi eşlik EGFP-KASH2 ekspresyonunu, doğruladı.
Şekil 1. Linc kompleksleri sitoskeletona çekirdeği bağlamak ve EGFP-KASH2 aşın tarafından bozulur. Sitoplazmik sitoskeletona çekirdeğin içinin bağlamak Linc kompleksleri (A) Tasvir. O Paz etki tüm Nesprins (Nesprins 1-4) den Kash alanları ile promiscuously etkileşim unutmayın. (B) aşırı ekspresyonu of EGFP-KASH2 böylece çevredeki sitoplazmik hücre iskeletinin gelen çekirdeğini çıkardıktan bir dominant negatif moda, ER nükleer zarf endojen Nesprins değiştirir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Tg (PCP2-Cre) Tg fareler sonuçları (PCP2Cre CAG-EGFP-KASH2) yavrular Tg (CAG-LacZ / EGFP-KASH2) ve EGFP-KASH2 Şekil 2. aşırı ekspresyonu özellikle serebellar Purkinje hücreleri hedefleyen. (A) Damızlık burada Cre rekombinaz beyincik Purkinje hücreleri spesifik olarak ifade edilir. İfade (P6) üzerine, Cre rekombinaz bu LacZ ORF excises ve EGFP-KASH2 ekspresyonunu indükler çekirdek içine geçiş yapar. (B) Tg (PCP2Cre CAG-EGFP-KASH2) Özel Kalbindin ile özdeşleşmiş serebellar Purkinje hücrelerinde EGFP-KASH2 ifade eden fareler () kırmızı renkli. Moleküler tabakasının her iki serebellar granül nöronlar ve ara EGFP-KASH2 ifadesi için negatif olduğuna dikkat edin. Kısaltmalar: Mol: Moleküler tabaka PCL: Purkinje hücre tabakası ve GCL:. Granül hücre tabakası bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil serebellar Purkinje hücrelerinde endojen Linc komplekslerinin 3. bozulması. EGFP-KASH2 Tek konfokal düzlemi gösteren ifade Purkinje hücrelerinin çekirdek zarftan (kırmızı renkli) endojen Nesprin2 (üst sarı oklar) değiştirir. EGFP-KASH2 ekspresyonunu yoksun Purkinje hücreleri, çekirdek zarfına endojen Nesprin2 korumak (katiyen Note) Üst ok. Tg (CAG-LacZ / EGFP-KASH2) kontrol littermates, hiçbir EGFP sinyali görülmektedir ve Nesprin2 tüm Purkinje hücreleri (beyaz oklar alt) nükleer zarf tespit edilir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
En kritik aşama başarılı Tg (CAG-LacZ / EGFP-KASH2) modeli, uygun bir Cre fare hattı (ler) i belirlemek için kullanıldığı in vivo LINC komplekslerinin rolünü incelemek için. Cre içindeki yollar yer alan diğer hücre tiplerinde aktif Gerçekten de, eğer, bu sonuçların yorumunu komplike olabilir. Beyincik (Şekil 2B), moleküler ve granül hücre katmanlarında burada gösterildiği gibi Dolayısıyla, bu, at hücreleri incelemek için önemlidir. Aynı şekilde, herhangi bir fizyolojik ilgili fenotipleri maksimize etmek o ilgi hücre tipi genelinde yaygın Cre ifade ile bir Cre zorlanma tespit etmek önemlidir. Bu ilgi sisteminin gelişimi sırasında LINC karmaşık bileşenlerin ekspresyon şablonunun derinlemesine bir karakterizasyonunda üstlenmek için önem taşır. Nitekim, Tg (CAG-LacZ / EGFP-KASH2) fare modelinin bir dezavantajı Güneş proteinleri veya Nesprins varyantları biyolojik sistemine dahil olduğunuz gibi herhangi bir bilgi sağlamaz under dikkate. Ancak, bu konu hem transkript ve protein düzeylerinde sıkı bir karakterizasyonu üstlenerek aşılabilir. Aslında, bu tür çalışmalar MSS gelişimi sırasında belirli Linc karmaşık bileşenlerin rolü hakkında önemli bulgulara yol açan ve 21,22 homeostazı çeşitli vesilelerle ele alınmıştır.
Bu protokol, sabit merkezi sinir dokularının kullanılması üzerine odaklanmıştır getirirken, Tg (CAG-LacZ / EGFP-KASH2) fareler, in vitro olarak LINC kompleksleri kesintiye etkisini araştırmak için izole etmek ve kültürü birincil hücreler için de kullanılabilir. Bu düzen, daha izole etmek ve bu zaman atlamalı bir video mikroskobu gibi uygulamalar için EGFP-KASH2-pozitif hücrelerinin primer kültürleri arıtmak mümkündür. Bu nöronlar gibi düşük transfeksiyon verimlilik veya primer kültür sistemleri için gerekli olan lentiviral üretim, atlar.
Özetle, Tg (CAG-LacZ / EGFP-KASH2) fareler eğlenceli incelemek için yeni ve heyecan verici olanaklar açmakdoku ve hücre tipleri çok çeşitli embriyonik ve postnatal memeli gelişim süreçleri sırasında in vivo Linc komplekslerinin ction temel hücre biyolojisi soruları için.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.
