Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

موجهة بالليزر العصبية للبحث عن المفقودين في إإكسبلنتس الدماغ

Published: November 25, 2015 doi: 10.3791/53333
Automatic Translation
1, 1
1Department of Physiology and Biophysics, University of Colorado School of Medicine

Summary

وصفنا تقنية لتسمية الخلايا العصبية والعمليات الخاصة بها عن طريق تقدمي أو رجعي التتبع الحقن في نوى الدماغ باستخدام إعداد في المختبر. نحن تعديل طريقة القائمة ط ن معمليا التتبع Electroporation للمن خلال الاستفادة من fluorescently المسمى المسوخ الماوس وأجهزة بصرية الأساسية من أجل زيادة دقة وضع العلامات.

Abstract

نقدم الأسلوب الذي يجمع في المختبر التتبع بروتوكول الحقن، والذي يستخدم سلسلة من النبضات الكهربائية والضغط لزيادة امتصاص الصبغة من خلال Electroporation للفي إإكسبلنتس الدماغ مع استهداف إضاءة الليزر ومطابقة نظارات مرشح أثناء العملية. تقنية الموضحة في المختبر Electroporation للفي حد ذاته ينتج المراقبة البصرية جيدة نسبيا لاستهداف مناطق معينة من الدماغ. من خلال الجمع بين ذلك مع الإثارة ليزر علامات وراثية الفلورسنت وعلى القراءة من خلال نظارات مرشح تمرير الفرقة، والتي يمكن التقاط انبعاثات المسمى وراثيا الخلايا / نوى وصبغة الفلورسنت البحث عن المفقودين، يمكن للباحث زيادة كبيرة في دقة الحقن من خلال إيجاد مساحة من الاهتمام والسيطرة على الصبغة الانتشار / الامتصاص في منطقة الحقن بشكل أكثر كفاءة. وبالإضافة إلى ذلك، فإن تقنية الإضاءة الليزر يسمح لدراسة وظيفة neurocircuit التي قدمها الأقليمiding المعلومات حول نوع من الخلايا العصبية إسقاط لمنطقة معينة في الحالات التي يتم فيها ربط التعبير GFP لنوع الارسال التي أعربت عنها جزء من السكان من الخلايا العصبية.

Introduction

من أجل تحديد بعض الخلايا العصبية (الصغرى) الدائرة، يجب على المرء أن يبدأ من خلال إيجاد المشاركين من مختلف الدوائر وقال، ونمط علاقتهم. من أي وقت مضى منذ تم تأسيس نشر الر حول neurofiber البحث عن المفقودين من خلال lesioning 1 مجموعة كبيرة ومتنوعة من تقنيات تتبع تشريحي عصبي. بعض هذه التقنيات يمكن تطبيقها في الأنسجة ثابتة بعد الوفاة 2-4، والبعض الآخر يعتمد على النقل النشط من الصبغة في الخلايا العصبية الحية، كما اكتشف في عام 1971 5-6. هذا الأخير يمكن أيضا تقسيم في مجموعتين التمييز بين أساليب الاستفادة من الوراء النشط (من منطقة حقن لمصدر إسقاط معينة، أي. وsomata من الخلايا العصبية التي يتم إسقاط لوقال المنطقة) وتقدمي النشط (من حقن المنطقة هدفا لإسقاط معينة، أي. التوقعات محور عصبي والمحطات محور عصبي من الخلايا العصبية المسماة) النقل. أيضا، في بعض الحالات هيئة تنظيم الاتصالاتيتم حقن مادة حدات خفض الانبعاثات المعتمدة في الحيوانات الحية التي ثم البقاء على قيد الحياة حقن عدة أيام أو أسابيع (في حقن الجسم الحي التتبع)، بينما في حالات أخرى يتم حقن العقول explanted واحتضان لعدة ساعات بعد الحقن في السائل النخاعي الاصطناعي (في المختبر حقن التتبع) .

في هذا البروتوكول وتعديلها موجود في المختبر تقنية Electroporation لل8/7 لتسمية somata والعمليات العصبية في تقدمي ورجعي تتبع التجارب باستخدام choleratoxin الوحيدات-B وtetramethylrhodamine ديكستران مثل المواد التعقب. الهدف العام من هذا البروتوكول هو توفير علماء الأعصاب مع أداة فعالة لتتبع أنماط الاتصال بين الخلايا العصبية في الدماغ نوى مختلفة، مع الاستفادة من خطوط الماوس المعدلة وراثيا المتاحة والمعدات البصرية الأساسية من أجل زيادة دقة استهداف خلال حقن التتبع. على الرغم من أن طريقة تقدمي والبحث عن المفقودين إلى الوراء باستخدامcholeratoxin وأمين ديكستران ومنها تقارن بها fluorescently المسمى ليست جديدة 13/9 (كما هو طريقة Electroporation لل، على سبيل المثال. هاس وآخرون. 14)، والجمع بين الحقن التتبع مع ​​Electroporation للفي إعداد في المختبر التي تنطوي على كتل من أنسجة المخ تطور أكثر حداثة 7. ميزته الرئيسية على تقنيات تعقب الخلايا العصبية باستخدام نفس النوع من الأصباغ التتبع في الحيوانات الحية هي زيادة كثافة وضع العلامات، وذلك بسبب زيادة الكفاءة التي يتم اتخاذها الصبغة electroporated من قبل الخلايا العصبية. ميزة إضافية هي الفترة تقصير حضانة (مطلوب لنقل صبغ) وزيادة دقة المستهدف خلال حقن التتبع، لأن المجرب لديه المراقبة البصرية على المنطقة المستهدفة من الحقن. يعني هذا الأخير أيضا ما هو مطلوب أي معدات المجسم مكلفة للعثور على نواة أو الدماغ مجال الاهتمام.

لعديزيادة دوليا هو دقة الاستهداف، ونحن استغل خط الماوس المعدلة وراثيا، والذي يعبر عن GFP في حيوانية glycinergic لها من الخلايا العصبية 15 و المعدات البصرية الأساسية التي تتكون من مؤشر ليزر باليد من 405 نانومتر نظارات الطول الموجي ومطابقة الفرقة تمرير تصفية (450 - 700 نانومتر). وهكذا، حققنا المزيد من زيادة كبيرة في دقة الاستهداف عن طريق تحديد منطقة الحقن من خلال إشارته الفلورسنت، وتوفير وسيلة أدق للسيطرة على انتشار الصبغة داخل منطقة الحقن من خلال مراقبة التفاعل بين إشارة GFP الأصلية والتتبع مضان. كما يسمح لنا تقنية لكشف ظائف الدائرة جنبا إلى جنب مع الاتصال من خلال تحديد GFP إيجابية الخلايا العصبية المثبطة (أو مثير في خطوط الماوس الأخرى) التي كانت مليئة التتبع.

باختصار، نحن تعزيزه أداة قوية العلمية العصبية لدراسة connectome من الدماغ الفقاريات وتقييم رانه ميزات تشريحي عصبي مختلفة من neurocircuit معين. باستخدام الفئران المعدلة وراثيا إلى جانب المعدات البصرية مكلفة ومتاحة على نطاق واسع تمكنا من زيادة كبيرة في دقة استهداف حقن لدينا. وعلاوة على ذلك، فإن الفئران المعدلة وراثيا سمح لنا للتعرف على نوع من الاتصالات تتبعها، مما ساعد على كشف وظيفة لالمتناهية الصغر المثبطة في الدماغ السمعية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. التنميط الجيني البصري

1. بصري انماط من الفأر الجراء

  1. تحقق من التعبير عن علامة فلوري منها باستخدام مؤشر الليزر الطول الموجي الإثارة المناسب (405 نانومتر في التجارب وصفها هنا) ونظارات واقية فلتر حجب الطول الموجي الإثارة المقابلة ولكن يمر الطول الموجي الانبعاثات (450-700 نانومتر في التجارب وصفها هنا) . يشير مؤشر ليزر في الجزء الخلفي من الرأس أو النخاع الشوكي من الجرو الماوس (انظر الشكل 1). تجنب تسليط الليزر في عيون والتعرض طويل من الجلد لضوء الليزر.

2. البصرية انماط من أقدم الحيوانات

  1. عميق تخدير الماوس (P14 الذين تتراوح أعمارهم بين لP138 في وصف التجارب هنا) مع جرعة زائدة من بنتوباربيتال من خلال حقنة داخل الصفاق (120 ملغم / كغم من وزن الجسم). تأكيد التخدير السليم عن طريق فحص ردود الفعل الحيوان (قرصة لفترة وجيزة غيض من عشرالبريد الأذن أو واحدة من رجليه الخلفيتين لاستثارة منعكس تراجع من الأذن أو الساق).
  2. ملاحظة: على الرغم من استخدام جرعة زائدة من بنتوباربيتال (120 ملغ / كغ من وزن الجسم) نشير إلى إجراء الحقن ب "التخدير العميق" بدلا من القتل الرحيم، وذلك لأن الحيوان لا يزال مثالي على قيد الحياة (أي قلبها لا يزال ينبض)، عندما الجراحة ونضح تبدأ. وهذا يضمن نضح أكثر كفاءة الأجهزة الداخلية بما في ذلك الدماغ.
  3. مرة واحدة لا تظهر الحيوان أي ردود الافعال، وإزالة بعناية الجلد المغطي الجمجمة (الشكل 2A) عن طريق شق في الجلد الذي يغطي الجزء الخلفي من الرأس وقطع إلى القسم الوسطي من الجمجمة. فضح الجمجمة كشف للضوء الليزر ومراقبة مضان من خلال نظارات واقية مرشح كما هو موضح أعلاه. إذا لوحظ إشارة GFP إيجابية، انتقل إلى الخطوة 2، إن لم يكن، تضحية الحيوان من خلال قطع الرأس (الثاني / ضمان شكل القتل الرحيم التالية لدينااللوائح IACUC).

ملاحظة: في الفئران حتى كبار السن (> 1 شهر) مضان ويمكن ملاحظة من خلال عيون الحيوان.

2. Transcardial الإرواء وإعداد الدماغ

  1. يروي transcardially مع الجليد الباردة الفوسفات مخزنة المالحة (PBS، كلوريد الصوديوم: 137 ملم، بوكل: 2.7 ملم، KH 2 PO 4: 1،76 ملم، نا 2 هبو 4: 10 ملم) باستخدام حقنة إبرة 30 G لإزالة حد كبير الدم من الحيوان.
    1. أولا، فتح بعناية القفص الصدري مع مقص حاد ومن ثم دفع الإبرة في البطين الأيسر من القلب. بدء ضخ PBS في القلب والشريان الأورطي ومباشرة بعد هذه الخطوة فتح الأذين الأيمن من القلب مع مقص للسماح للدم للخروج من الجسم. ملاحظة: الإرواء يأخذ 5-10 دقيقة اعتمادا على حجم الحيوان.
  2. بعد استنزاف من خلال نضح، قطع رأس الحيوان، وتأمين رئيسها مع دبوس نeedles (أو 30 G إبر المحاقن) من خلال ثقب من خلال تجويف العين في طبق التحضير وإزالة الدماغ من الجمجمة.
    1. أولا، استخدام مقص حاد لقطع الجلد تتراكب الجمجمة: إجراء شق صغير في الجزء الخلفي من الرأس، ثم قطع على طول خط الوسط على الجانب الظهري للرأس، وقطع على الجانبين فقط caudally من أعين الحيوان وقطع اخيرا في اتجاه الذيلية لإزالة اللوحات من الجلد في الجزء الخلفي من الرأس.
    2. بعد ذلك، تكرار نمط قطع نفسه عن الجمجمة نفسها، للتأكد من إزالة كل قواقع في هذه العملية، لأن هذا سوف تبسيط كبير في إزالة جذع الدماغ في نهاية المطاف. بعد هذا الإجراء النصف الذيلية من الدماغ يجب أن تكمن مكشوفة تماما.
    3. في الخطوة التالية، واستخدام شفرة حلاقة حادة أو مشرط لقطع طريق الدماغ الأمامي كله في زاوية من نحو 45 درجة وحوالي 2 مم منقاري من المخيخ. يستخرج النصف الأمامي فصل من الدماغ مع أبملعقة الأنف والحنجرة.
    4. استخدام ملعقة لرفع النصف الذيلية من الدماغ في نهايته منقاري وخفض في وقت لاحق من خلال الأعصاب القحفية التي لا تزال متصلة جذع الدماغ على جانبها بطني. كنتيجة نهائية، ينبغي أن نصف الذيلية من الدماغ بما في ذلك الدماغ تقع بحرية قبالة بقية رئيس الحيوانية المعدة.
    5. الوجه النصف الذيلية إزالة من الدماغ لفضح جانبها بطني وقطع على طول الطائرة الاكليلية فقط منقاري (لحقن تقدمي) أو الذيلية فقط (لحقن رجعية) من "لمبات" يقع من الناحية البطنية التي تحتوي على الجسم شبه منحرف (راجع الخطوة 2.3).
      1. دائما استخدام شفرة حلاقة حادة أو مشرط لعملية القطع لتقليل موت الخلايا الناجم عن إجهاد الزائد على الأنسجة. كنتيجة نهائية، كان ينبغي الحصول على يزدرع الدماغ التي تمتد حوالي 1 سم في الطول، ويحتوي على مجمع الزيتونية متفوقة كاملة على طول مناطق أخرى من الدماغ.
    </ لى>