Acknowledgments
Yazarlar (Bölüm Göz ve Görsel Bilimler) Tıp St. Louis Okulu Washington Üniversitesi'nde Fare Genetik Core Moleküler Genetik çekirdek, Morfoloji ve Görüntüleme çekirdeğinin çalışanlarına teşekkür ederiz. Yazarlar Cellular için McDonnell Merkezi ve Moleküler Nörobiyoloji, Sinir Hastalıkları Umut Merkezi'nden küçük hibe programı tarafından desteklenen, Ulusal Göz Enstitüsü (DH # R01EY022632), Ulusal Göz Enstitüsü Merkezi Çekirdek Grant (# P30EY002687) ve Research sınırsız hibe Göz ve Görsel Bilimler Bölümü'ne Körlük Önlemek için.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S0389 | |
| 10x PBS | Gibco | 14200-075 | |
| 16% Paraformaldehyde Solution | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| OCT Compound | Tissue-Tek | 4583 | |
| Adhesion Slides | StatLab | M1000W | |
| Donkey Serum | Sigma Aldrich | D9663 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T9284 | |
| ImmuEdge Pen | Vector Laboratories | H-4000 | |
| Anti-Calbindin Antibody | Sigma Aldrich | C9848 | |
| Anti-EGFP Antibody | Abcam | ab13970 | |
| Anti-Nesprin2 Antibody | Previously described in Ref. 21 | ||
| Fluorescent Mounting Media | Dako | S3023 | |
| 2-methyl butane | Sigma Aldrich | O3551 |
References
- Hutchison, C. J. Lamins: building blocks or regulators of gene expression? Nature reviews. Molecular cell biology. 3, 848-858 (2002).
- Stuurman, N., Heins, S., Aebi, U. Nuclear lamins: their structure, assembly, and interactions. Journal of structural biology. 122, 42-66 (1998).
- Crisp, M., et al. Coupling of the nucleus and cytoplasm: role of the LINC complex. The Journal of cell biology. 172, 41-53 (2006).
- Haque, F., et al. SUN1 interacts with nuclear lamin A and cytoplasmic nesprins to provide a physical connection between the nuclear lamina and the cytoskeleton. Molecular and cellular biology. 26, 3738-3751 (2006).
- Hodzic, D. M., Yeater, D. B., Bengtsson, L., Otto, H., Stahl, P. D. Sun2 is a novel mammalian inner nuclear membrane protein. The Journal of biological chemistry. 279, 25805-25812 (2004).
- Starr, D. A.
- Mellad, J. A., Warren, D. T., Shanahan, C. M. Nesprins LINC the nucleus and cytoskeleton. Current opinion in cell biology. 23, 47-54 (2011).
- Fridolfsson, H. N., Starr, D. A. Kinesin-1 and dynein at the nuclear envelope mediate the bidirectional migrations of nuclei. The Journal of cell biology. 191, 115-128 (2010).
- Meyerzon, M., Fridolfsson, H. N., Ly, N., McNally, F. J., Starr, D. A. UNC-83 is a nuclear-specific cargo adaptor for kinesin-1-mediated nuclear migration. Development. 136, 2725-2733 (2009).
- Padmakumar, V. C., et al. Enaptin, a giant actin-binding protein, is an element of the nuclear membrane and the actin cytoskeleton. Experimental cell research. 295, 330-339 (2004).
- Roux, K. J., et al. Nesprin 4 is an outer nuclear membrane protein that can induce kinesin-mediated cell polarization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 2194-2199 (2009).
- Wilhelmsen, K., et al. a novel outer nuclear membrane protein, associates with the cytoskeletal linker protein plectin. The Journal of cell biology. 171, 799-810 (2005).
- Wilson, M. H., Holzbaur, E. L. Nesprins anchor kinesin-1 motors to the nucleus to drive nuclear distribution in muscle cells. Development. 142, 218-228 (2015).
- Yu, J., et al. KASH protein Syne-2/Nesprin-2 and SUN proteins SUN1/2 mediate nuclear migration during mammalian retinal development. Human molecular genetics. 20, 1061-1073 (2011).
- Zhang, X., et al. Syne-1 and Syne-2 play crucial roles in myonuclear anchorage and motor neuron innervation. Development. 134, 901-908 (2007).
- Zhang, J., et al. Nesprin 1 is critical for nuclear positioning and anchorage. Human molecular genetics. 19, 329-341 (2010).
- Stewart-Hutchinson, P. J., Hale, C. M., Wirtz, D., Hodzic, D. Structural requirements for the assembly of LINC complexes and their function in cellular mechanical stiffness. Experimental cell research. 314, 1892-1905 (2008).
- Zhang, X., et al. SUN1/2 and Syne/Nesprin-1/2 complexes connect centrosome to the nucleus during neurogenesis and neuronal migration in mice. Neuron. 64, 173-187 (2009).
- Razafsky, D., Hodzic, D. Temporal and tissue-specific disruption of LINC complexes in vivo. Genesis. 52, 359-365 (2014).
- Razafsky, D., Hodzic, D. A variant of Nesprin1 giant devoid of KASH domain underlies the molecular etiology of autosomal recessive cerebellar ataxia type I. Neurobiology of disease. 78, 57-67 (2015).
- Razafsky, D., Blecher, N., Markov, A., Stewart-Hutchinson, P. J., Hodzic, D. LINC complexes mediate the positioning of cone photoreceptor nuclei in mouse retina. PloS one. 7, e47180 (2012).
- Razafsky, D. S., Ward, C. L., Kolb, T., Hodzic, D. Developmental regulation of linkers of the nucleoskeleton to the cytoskeleton during mouse postnatal retinogenesis. Nucleus. 4, 399-409 (2013).