ملاحظة: يوضح هذا البروتوكول الإجراء لحقن التتبع في الجسم شبه منحرف الموجود في الدماغ السمعية. التكيف مع المكان وتوجيه الطائرات قطع ومواقع الحقن حسب الحاجة. إذا كانت مناطق الدماغ الاستشعاع الاهتمام كذبة قريبة بما فيه الكفاية لسطح الدماغ، بحيث يمكن التعرف على وحقن بدون تقطيع الدماغ (انظر الشكل 2B)، ثم يمكن أن يتم حذف الخطوة قطع الاكليلية.

  1. تعرف على الجثة شبه منحرف عن اثنين من "المصابيح" بارزة بطني تحتوي على نواة بطني من الجسم شبه منحرف (VNTB).

ملاحظة: لمزيد من إشارة التشريحية عن موقع المجسم التقريبي لهذه الطائرات قطع، انظر فرانكلين وPaxinos 2008. لوحة 78 من الأطلس، Bregma ~ -5.7 مم يدل على نواة وسطي من الجسم شبه منحرف (= MNTB) وصفت بأنها "TZ ". لوحة 69 يظهر النواة البطنية من بو شبه منحرفدى (VNTB) وصفت بأنها "MVPO" (نواة periolivary medioventral) 19.

3. تقدمي / الوراء للبحث عن المفقودين

ملاحظة: تنفيذ كافة الإجراءات التالية في RT (25 ° C).

  1. بعد القطع، ووضع يزدرع الدماغ في طبق التحضير تحتوي على الاوكسيجين (95٪ O 2، 5٪ CO 2) تشريح الحل (كلوريد الصوديوم: 125 ملم، بوكل: 2.5 ملم، MgCl 2: 1 ملم، CaCl 2: 0.1 ملم والجلوكوز : 25 مم، ناه 2 PO 4: 1،25 ملم، NaHCO 3: 25 مم، حمض الاسكوربيك: 0.4 ملم، ميو-إينوزيتول: 3 مم، حمض البيروفيك: 2 مم)، وتأمين مع 30 G إبر المحاقن. تأكد من أن منطقة الحقن تواجه صعودا.
  2. سحب ماصات حقن من الزجاج البورسليكات وشغل لهم مع أحد الحلول الثلاثة التالية: أ) 1.0 ملغ / مل حل من choleratoxin-الوحيدات بالأبيض مترافق إلى fluorophore اليكسا 555 في برنامج تلفزيوني 12-13 (تستخدم أساسا لنقل الوراء)، ب أ) -d 1٪ilution في المياه المالحة 0.9٪ من tetramethylrhodamine ديكستران 555 (3000 ميغاواط، وتستخدم أساسا لنقل الوراء) أو ج) -dilution 1٪ في المياه المالحة 0.9٪ من 10000 ميجاوات ديكستران-TRITC 555 (تستخدم أساسا لنقل تقدمي).
    1. تأكد من أن مجموعة مقاومات حقن ماصة 2،5-3،5 MOHM والتي يتم تصنيعها في 3-4 دورات سحب. لوصف التجارب هنا، تحقيق ذلك من خلال اختيار خوارزمية مبرمجة مسبقا سحب على مجتذب ماصة.
  3. إلقاء الضوء على يزدرع الدماغ باستخدام مؤشر الليزر شنت ثابت من الطول الموجي المناسب (البند رقم 2 في الشكل 3A، 405 نانومتر الطول الموجي في وصف التجارب هنا). استخدام مؤشر ليزر كدليل للحقن، وتهدف شعاع الليزر على نواة الدماغ fluorescently المسمى أو خلايا الفائدة التي سيتم حقنها.
  4. البحث ومراقبة المنطقة المستهدفة مضيئة من خلال المجهر مجهر حين يرتدي نظارات مرشح متوافقة (450-700 نانومتر مرشح الفرقة تمرير في وصف التجارب هنا). إدراج القطب الحقن عن طريق micromanipulator في مجال الفائدة.
  5. حقن مادة التتبع. تتكون حقن 2-10 البقول ضغط 15 رطل لمدة 50 ميللي ثانية لكل منهما، باستخدام جهاز حقن الضغط، موجهة بشكل عمودي في المنطقة ذات الاهتمام (ROI) داخل قسم المخ. إدارة كل نبضة ضغط على فترات من 10 - 15 ثانية للسماح للصبغة في الانتشار.
  6. في حالة tetramethylrhodamine (TRITC) الحقن، بالإضافة إلى تحفيز كهربائيا لتعزيز امتصاص الصبغة من خلال Electroporation للمع القطب وضعها في منطقة الدماغ من الفائدة (MNTB وVNTB في وصف التجارب هنا).
    1. استخدام 8 البقول TTL من 8 فولت لمدة 50 ميللي ثانية مع 50 مللي ثانية interpulse فترات مدفوعة مشجعا وتضخيمها إلى 55 V مع وحدة التحفيز العزلة (البنود رقم 7 و 9 في الشكل 3B). استخدام 10-20 تكرار هذا البروتوكول، اداريةالإحلال على مدى عدة دقائق 7،8. تأكد من توصيل القطب صحيح - يجب أن تكون متصلا سلك التأريض إلى حل حمام!
  7. تحقق من نجاح الحقن. منذ التتبع الفلورسنت مع الطول الموجي الانبعاثات أطول وينبعث منها أيضا إشارة الفلورسنت على الإثارة الليزر بأطوال موجية أقصر، والتحقق بصريا لامتصاص الصبغة / انتشرت في المنطقة المستهدفة حقن حين إلقاء الضوء على منطقة مع الليزر ومراقبة من خلال نظارات التصفية.

4. الحضانة

  1. بعد الحقن، واحتضان brainstems في الاوكسيجين السائل النخاعي الاصطناعي (ACSF، كلوريد الصوديوم: 125 ملم، بوكل: 2.5 ملم، MgCl 2: 1 ملم، CaCl 2: 2 مم، الجلوكوز: 25 مم، ناه 2 PO 4: 1،25 ملم، NaHCO 3: 25 مم، حمض الاسكوربيك: 0.4 ملم، ميو-إينوزيتول: 3 مم، حمض البيروفيك: 2 مم، فقاعات مع 95٪ O 2-5٪ CO 2) في درجة حرارة الغرفة (RT، 25 ° C) لمدة 1 - 4 ساعات، في حينيتم نقل الصبغة. فقاعة الحل خلال فترة الحضانة بأكملها.
  2. وفي وقت لاحق، ونقل brainstems في 4٪ بارافورمالدهيد (PFA) الذائب في برنامج تلفزيوني (حوالي 100 مل؛ درجة الحموضة 7 لمزيج PFA / PBS) واحتضان لهم في 4 درجات مئوية للسماح بعد التثبيت، بين عشية وضحاها (O / N).

5. الأنسجة التقطيع والتركيب

  1. في اليوم التالي، وغسل الدماغ ثلاث مرات في برنامج تلفزيوني (5 دقائق لكل خطوة الغسيل)، وتغطي في 4٪ أجار ثم تقطع إلى 50-80 ميكرون شرائح سميكة على vibratome. جبل شرائح باستخدام المتوسطة المتزايدة على شريحة زجاجية، وساترة.
  2. اختياريا، تسمية المقاطع مع نيسل الفلورسنت لمدة 25 دقيقة (على سبيل المثال الأزرق نيسل في التخفيف 1: 100 في AB وسائل الإعلام).
    1. لإعداد AB وسائل الإعلام، وخلط 250 مل من 0.2 M الفوسفات عازلة (PB، 51 مم KH 2 PO 4، 150 ملي نا 2 هبو 4)، 15 مل 5 M كلوريد الصوديوم، و 15 مل 10٪ تريتون-X، 220 مل ده 2 O و 5 ز albumine المصل البقري.
    2. Preceدي والنجاح في خطوة وصفها نيسل بنسبة 3 خطوات الغسيل في برنامج تلفزيوني (10 دقيقة لكل منهما).

ملاحظة: في الحالات التي تحتاج أقسام سمكا لتركيبها وتحليلها (في التجارب وصفها هنا هذه الشرائح كانت 100-500 ميكرون سميكة للحفاظ على اتصالات محور عصبي لمسافات أكبر)، وتقنية يمكن دمجها مع المقاصة الأنسجة. وجدنا ClearT2 12 لتكون ناجحة 20. عندما يتم تضمين خطوة المقاصة الأنسجة، وتنفيذ ذلك قبل تركيب الأبواب.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

أرقام 1 و 2 إظهار كيف يمكن استخدام مؤشر ليزر ونظارات ليزر بسرعة وبتكلفة زهيدة إلى التركيب الوراثي الحيوانات إيجابية GFP من القمامة. في حالات الجراء الماوس الشباب، ويمكن استخدام هذه التقنية لتحديد noninvasively التسمية GFP في أدمغة الحيوانات من خلال الجمجمة والجلد المغطي (الشكل 1A - D). ويمكن رؤية مضان المنبعثة من خلال الجلد والجمجمة من الجراء الماوس على الأقل حتى يوم ما بعد الولادة 3 (الشكل 1C). يظهر الإجراء في الشكل رقم 1 لدينا الخضراء بروتين فلوري (GFP) المسمى خط الماوس معربا عن GFP في حيوانية glycinergic لها من الخلايا العصبية (GlyT2-GFP). في الحيوانات الأكبر سنا مع الجماجم سمكا والجلد المصطبغ، التسمية GFP يظهر أقل جيدا من خلال الجلد والعظام، وبالتالي فإن الجلد على الرأس و / أو الرقبة يحتاج إلى إزالتها قبل التنميط الجيني البصرية (الشكل 2A).

بعد perfusing للحيوان يتم أخذ الدماغ من ويضيء مرة أخرى للعثور على نواة fluorescently المسمى من الفائدة. الهياكل الساطعة التي تضيء على مقربة من السطح البطني من الدماغ في الشكل 2B هما نواة بطني من الجسم شبه منحرف، والتي كنا بمثابة دليل وهدفا لحقن التتبع لدينا. الشكلين 4 و 5 تظهر النتائج ممثل حقنة تقدمي في النواة البطنية من الجسم شبه منحرف (VNTB) باستخدام tetramethylrhodamine dextrane (TRITC؛ الشكل 4) وحقنتين إلى الوراء في نواة وسطي من الجسم شبه منحرف (MNTB) باستخدام choleratoxin الوحيدات-ب (CTB، أرقام 5A و B) وTRITC (أرقام 5C وD). وضع العلامات المحاور مشرق مبينا (في هذه الحالة المثبطة) التوقعات من VNTB إلى MNTB يمكن أن ينظر إليه بعد حقن تقدمي في VNTB (الشكل 4). أرقام 5A و5C تظهر نظرة عامة على الموقعحقن (MNTB) مع النواة التي تحتوي على الخلايا المسمى retrogradely (VNTB) لأنها المقبل. أرقام 5B و5D عرض تضخيم صور retrogradely المسمى somata الخلايا VNTB glycinergic في الأقسام نفسها كما هو معروض في الشكل 5A و5C. لاحظ كيف تتبع الوراء مع CTB النتائج في نمط منقط المزيد من 12-13 (الشكل 5B)، في حين أن الخلايا VNTB المسمى retrogradely مع TRITC عرض مثل جولجي وضع العلامات كثيفة جدا 21 (الشكل 5D).

الشكل 1
الشكل 1: التنميط الجيني البصرية GlyT2-GFP إيجابية وGlyT2-GFP سلبية الفئران تم تصويرها الفئران GFP إيجابية تحت (A) ظروف الإضاءة العادية، (B) عند إضاءة ليزر مع مؤشر الليزر 405 نانومتر دون الأخضر- نظارات تصفية و (C)على إضاءة ليزر مع الليزر والأشعة فوق البنفسجية نظارات السلامة. إشارة GFP قوية مرئيا في المنطقة فوق المخيخ وجذع الدماغ. (D) على النقيض من ذلك، الجراء GlyT2-GFP سلبية من نفس خط الماوس والعمر (P2) لا تظهر أي علامات مضان في نفس المناطق ( مؤخرة الرأس والحبل الشوكي). يتم تصفية ضوء الليزر الأزرق نحو فعال من خلال نظارات واقية.

الرقم 2
الشكل 2: التنميط الجيني البصرية والدماغ يزدرع إعداد. يتعرض الجمجمة (A) A P4 GlyT2-GFP الماوس الجرو لإضاءة الليزر وينظر اليها من خلال الفرقة تمرير نظارات التصفية. يمكن ملاحظة GFP الاستشعاع من خلال الجمجمة. (B) A يزدرع الدماغ من نفس الجرو في إعداد طبق على إضاءة ليزر، كما يتضح من خلال نظارات التصفية. ويمكن رؤية المحاور Glycinergic ونوى الدماغ، مثل النواة البطنية من الجسم شبه منحرف (VNTB) كما الاصدارهياكل مشرق ص قريبة من سطح الدماغ.

الشكل (3)
الرقم 3: نظرة عامة على مر في المختبر حقن الضغط وإعداد Electroporation لل. (A) 1: المجسام، 2: شنت مؤشر ليزر (405 نانومتر الطول الموجي)، 3: headstage مع حقن ماصة شنت على micromanipulator، 4: إعداد طبق يحتوي على يزدرع الدماغ، 5: جهاز كمبيوتر مع تثبيت MC التحفيز البرامج، 6: جهاز ضغط الحقن، متصلا ماصة حقن عن طريق أنابيب (B) 7: وحدة التحفيز العزلة، 8: عالية الكثافة إضاءة، 9: مشجعا. يتم توصيل مشجعا إلى القطب في ماصة عن طريق وحدة التحفيز العزلة ومدفوعة من قبل PC.

الرقم 4
الرقم 4: للبحث عن المفقودين تقدمي للاتصالات المثبطة من VNTB إلى الإنسي نواة من شبه منحرف الجسم (MNTB). أظهرت هو إسقاط الحد الأقصى لكومة متحد البؤر التي اتخذت في شريحة أفقية تمتد حوالي 200 ميكرون في العمق في الدماغ تطهيرها من الماوس P14 GlyT2-GFP. بعد tetramethylrhodamine dextrane (TRITC) الحقن في جزء-caudo وسطي من VNTB، وصفت الزاهية الاتصالات محور عصبي (وفي بعض الحالات النهايات الطرفية الخاصة) من VNTB إلى MNTB يمكن ملاحظتها. شريط مقياس: 200 ميكرون.

الرقم 5
الرقم 5: إلى الوراء الراسم الحقن في MNTB تكشف عن اكمال خلايا Glycinergic في VNTB المعروضة هي أقصى التوقعات من مداخن مبائر التي اتخذت في شرائح الاكليلية من P88 (A، B) وP80 (C، D (التي تمتد على مدى حوالي 50 ميكرون). ) GlyT2-GFP الماوس. (A) لمحة عامة عن choleratoxin الوحيدات-ب (CTB) الحقن في الجزء الأنسي من MNTB. (B) تمتلئ الخلايا Glycinergic في VNTB مع CTB (نقاط والحمراء داخل somata الخلية) نتيجة للحقن هو مبين في الشكل 5A. بعض من نقاط وتظهر خارج الخلايا، والتي يمكن أن تكون مؤشرا على GFP سلبية (غير glycinergic) أنواع الخلايا الأخرى في VNTB يجري شغلها، وكذلك (لأن من الألياف المصابة المرور في منطقة الحقن، على سبيل المثال) . (C) نظرة عامة آخر لحقن TRITC الوراء استهداف MNTB. ملاحظة، كيف شغل عدد من الخلايا مع TRITC في MNTB التالية Electroporation لل(خلافا لCTB بحتة حقن الضغط في الشكل 5A). (D) وضع العلامات إلى الوراء الخلايا VNTB glycinergic بعد حقن TRITC في MNTB (نفس الحقن كما هو مبين في الشكل 5C). معظم الخلايا عرض العلامات الأصفر أو البرتقالي الكثيف، بسبب مزيج من اثنين من إشارات فلوري (التعبير GFP الأصليين وملء مع TRITC الأحمر). مقارنة مع الخلايا GFP الإيجابي الذي لسبب مالم يستغرق الصبغة (السهم الأزرق) وخلية GFP سلبية المسمى التتبع يظهر أحمر عميق وربما شغلها، بسبب إصابة محور عصبي في مجال حقن (السهم الأحمر). لاحظ نمط مختلف من تلطيخ somata خلية في حقن التتبع إلى الوراء باستخدام CTB (الشكل 5B) وTRITC (الشكل 5D). أشرطة النطاق: أرقام 5A و5C: 200 ميكرون، أرقام 5B و5D: 20 ميكرون.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

A القوة العامة في المختبر التتبع Electroporation لل، خلافا لفي الدراسات المجراة البحث عن المفقودين، هو أنه يعطي الباحثين أفضل للوصول إلى منطقة الدماغ من الفائدة، وبالتالي، لا تنطوي على المجسم مكلفة (وغالبا الكهربية) المعدات. وبالإضافة إلى ذلك، فإن فترة بقاء اللازمة لإإكسبلنتس الدماغ يمتد سوى بضع ساعات (1-4) بدلا من أيام أو حتى أسابيع في حالة في الجسم الحي حقن التتبع (انظر استعراض مفصل عن استخدام الأمينات ديكستران واستشفاف أخرى في في حقن الجسم الحي من قبل Lanciego وWouterlood، 2011 22، ولكن أيضا رودريجيز-كونتريراس، وآخرون، 2008 23)، بحيث حقن فاشلة يمكن أن يتم الكشف في وقت مبكر من خلال إجراء الحقن أو على أقصى تقدير، في اليوم التالي، لذلك أن المعلمات حقن يمكن تعديلها وفقا لذلك. فترة البقاء على قيد الحياة قصيرة لإإكسبلنتس الدماغ يعني أيضا أن هناك عادة أصغر الفرق بين <م> فعالة (منطقة، حيث تم أخذ صبغة من قبل الخلايا العصبية في تقدمي أو محطات محور عصبي في الحقن رجعية) واضحة (المنطقة التي امتد صبغ، دون تناولها) موقع الحقن، على الرغم من أن هذا الاختلاف لا يمكن استبعاده تماما ولا يمكن قياسها كميا / الخاضعة للرقابة لمرحلة ما بعد خاصة، والتي في بعض الحالات يمكن أن يكون من المستحيل تماما (انظر ألبرخت وآخرون، 2014 لمناقشة أكثر تفصيلا 24).

وينبغي الإشارة إلى، أن اتصالات من أي تقريبا طول يمكن دراستها مع هذا الأسلوب، طالما المجرب قادر على الحفاظ على كل من منطقة حقن والهدف أو مصدر مساحتها من التوقعات محور عصبي في قطعة واحدة من أنسجة المخ. لا يمكن أن يتحقق التصور من مثل هذه الاتصالات من خلال إما إعادة بناء مداخن مبائر صورة المكتسبة تقطيع وتركيب الدماغ (كما هو موضح هنا) بعد أو كامل الدماغ / تقنيات التصوير لوح الدماغ بعد تنفيذ النسيج واضحةبروتوكولات جي (انظر القسم 5 في هذا البروتوكول للحصول على مثال).

والميزة الرئيسية لتقنيتنا من Electroporation للفي المختبر موجهة بالليزر هي زيادة كبيرة في دقة الاستهداف أثناء الحقن التتبع. طريقة الأصلي في المختبر Electroporation لليعتمد على السيطرة فقط البصرية من خلال استهداف بعض علامات الطبوغرافية أو استخدامهم أدلة التقريبية بالنسبة للمنطقة الحقن. وينطبق الشيء نفسه على انتشار الصبغة في المنطقة المستهدفة: يمكن للمرء أن يلاحظ الصبغة نشر، ولكن ليس من السهل للسيطرة على انتشار الصبغة بطريقة أدق. مع تعديل ليزر لهذه الطريقة، يمكن للباحث العثور بسهولة النوى وخلايا الفائدة ومراقبة انتشار الصبغة في السكان نواة / خلية من الاهتمام من خلال تفاعل مضان الأصليين مدفوعة وراثيا ومضان من صبغ. وهكذا، فإن المكاسب الباحث مزيد من السيطرة على ه / التجربة تتبع لها عن طريق التقليل من ايجابيات كاذبة في antero- أو إلى الوراءحشو، لأنه تم شغل في خلية / محطات محور عصبي خارج النواة / مجال الاهتمام خلال الحقن، كذلك. ومن الواضح أن هذا لا يعني السيطرة المطلقة على الموقع الفعال للحقن، والتي، كما ذكر آنفا، يمكن أن تختلف من موقع واضح. والتحذير من هذه التقنية هو من الواضح أن توافر الكائنات المعدلة وراثيا. الفئران هي كائن النموذج الجيني تستخدم على نطاق واسع في الدراسات الثدييات، وهو صحيح للحقل السمعي أيضا، ولكن يمكن اعتبار بعض النماذج الثدييات أفضل، لأنها تشبه تخطيط السمع البشري على نحو أدق. وبالتالي، يمكن توظيف تقنيات أخرى لتسمية السكان العصبية في الحيوانات wildtype من الأنواع الأخرى أكثر ملاءمة لنوع معين من البحوث الميدانية (مثل الجربوع أو شينشيلا في دراسات النظام السمعي 25-28)، وهذا يمكن أن يشمل الحقن الفيروسية الاستفادة من بعض المروجين تستهدف فقط حجرات معينة من الدماغ والتعبير عن fluorescعلامات والأنف والحنجرة في مجموعة فرعية فقط من خلايا المخ. وبطبيعة الحال، يجب الحذر الواجب اتخاذها لضمان صحة بنيات الوراثية التي أعرب عنها في حيوانية الأيمن من الخلايا العصبية، بغض النظر عن ما إذا كان يتم التعبير عن هذه بنيات فيروسي في الحيوانات wildtype أو محليا في الضربة القاضية في خطوط الماوس.

كما أشار في وقت سابق، والاستفادة من المسوخ الماوس التعبير عن البروتينات الفلورية فى فئة معينة من الخلايا العصبية يسمح أيضا لتوصيف وظيفي لدوائر الدماغ (في حالتنا كنا قادرين على تميز توقعات المثبطة من واحد نواة الدماغ السمعية إلى 24 أخرى عن طريق التصور النقي نتائج تجاربنا تتبع). مرة أخرى، في صحة بنيات الوراثية أعرب تحتاج إلى تأكيد قبل أي تفسير لنتائج التجارب تتبع يمكن أن يحدث.

آخر القوة العامة في المختبر Electroporation للهي توافقه مع الغيرطرق تشريحية إيه، مثل (المناعة) الكيمياء النسيجية والمقاصة الدماغ. كما هو موضح سابقا 24 عاما، لا يتأثر تطبيق تقنيات تلطيخ إضافية مثل نيسل، أو أسلوب المقاصة الدماغ تسمى ClearT2 12 20،24. العيب الرئيسي الذي يتعين على المرء أن نأخذ في الاعتبار هو أن عمق تغلغل نيسل والبقع الأجسام المضادة ستنخفض مع زيادة سمك الأنسجة، لذلك يتعين على المرء أن يزن الخيارات الحفاظ على عملية محور عصبي في شرائح سمكا مقابل قوة إشارة إضافية (المناعة) الكيمو تلطيخ في التجارب التي تحتاج إلى كل من طرق وضع العلامات التشريحية. بالطبع، هناك عامل آخر هو أن تنظر إلى الإثارة / الانبعاث عرض النطاق الترددي فصل التسميات الفلورسنت مختلفة، منذ أقل عدد ممكن من التسميات يبدأ في ثلاث علامات في هذه المرحلة (السكان الأصليين فلوري التعبير البروتين، والتتبع ونيسل / وضع العلامات الضد).

ومن الواضح أن أسلوبنا وصفها يمكن توسيعها لحقن من أي نوع من علامات الفلورسنت (بما في ذلك الخرز الكم) في إإكسبلنتس الدماغ أو حتى شرائح المخ من الفئران المعدلة وراثيا. منذ دقة حقن تعتمد على حد سواء، كشف واضح الهدف (مراقبة fluorescently المسمى النوى والخلايا)، وتحسين الإشراف على التسرب من صبغة الفلورسنت، واحد فقط من هذين العاملين ينبغي أن يكون كافيا لزيادة دقة الحقن، حتى عندما يكون الآخر هو غائب. وهذا يعني أن مختلف علامات غير الفلورسنت (مثل التركيبات الفيروسية أو غيرها من ناقلات / RNA DNA) يمكن حقنه بمزيد من الدقة في نوى الدماغ من الفائدة، ما دام نوى المستهدفة هي واضحة للعيان لالمجرب. هذا التطبيق الأخير المثير للاهتمام بشكل خاص، لأن Electroporation لللا تسمح لامتصاص الفعال للمادة DNA، فضلا 29-30، مما يجعل لدينا وسيلة مثالية تقريبا لهذا النوع من الحقن. العيب الوحيد الذي يحتاج إلى النظر هو أن يبني DNA يستغرق وقتا طويلا للتعبير عن ومشكلة تي الحيةينشأ الحفاظ ssue. هذا يمكن التغلب عليها عن طريق إنشاء عضوي النمط الثقافات شريحة الدماغ 31-32 على أساس شرائح حقن الدماغ (أو شرائح إعادة كتل أنسجة المخ)، والتي تسمح للحفاظ الأنسجة الحية بناء على أمر من أسابيع.

وبطبيعة الحال أخرى المسوخ الماوس المعدلة وراثيا يمكن استخدامها لتحقيق التواصل بين أنواع الخلايا العصبية الأخرى مثل الخلايا العصبية كوليني (على سبيل المثال في دردشة GFP الفئران 33)، مما يجعل هذه الطريقة أداة مرنة لدراسة الربط وظائف الدماغ (الصغرى) الدوائر.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ليس لدينا شيء في الكشف عنها.

Acknowledgments

بدعم من المعاهد الوطنية للصحة / أجريت NIDCD R01 DC التجارب 011582. التصوير في جامعة كولورادو أنشوتز الطبي الجامعي المتقدم المجهر الضوئي الأساسية بدعم جزئي من المعاهد الوطنية للصحة / NCRR كولورادو CTSI غرانت عدد UL1 RR025780 واضطرابات روكي ماونتن Neurlogical مركز الأساسية غرانت NIH P30NS048154. الدكتور ساشا دو لاك من معهد سالك قدم لنا مع الفئران GlyT2-GFP.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sodium chloride Sigma-Aldrich S7653 All chemicals are from Sigma-Aldrich, unless noted otherwise.
Potassium chloride  P9333
Potassium phosphate monobasic P5655
Sodium phosphate di-basic S907
Magnesium chloride M2670
Calcium chloride C5080
Glucose G7528
Sodium bicarbonate S6297
Ascorbic acid A4544
Myo-inositol I5125
Sodium pyruvate P2256
Bovine serum albumine A2153 optional, for additional (immuno)histochemistry
Triton-X-100 X100 optional, for additional (immuno)histochemistry
Poly(ethylene glycol), 8000 MW P2139 optional, for brain clearing
Formamide Fisher Scientific F84 optional, for brain clearing
Choleratoxin subunit-b Molecular Probes C-34776 (Alexa 555) 
Dextrane tetramethyl-rhodamine Molecular Probes D-7162 (Alexa 555)
Fluorescent Nissl Invitrogen N-21479 (blue) optional
Paraformaldehyde Fisher Scientific SF93
Agarose Invitrogen 16520
Fluoromount-G Southern Biotech 0100-01
Pentobarbi-tal Vortech Pharmaceuticals Fatal-Plus 
Borosilicate glass filaments Harvard Apparatus G150F-10
Pipette puller Zeitz Instruments, Germany DMZ Universal Puller
Perfusion setup Custom-made
Laser pointer  laserpointerpro.com, Hong Kong HK-88007294 (405 nm)
Filter/safety goggles Dragon Lasers, China LSG09 (band-pass 450-700 nm)
Bionocular microscope  Wild Heerbrugg, Switzerland Wild M3 Equipped with high-intensity illuminator (MI-150; Dolan-Jenner Inc.) 
Picospritzer Parker Instruments Picospritzer III
PC with installed MC Stimulus software Multi Channel Sys-tems, Germany (software)
2-channel stimulator Multi Channel Sys-tems, Germany STG-1002
Stimulation isolation unit A.M.P.I., Israel Iso-Flex
Micromanipulator Narishige, Japan YOU-1
Vibratome Leica, Germany VT1000S

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Waller, A. Experiments on the sections of glossopharyngeal and hypoglossal nerves of the frog and observations of the alterations produced thereby in the structure of their primitive fibers. Philos. Trans. R. Soc. Lond. 140, 423-429 (1850).
  2. Fink, R. P., Heimer, L. Two methods for selective silver impregnation of degenerating axons and their synaptic endings in the central nervous system. Brain Res. 4, 369-374 (1967).
  3. Nauta, W. J. Selective silver impregnation of degenerating axons in the central nervous system. Stain Technol. 27, 175-179 (1952).
  4. Ramón y Cajal, S. Histologie du système nerveux de l'Homme et des vertébrés. , Maloine, Paris. (1911).
  5. Kristensson, K., Olsson, Y. Uptake and retrograde transport of peroxidase in hypoglossal neurons. Electron microscopical localization in the neuronal perikaryon. Acta Neuropathol. 19, 1-9 (1971).
  6. Kristensson, K., Olsson, Y. Retrograde axonal transport of protein. Brain Res. 29, 363-365 (1971).
  7. Burger, R. M., Cramer, K. S., Pfeiffer, J. D., Rubel, E. W. Avian superior olivary nucleus provides divergent inhibitory input to parallel auditory pathways. J. Comp. Neurol. 481, 6-18 (2005).
  8. Ford, M. C., Grothe, B., Klug, A. Fenestration of the calyx of Held occurs sequentially along the tonotopic axis, is influenced by afferent activity, and facilitates glutamate clearance. J. Comp. Neurol. 514, 92-106 (2009).
  9. Glover, J. C., Petursdottir, G., Jansen, J. K. S. Fluorescent dextran amines used as axonal tracers in the nervous system of chicken embryo. J. Neurosci. Methods. 18, 243-254 (1986).
  10. Trojanowski, J. Q., Gonatas, J. O., Gonatas, N. K. Conjugates of horseradish peroxidase (HRP) with cholera toxin and wheat germ agglutinin are superior to free HRP as orthograde transported markers. Brain Res. 223, 381-385 (1981).
  11. Trojanowski, J. Q., Gonatas, J. O., Steiber, A., Gonatas, N. K. Horseradish peroxsidase (HRP) conjugates of cholera toxin and lectins are more sensitive retrograde transported markers than free HRP. Brain Res. 231, 33-50 (1982).
  12. Conte, W. L., Kamishina, H., Corvin, J. V., Reep, R. L. Topography in the projections of lateral posterior thalamus with cingulate and medial agranular cortex in relation to circuitry for directed attention and neglect. Brain Res. 1240, 87-95 (2008).
  13. Conte, W. L., Kamishina, H., Reep, R. L. Multiple neuroanatomical tract-tracing using fluorescent Alexa Fluor conjugates of cholera toxin subunit B in rats. Nat. Protoc. 4, 1157-1166 (2009).
  14. Haas, K., Jensen, K., Sin, W. C., Foa, L., Cline, H. T. Targeted electroporation in Xenopus tadpoles in vivo- from single cells to the entire brain. Differentiation. 70, 148-154 (2002).
  15. Zeilhofer, H. U., et al. Glycinergic neurons expressing enhanced green fluorescent protein in bacterial artificial chromosome transgenic mice. J. Comp. Neurol. 482, 123-141 (2005).
  16. Poyatos, I., Ponce, J., Aragön, C., Giménez, C., Zafra, F. The glycine transporter GLYT2 is a reliable marker for glycine-immunoreactive neurons. Brain. Res. Mol. Brain Res. 49, 63-67 (1997).
  17. Gong, S., et al. A gene expression atlas of the central nervous system based on bacterial artificial chromosomes. Nature. 425, 917-925 (2003).
  18. Heintz, N. Bac to the future: the use of BAC transgenic mice for neuroscience research. Nat. Rev. Neurosci. 2, 861-870 (2001).
  19. Franklin, K. B. J., Paxinos, G. The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , 3rd ed, Elsevier/Academic Press. New York. (2008).
  20. Kuwajima, T., Sitko, A. A., Bhansali, P., Jurgens, C., Guido, W., Mason, C. ClearT: a detergent- and solvent-free clearing method for neuronal and non-neuronal tissue. Development. 140, 1364-1368 (2013).
  21. Wouterlood, F. G., Jorritsma-Byham, B. The anterograde neuroanatomical tracer biotinylated dextran amine: comparison with the tracer PHA-L in preparations for electron microscopy. J. Neurosci. Methods. 48, 75-87 (1993).
  22. Lanciego, J. L., Wouterlood, F. G. A half century of experimental neuroanatomical tracing. J. Chem. Neuroanat. 42, 157-183 (2011).
  23. Rodriguez-Contreras, A., Silvio, J., van Hoeve, S., Habets, L. P., Locher, H., Borst, J. G. G. Dynamic development of the calyx of Held synapse. PNAS. 105 (14), 5603-5608 (2008).
  24. Albrecht, O., Dondzillo, A., Mayer, F., Thompson, J. A., Klug, A. Inhibitory projections from the ventral nucleus of the trapezoid body to the medial nucleus of the trapezoid body in the mouse. Front. Neural Circuits. 8, 83 (2014).
  25. Benson, D. A., Teas, D. C. Single unit of binaural interaction in the auditory cortex of the chinchilla. Brain Res. 103, 313-338 (1976).
  26. Koka, K., Jones, H. G., Thornton, J. L., Lupo, J. E., Tollin, D. J. Sound pressure transformations by the head and pinnae of the adult Chinchilla (Chinchilla lanigera). Hear Res. 272 (1-2), 135-147 (2011).
  27. Ryan, A. Hearing sensitivity of the mongolian gerbil, Meriones unguiculatus. J. Acoust. Soc. Am. 59 (5), 1222-1226 (1976).
  28. Zwicker, E., Fastl, H. Psychoacoustics Facts and Models. , Springer. (1990).
  29. Chu, G., Hayakawa, H., Berg, P. Electroporation for the efficient transfection of mammalian cells with DNA. Nucleic Acids Res. 15 (3), 1311-1326 (1987).
  30. Klenchin, V. A., Sukharev, S. I., Serov, S. M., Chernomordik, L. V., Chizmadzhev, Y. A. Electrically induced DNA uptake by cells is a fast process involving DNA electrophoresis. Biophys J. 60 (4), 804-811 (1991).
  31. Elias, L., Kriegstein, A. Organotypic Slice Culture of E18 Rat Brains. J. Vis. Exp. (6), e235 (2007).
  32. Gähwiler, B. H. Organotypic monolayer cultures of nervous tissue. J. Neurosci. Methods. 4 (4), 329-342 (1981).
  33. Tallini, Y. N., et al. BAC transgenic mice express enhanced green fluorescent protein in central and peripheral cholinergic neurons. Physiol Genomics. 27 (3), 391-397 (2006).

Tags

علم الأعصاب، العدد 105، تلطيخ وصفها، تقنيات تشريحي عصبي المسالك-للبحث عن المفقودين، Electroporation لل، تقنيات التنميط الجيني، التشريح العصبي، التشريح، تتبع الخلايا العصبية، tetramethylrhodamine، choleratoxin الوحيدات-ب، مضان، في المختبر Electroporation لل، التنميط الجيني البصري
موجهة بالليزر العصبية للبحث عن المفقودين في إإكسبلنتس الدماغ
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Albrecht, O., Klug, A. Laser-guided… More

Albrecht, O., Klug, A. Laser-guided Neuronal Tracing In Brain Explants. J. Vis. Exp. (105), e53333, doi:10.3791/53333 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter