Summary
Vi beskriver en teknik til at mærke neuroner og deres processer via anterograd eller retrograd tracer injektioner i hjernekerner anvendelse af en in vitro præparat. Vi modificerede en eksisterende metode af i n vitro tracer elektroporering ved at udnytte fluorescensmærket mus mutanter og grundlæggende optisk udstyr med henblik på at øge nøjagtigheden mærkning.
Abstract
Vi præsenterer en teknik, der kombinerer en in vitro-sporstof injektion-protokollen, som bruger en række elektriske og tryk impulser til at øge farvestof optagelse gennem elektroporation i hjernen eksplantater med målrettet laser belysning og matchende filter beskyttelsesbriller under proceduren. Den beskrevne teknik in vitro elektroporering af sig selv giver forholdsvis god visuel kontrol for målretning visse områder af hjernen. Ved at kombinere det med laser excitation af fluorescerende genetiske markører og deres udlæsning via band-passerer filter beskyttelsesbriller, som kan hente udledningen af de genetisk mærkede celler / kerner og det fluorescerende opsporing farvestof, kan en forsker øge nøjagtigheden af injektioner ved at finde det område af interesse og styring for farvestoffet-spredning / optagelse i injektionen området langt mere effektivt. Hertil kommer, at laser illumination teknik gør det muligt at undersøge funktionaliteten af en given neurocircuit ved providing oplysninger om den type af neuroner rager til et bestemt område i tilfælde, hvor GFP-ekspression er forbundet med den type transmitter udtrykkes af en subpopulation af neuroner.
Introduction
For at fastlægge en vis neuronal (mikro) kredsløb, må man starte med at finde de forskellige deltagere af nævnte kredsløb, og deres forbindelse mønster. Lige siden er blevet etableret Waller publikation om neurofiber opsporing gennem læsionsdannelsen 1 et stort udvalg af neuroanatomiske tracing teknikker. Nogle af disse teknikker kan anvendes i fikseret væv post mortem 2-4, andre er afhængige af den aktive transport af farvestoffet i levende neuroner, som opdagede i 1971 5-6. Sidstnævnte kan yderligere opdeles i to grupper, diskriminerer mellem metoder udnytter aktiv retrograd (fra det injicerede område til kilden til en given projektion, dvs.. Den somata af neuroner, der rager til nævnte område) og aktiv anterograd (fra den injicerede område til målet om en given projektion, dvs.. de axonale fremskrivninger og axonale terminaler mærkede neuroner) transport. Også i nogle tilfælde tracer materiale indsprøjtes i levende dyr, som derefter overlever injektionen af flere dage eller uger (in vivo tracer injektioner), mens der i andre tilfælde eksplanterede hjerner injiceres og inkuberes i flere timer efter injektionen i kunstig cerebrospinalvæske (in vitro tracer injektioner) .
I denne protokol ændrede vi en eksisterende in vitro elektroporation teknik 7-8 til at mærke neuronal somata og processer i anterograd og retrograd tracing forsøg med choleratoxin subunit-b og tetramethylrhodamin dextran som sporing stoffer. Det overordnede mål med denne protokol er at give neuroforskere med et effektivt redskab til at spore neuronale tilslutningsmuligheder mønstre mellem forskellige hjerneområder kerner, samtidig udnytte tilgængelige transgene mus linjer og grundlæggende optisk udstyr for at øge målretning nøjagtighed under tracer injektioner. Selvom metoden til anterograd og retrograd sporing hjælpcholeratoxin og dextran amin og deres respektive fluorescensmærkede konjugater er ikke ny 9-13 (som er metoden til elektroporering, f.eks. Haas et al. 14), kombinationen af tracer injektioner med elektroporering i et in vitro præparat involverer blokke af hjernevæv er en nyere udvikling 7. Dens vigtigste fordel i forhold til neuronale tracing teknikker under anvendelse af den samme type tracer farvestoffer i levende dyr er den øgede mærkning intensitet, på grund af den højere effektivitet, hvormed den elektroporerede farvestoffet bliver taget op af neuroner. En yderligere fordel er den forkortede inkubationstid (kræves til farvestoffet transport) og dets øgede ønskede nøjagtighed i tracer injektion, fordi forsøgslederen har visuel kontrol over målområdet injektionsstedet. Sidstnævnte betyder også, at ingen dyre stereotaktisk udstyr er påkrævet for at finde kernen eller hjerne område af interesse.
Til suppletionelt øge målretning nøjagtighed, vi drog fordel af en transgen mus linje, som udtrykker GFP i sin glycinergic underpopulation af neuroner 15 og grundlæggende optisk udstyr, der består af en håndholdt laser pointer på 405 nm bølgelængde og matchende band-pass filtrering beskyttelsesbriller (450 - 700 nm). Således opnåede vi en betydelig yderligere stigning i målretning nøjagtighed ved at identificere injektion området gennem sin fluorescerende signal og ved at give en finere måde at kontrollere for farvestoffet spredning inden injektionen område gennem observation af samspillet mellem den indfødte GFP signal og sporstoffet fluorescens. Vores teknik gør det også muligt at afdække funktionaliteten af et kredsløb sammen med sin tilslutning ved at identificere GFP-positive hæmmende neuroner (eller stimulerende i andre mus linjer), der var fyldt med sporstof.
Sammenfattende vi yderligere forstærket et kraftfuldt værktøj neurovidenskabelig at studere connectome af hvirveldyr hjernen og vurdere than forskellige neuroanatomiske funktioner i en given neurocircuit. Ved at anvende transgene mus sammen med billig og bredt tilgængelige optisk udstyr var vi i stand til at øge den målsøgende nøjagtigheden af vores injektioner. Desuden de transgene mus tilladt os at identificere typen af røbestof forbindelser, som hjalp afdække funktionaliteten af en hæmmende mikrokredsløb i den auditive hjernestammen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Optisk Genotypebestemmelse
1. Optisk Genotypebestemmelse af Mouse Hvalpe
- Check for ekspression af det respektive fluorescerende markør ved hjælp af en laser pointer af den passende excitationsbølgelængde (405 nm i forsøgene her beskrevne) og tilsvarende filter beskyttelsesbriller blokerer excitationsbølgelængde men passerer emissionsbølgelængden (450 - 700 nm i forsøgene her beskrevne) . Ret laser pointer på bagsiden af hovedet eller rygmarven på musen pup (se figur 1). Undgå skinner laseren i øjnene og langvarig udsættelse af huden for laserlys.
2. Optisk Genotypebestemmelse af ældre dyr
- Dybt bedøver musen (alderen p14 til p138 i forsøgene her beskrevne) med en overdosis af pentobarbital ved en intraperitoneal injektion (120 mg / kg legemsvægt). Bekræft ordentlig anæstesi ved at kontrollere dyrets reflekser (kort knivspids spidsen af the øret eller en af bagbenene for at fremkalde tilbagetrækning refleks af øret eller ben).
- Bemærk: Til trods for anvendelsen af en overdosis af pentobarbital (120 mg / kg legemsvægt) henvises til proceduren injektion som "dyb anæstesi" i stedet for eutanasi, fordi dyret er ideelt stadig i live (dvs. dens hjerte stadig slår), når kirurgi og perfusionen begynde. Dette sikrer en mere effektiv perfusion af de indre organer, herunder hjernen.
- Når dyret ikke viser nogen reflekser, forsigtigt fjerne huden overliggende kraniet (figur 2A) ved at gøre et indsnit i huden, der dækker bagsiden af hovedet og skære ind til midtersektionen af kraniet. Udsætte afdækket kraniet for laserlys og observere fluorescensen gennem filterelementerne beskyttelsesbriller som beskrevet ovenfor. Hvis der observeres et positivt GFP-signal, gå videre til trin 2, hvis ikke, ofrer dyret gennem halshugning (andet / sikring form for eutanasi efter voresIACUC forordninger).
Bemærk: I endnu ældre mus (> 1 måned) fluorescens kan observeres gennem øjnene på dyret.
2. Transcardial perfusion og Brain Fremstilling
- Perfundere transkardialt med iskoldt phosphatbufret saltvand (PBS; NaCI: 137 mM, KCI: 2,7 mM, KH 2 PO 4: 1,76 mM, Na 2 HPO 4: 10 mM) under anvendelse af en 30 G kanyle stort set at fjerne blod fra dyret.
- Først forsigtigt åbne brystkassen med skarpe saks og skub nålen ind i venstre hjertekammer af hjertet. Begynder at pumpe PBS ind i hjertet og aorta og umiddelbart efter dette trin åbnes det højre atrium af hjertet med saksen for at tillade blodet at forlade kroppen. Bemærk: Perfusion tager 5 - 10 min afhængig af størrelsen af dyret.
- Efter afblødning gennem perfusion, halshugge dyret, sikre sin hoved med pin needles (eller 30 G injektionsnåle) ved piercing dem gennem øjenhulerne i et præparat skålen og fjerne hjernen fra kraniet.
- Brug først skarp saks til at afskære huden overlejre kraniet: lave et lille snit i baghovedet, derefter skæres langs midterlinien på den dorsale side af hovedet, skåret til siderne lige kaudalt i øjnene af dyret og endelig skåret i haleretningen helt at fjerne hudlapper på bagsiden af hovedet.
- Dernæst gentage det samme skære mønster for kraniet selv, så sørg for at fjerne begge cochleas i processen, fordi det markant vil forenkle fjernelsen af hjernestammen i sidste ende. Efter denne procedure den kaudale hjernehalvdel skal ligge helt åbent.
- I det næste trin, en skarp barberblad eller en skalpel til at skære igennem hele forhjerne i en vinkel på ca. 45 ° og ca. 2 mm rostralt fra cerebellum. Øse ud af adskilte forreste halvdel af hjernen med abent spatel.
- Brug spatel til at løfte den caudale halvdel af hjernen ved dens rostrale ende og efterfølgende skære igennem de kranienerver, der stadig er forbundet med hjernestammen på ventrale side. Som et slutresultat, bør den kaudale halvdel af hjernen, herunder hjernestammen falde frit fra resten af den fremstillede dyrehoved.
- Vend den fjernede caudale halvdel af hjernen til at afsløre sin ventrale side og skære langs koronale plan bare rostral (for anterograd injektioner) eller blot caudale (for de retrograde injektioner) i de ventralt beliggende "pærer", som indeholder det trapezformede krop (se trin 2.3).
- Anvender altid en skarp barberblad eller en skalpel for skæreproceduren at minimere celledød forårsaget af overdreven mekanisk belastning på vævet. Som et slutresultat, bør en hjerne eksplantat spænder over omkring 1 cm i længden, og som indeholder det komplette overlegne olivary kompleks langs andre hjerneregioner er indhentet.
Bemærk: Denne protokol demonstrerer proceduren for et sporstof injektion i trapez krop ligger i den auditive hjernestammen. Tilpas placeringen og orienteringen af de skærende fly og injektionssteder efter behov. Hvis de fluorescerende hjerneregioner af interesse ligger tæt nok til hjernen overfladen, så de kan identificeres og injiceres uden at skære hjernen (se figur 2B), så den koronale skæretrin kan udelades.
- Identificer trapez krop som to ventrale prominente "pærer", som indeholder den ventrale kerne af trapezformede krop (VNTB).
Bemærk: For yderligere anatomiske henvisning vedrørende den omtrentlige stereotaktisk placeringen af disse skærende fly, se Franklin & Paxinos, 2008. Panelet 78 atlas, Bregma ~ -5,7 mm viser den mediale kerne af trapezformede krop (= MNTB) mærket som "Tz ". Panel 69 viser den ventrale kerne af trapez body (VNTB) mærket som "MVPO" (medioventral periolivary kerne) 19.
3. Anterograd / Retrograd Tracing
Bemærk: Udfør alle følgende procedurer ved stuetemperatur (25 ° C).
- Efter opskæring, placere hjernestammen eksplantatet i et præparat skål indeholdende oxygeneret (95% O2, 5% CO2) dissekere opløsning (NaCl: 125 mM, KCI: 2,5 mM, MgCl2: 1 mM, CaCl2: 0,1 mM, glucose : 25 mM, NaH 2 PO 4: 1,25 mM, NaHCO3: 25 mM, ascorbinsyre: 0,4 mM, myo-inositol: 3 mM, pyrodruesyre: 2 mM), og fastgør den med 30 g sprøjtenåle. Sikre, at området med injektion vender opad.
- Træk injektion pipetter af borsilikatglas og fylde dem med en af følgende tre opløsninger: a) en ml opløsning af choleratoxin-underenhed-b konjugeret til en Alexa fluorofor 555 i PBS 12-13 (hovedsagelig anvendes til retrograd transport), b 1,0 mg / ) en 1% -dilution i 0,9% saltvand af dextran tetramethylrhodamin 555 (3.000 MW, hovedsageligt bruges til retrograd transport) eller c) en 1% -fortynding i 0,9% saltvand på 10.000 MW dextran-TRITC 555 (hovedsageligt bruges til anterograd transport).
- Sørg for, at injektion pipette modstande interval 2,5-3,5 MOhm, og at de er fremstillet i 3 - 4 trækker cyklusser. For de her beskrevne forsøg, opnå dette ved at vælge en forprogrammeret trække algoritme på pipetten aftrækker.
- Belyse hjernen eksplantatet ved anvendelse af en monteret statisk laser pointer med den passende bølgelængde (punkt No. 2 i figur 3A; 405 nm bølgelængde i forsøgene her beskrevne). Brug laserpointer som en guide for injektioner, og sigter laserstrålen på fluorescensmærkede hjernen kerne eller celler af interesse, der vil blive injiceret.
- Find og observere det belyste målområdet gennem en kikkert mikroskop, mens iført de kompatible filter beskyttelsesbriller (450 - 700 nm båndpasfilter i eksperimenterne er beskrevet her). Sæt injektionen elektrode via mikromanipulator ind i området af interesse.
- Injicere sporstof stof. Injektionerne består af 2 - 10 trykimpulser ved 15 psi i 50 msek hver, ved hjælp af et tryk injektionsanordning rettet vinkelret ind i området af interesse (ROI) i hjernen sektion. Administrere hver trykpuls med intervaller på 10 - 15 sek for at tillade farvestoffet at sprede sig.
- I tilfælde af tetramethylrhodamin (TRITC) injektioner, derudover stimulere elektrisk at forbedre farvestofoptagelse ved elektroporering med elektroden placeret i hjernen interesseområde (MNTB og VNTB i eksperimenterne er beskrevet her).
- Brug 8 TTL pulser af 8 volt i 50 msek med 50 msek interpulse intervaller, drevet af en stimulator og forstærkes til 55 V med en stimulering isolation enhed (elementer No. 7 og 9 i figur 3B). Brug 10 - 20 gentagelser af denne protokol, admini-streret over flere minutter 7,8. Sørg for at jorde elektroden ordentligt - jordledningen skal forbindes til badet løsning!
- Check for succes af injektionen. Da en fluorescerende sporstof med en længere emission bølgelængde også udsender et fluorescerende signal ved laser excitation med kortere bølgelængder, visuelt kontrollere for farvestoffet optagelse / spredes i det injicerede målområdet, mens belysning af området med laseren og observere gennem filter beskyttelsesbriller.
4. Inkubation
- Efter injektionen inkubere brainstems i oxygeneret kunstig cerebrospinalvæske (ACSF; NaCl: 125 mM, KCI: 2,5 mM, MgCl2: 1 mM, CaCl2: 2 mM, glucose: 25 mM, NaH 2 PO 4: 1,25 mM, NaHCO3 25 mM, ascorbinsyre: 0,4 mM, myo-inositol: 3 mM, pyrodruesyre: 2 mM, gennemboblet med 95% O2 - CO 5% 2) ved stuetemperatur (RT, 25 ° C) i 1 - 4 timer, mensfarvestoffet bliver transporteret. Bubble opløsningen under hele inkubationsperioden.
- Efterfølgende overføre brainstems i 4% paraformaldehyd (PFA) opløst i PBS (ca. 100 ml;. PH 7 til PFA / PBS mix) og inkubere dem ved 4 ° C for at tillade post-fiksering natten over (O / N).
5. Tissue udskæring og Montering
- Den næste dag vaskes hjernestammen tre gange i PBS (5 min for hver vasketrin), dække det i 4% agar og derefter skåret i 50 - 80 um tykke skiver på en vibratom. Mount skiver ved hjælp af et monterings medium på en glasplade, og dækglas.
- Eventuelt mærke afsnittene med fluorescerende Nissl i 25 minutter (for eksempel blå Nissl ved en 1: 100 fortynding i AB medier).
- For at forberede AB medier, mix 250 ml 0,2 M phosphatpuffer (PB; 51 mM KH 2 PO 4, 150 mM Na 2 HPO 4), 15 ml 5 M NaCl, 15 ml 10% Triton-X, 220 ml dobbeltdestilleret 2 O og 5 g bovint serumalbumin.
- Precede og lykkes det Nissl trin mærkning med 3 vasketrin i PBS (10 minutter hver).
Bemærk: I tilfælde hvor tykkere sektioner skal monteres og analyseret (i forsøg beskrevet her sådanne skiver var 100 - 500 mikrometer tyk for at bevare axonale forbindelser over større afstande), kan teknikken kombineres med væv clearing. Vi fandt ClearT2 12 at være en succes 20. Når et væv clearing skridt er inkluderet, udføre den, før montering af sektioner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 og 2 viser, hvorledes laser pointer og laserbrille kan anvendes til hurtigt og billigt genotype GFP-positive dyr fra et kuld. I tilfælde af unge museunger, kan teknikken anvendes til ikke-invasivt at identificere GFP etiket i dyrets hjerne gennem kraniet og overliggende hud (figur 1A - D). Udsendte fluorescens kan ses gennem huden og kraniet af museunger mindst op til postnatal dag 3 (figur 1C). Proceduren er vist i figur 1 for vores grønne fluorescerende protein (GFP) mærket muse der udtrykker GFP i sin glycinergic subpopulation af neuroner (GLYT2-GFP). I ældre dyr med tykkere kranier og pigmenteret hud, GFP label viser mindre godt gennem huden og knogle, og dermed huden på hovedet og / eller halsen skal fjernes, før den optiske genotypebestemmelse (figur 2A).
Efter perfusion afdyr hjernen tages ud og belyst igen for at finde de fluorescensmærkede kerner af interesse. De lyse strukturer, der lyser op tæt på den ventrale overflade af hjernestammen i figur 2B er de to ventrale kerner af trapezformede organ, som vi bruges som både en vejledning og et mål for vores tracer injektioner. Figur 4 og 5 viser repræsentative resultater af en anterograd injektion i den ventrale kerne i trapezformede legeme (VNTB) under anvendelse af tetramethylrhodamin dextran (TRITC;. figur 4) og to retrograde injektioner i den mediale kerne af trapezformede legeme (MNTB) under anvendelse af choleratoxin-underenhed-b (CTB, figur 5A og B) og TRITC (figur 5C og D). Kan ses Bright axonal mærkes med (i dette tilfælde hæmmende) fremspring fra VNTB til MNTB efter en anterograd injektion i VNTB (figur 4). 5A og 5C viser en oversigt over stedetinjektion (MNTB) med kernen indeholder de retrograd mærkede celler (VNTB) ved siden af den. 5B og 5D viser forstørrede billeder af retrograd mærkede somata af glycinergic VNTB celler i de samme afsnit som vist i figur 5A og 5C. Bemærk hvordan retrograd sporing med CTB resulterer i en mere punktformet mønster 12-13 (figur 5B), hvorimod VNTB celler retrograd mærket med TRITC vise en meget tæt Golgi-lignende mærkning 21 (figur 5D).
Figur 1:. Optisk Genotypebestemmelse af GLYT2-GFP-positive og GLYT2-GFP-negative mus GFP-positive mus blev fotograferet under (A) normale lysforhold, (B) ved laser belysning med en 405 nm laser pointer uden driv- filtrering beskyttelsesbriller og (C)efter laserbelysning med laser og UV beskyttelsesbriller. Et stærkt GFP signal er synligt i området over cerebellum og hjernestammen. (D) Derimod har GLYT2-GFP-negative unger fra samme mus linje og alder (p2) ikke viser nogen tegn på fluorescens i de samme områder ( bagsiden af hovedet og rygmarv). Den blå laserlys effektivt filtreres af beskyttelsesbriller.
Figur 2: Optisk Genotypebestemmelse og en Udarbejdet Brain Explant. (A) En p4 GLYT2-GFP mus hvalp kranium er udsat for laser belysning og set gennem band-pass filtrering beskyttelsesbriller. Den fluorescerende GFP kan observeres gennem kraniet. (B) En hjerne eksplantat fra samme hvalp i et præparat fad på laserbelysning, set gennem filtrering beskyttelsesbriller. Glycinergic axoner og hjernekerner, såsom den ventrale kerne af trapezformede legeme (VNTB) kan ses som very lyse strukturer tæt til hjernen overflade.
Figur 3: Oversigt over en in vitro-Pressure Injection og Elektroporation Setup. (A) 1: stereoskop, 2: monteret laser pointer (405 nm bølgelængde), 3: hovedtrin med indsprøjtning pipette monteret på en mikromanipulator, 4: forberedelse skål indeholdende hjernen eksplantatet, 5: en PC med installeret MC Stimulus software, 6: tryk injektionsanordning tilsluttet injektionspipetten via en slange (B) 7:. stimulus isolation enhed, 8: højintensive illuminator, 9: stimulator. Stimulatoren er forbundet med elektroden i pipetten via stimulering isolation enhed og drives af PC'en.
Figur 4: Anterograd Sporing af hæmmende forbindelser fra VNTB til Medial Nucleus af Trapezoid Krop (MNTB). Vist er en maksimal projektion af et konfokalt stabel taget i et vandret udsnit spænder ca. 200 mikrometer i dybden i en ryddet hjernen hos en p14 GLYT2-GFP mus. Efter en tetramethylrhodamin dextran (TRITC) injektion i caudo-mediale del af VNTB, lyst mærket axonale forbindelser (og i nogle tilfælde deres terminal slutninger) fra VNTB til MNTB kan observeres. Scale bar: 200 um.
Figur 5:. Retrograd Tracer Injektioner i MNTB Reveal Fyldt Glycinergic celler i VNTB er de maksimale projektioner af konfokale stakke træffes i koronale skiver af en P88 (A, B) og en p80 (C, D (der spænder over ca 50 um.) ) GLYT2-GFP mus. (A) en oversigt over en choleratoxin-underenhed-b (CTB) injektion i den mediale del af MNTB. (B) Glycinergic celler i VNTB er fyldt med CTB (rød puncta inde i cellen somata) som følge af injektionen er vist i figur 5A. Nogle af puncta anbringes uden for cellerne, som kunne være tegn på andre GFP-negative (non-glycinergic) celletyper i VNTB blive fyldt, samt (på grund af sårede fibre af passage på området injektion, for eksempel) . (C) En anden oversigt over et retrograd TRITC indsprøjtning rettet mod MNTB. Bemærk, hvordan et antal celler er fyldt med TRITC i MNTB efter elektroporation (i modsætning til den rent tryk injiceres CTB i figur 5A). (D) Retrograd mærkning af glycinergic VNTB celler efter en TRITC injektion i MNTB (samme injektion som vist i figur 5C). De fleste af cellerne viser en tæt gul eller orange mærkning, på grund af blanding af to fluorescerende signaler (den oprindelige GFP-ekspression og fyldning med den røde TRITC). Sammenlign med en GFP-positive celle, som en eller anden grundikke tage op farvestoffet (blå pil) og en sporstof-mærket GFP-negative celler vises dybt røde og eventuelt fyldt, på grund af en axonal skade på området injektion (rød pil). Bemærk de forskellige farvningsmønster celle somata i retrograd tracer injektioner ved hjælp af CTB (figur 5B) og TRITC (figur 5D). Skalapanelerne: figur 5A og 5C: 200 um, figur 5B og 5D: 20 pm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
En generel styrke in vitro sporstof elektroporering, i modsætning til in vivo tracing undersøgelser, er, at det giver forskere bedre adgang til hjernen område af interesse og dermed ikke indebærer dyre stereotaktisk (og ofte elektrofysiologisk) udstyr. Desuden overlevelse periode, der kræves for hjernen eksplantater spænder kun et par timer (1 - 4) i stedet for dage eller endda uger i tilfælde af in vivo tracer injektioner (se en detaljeret gennemgang om anvendelse af dextran aminer og andre sporstoffer i in vivo injektioner af Lanciego og Wouterlood 2011 22, men også Rodriguez-Contreras, et al., 2008 23), således at mislykkede injektioner kan opdages så tidligt som under proceduren for injektion eller senest på den næste dag på, så at injektion parametre kan justeres i overensstemmelse hermed. Den korte overlevelse periode hjernen eksplantater betyder også, at der som regel en mindre forskel mellem det <em> effektive (område, hvor farvestoffet blev taget op af neuroner i anterograd eller axonal terminaler i retrograd injektioner) og den tilsyneladende (område, hvor farvestoffet spildt, uden at blive taget op) injektionsstedet, men denne forskel kan aldrig udelukkes fuldstændigt og kan kun kvantificeres / kontrolleres for post-hoc, som i nogle tilfælde kan være helt umuligt (se Albrecht et al., 2014 for en mere detaljeret diskussion 24).
Det skal påpeges, at forbindelser af næsten enhver længde kan studeres med denne metode, så længe forsøgslederen er i stand til at bevare både det injicerede område og dets mål eller kildeområdet for axonale projektioner i et enkelt stykke af hjernevæv. Visualisering af disse forbindelser kan opnås enten gennem rekonstruktion af konfokale billedstakke erhvervet efter udskæring og montering hjernen (som beskrevet her) eller hel-hjerne / hjerne slab billeddiagnostiske teknikker efter udførelsen væv klaring protokoller (se afsnit 5 i denne protokol for et eksempel).
Den største fordel ved vores teknik laser-styret in vitro elektroporering er den betydelige stigning i målretning præcision under tracer injektioner. Den oprindelige metode til in vitro-elektroporation afhængig bare visuel kontrol ved at målrette visse topografiske markører eller bruge dem som tilnærmelsesvis guider for området med injektion. Det samme gælder for farvestoffet spredning i målområdet: man kan iagttage farvestoffet spredning, men det er ikke let at kontrollere farvestoffet spredes i en finere måde. Med laseren modifikation af denne fremgangsmåde, kan en forsker nemt finde kerner og celler af interesse og observere farvestoffet spredning i kernen / cellepopulationen af interesse gennem interaktion mellem den oprindelige genetisk drevet fluorescens og fluorescensen af farvestoffet. Således en forsker gevinster mere kontrol over hans / hendes sporing eksperiment ved at minimere falske positiver i antero- eller retrogradfyldninger, fordi celler / axonale terminaler uden for kernen / område af interesse blev fyldt under injektionen, så godt. Naturligvis betyder det ikke en absolut kontrol over den effektive injektionsstedet, hvilket, som tidligere nævnt, kan være forskellige fra den tilsyneladende site. En advarsel ved denne teknik er naturligvis tilgængeligheden af genetisk modificerede organismer. Mus er en udbredt genetisk model organisme i mammale undersøgelser, hvilket også er tilfældet for den auditive område, men nogle pattedyr modeller kunne betragtes som bedre, fordi de ligner den menneskelige audiogram mere præcist. Således kan andre teknikker anvendes til at mærke neuronale populationer i vildtype dyr af andre arter bedre egnet til en bestemt type forskning i marken (f.eks ørkenrotter eller chinchillaer i undersøgelser af auditive system 25-28): Dette kunne omfatte virale injektioner drage fordel af visse initiativtagere målrettet kun visse rum i hjernen og udtrykke fluorescerent markører i kun en delmængde af hjerneceller. Naturligvis skal træffes for at sikre gyldigheden af de udtrykte genetiske konstruktioner i den rigtige delpopulation af neuroner, uanset om sådanne konstruktioner er udtrykt viralt i vildtype dyr eller udvindes i knock-i mus linjer ekstra pleje.
Som påpeget tidligere, den fordel, at mus mutanter, der udtrykker fluorescerende proteiner i visse subpopulationer af neuroner også mulighed for den funktionelle karakterisering af hjernens kredsløb (i vores tilfælde var vi i stand til at karakterisere hæmmende fremskrivninger fra en auditiv hjernestammen kerne til en anden 24 ved ren visualisering af resultaterne af vores sporing eksperimenter). Igen er det nødvendigt gyldigheden af de udtrykte genetiske konstruktioner skal bekræftes, før en fortolkning af resultaterne af forsøg tracing kan finde sted.
En anden generel styrke in vitro elektroporation er dens forenelighed med othER anatomiske metoder, såsom (immuno) histokemi og hjerne clearing. Som påvist tidligere 24, er det ikke påvirkes af anvendelsen af yderligere farvningsteknikker såsom Nissl, eller en hjerne clearing metode kaldet ClearT2 12 20,24. Den største ulempe, at man har at holde sig for øje er, at indtrængningsdybde Nissl og antistof pletter vil falde med stigende vævstykkelse, så man må afveje muligheder for axonal proces bevarelse i tykkere skiver versus signalstyrke ekstra (immuno) histokemiske farvning i forsøg, hvor der er behov for både anatomiske mærkning metoder. Selvfølgelig anden faktor at overveje, er excitation / emission båndbredde adskillelse af de forskellige fluorescerende mærker, idet det minimale antal etiketter starter ved tre markører på dette tidspunkt (lokal fluorescerende protein ekspression, sporstof og Nissl / antistofmærkning).
Naturligvis kan vores beskrevne fremgangsmåde udvides tilinjektioner af enhver form for fluorescerende markører (herunder quantum perler) i hjernen eksplantater eller endda hjerneskiver af transgene mus. Da injektionen nøjagtigheden afhænger af både en klar måldetektering (observation af fluorescensmærkede kerner og celler) og en bedre kontrol med udslippet af det fluorescerende farvestof bør kun én af disse to faktorer er tilstrækkelige til øget injektion nøjagtighed, selv når anden er fraværende. Det betyder, at forskellige ikke-fluorescerende markører (som virale konstruktioner eller andre DNA / RNA-vektorer) kan injiceres med større præcision i hjernen kerner af interesse, så længe målet kerner er klart synlige for forsøgslederen. Denne sidstnævnte anvendelse er særligt interessant, fordi elektroporering giver mulighed for en effektiv optagelse af DNA-materiale, samt 29-30, hvilket gør vores metode næsten ideel til denne type injektioner. Den eneste ulempe, der skal overvejes, er, at DNA-konstruktioner tager tid til at udtrykke og problemet med levende TIssue konservering opstår. Dette kunne løses ved oprettelse organotypiske hjernen skivekulturer 31-32 baseret på injicerede hjernen skiver (eller re-skiver hjerne væv blokke), som giver mulighed for levende væv konservering på rækkefølgen af uger.
Og naturligvis andre transgene mus mutanter kan anvendes til at undersøge forbinde andre neuronale typer som cholinerge neuroner (f.eks ChAT-GFP mus 33), hvilket gør denne fremgangsmåde et alsidigt værktøj til at studere tilslutningsmuligheder og funktionalitet hjernen (mikro) kredsløb.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Vi har intet at afsløre.
Acknowledgments
Støttet af NIH / NIDCD R01 DC 011582. Imaging blev udført på University of Colorado Anschutz Medical Campus Advanced Light Microscopy Core delvist understøttet af NIH / NCRR Colorado CTSI Grant Antal UL1 RR025780 og Rocky Mountain Neurlogical Disorders Core center Grant NIH P30NS048154. Dr. Sascha du Lac fra Salk Institute forsynet os med de GLYT2-GFP mus.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | All chemicals are from Sigma-Aldrich, unless noted otherwise. |
| Potassium chloride | P9333 | ||
| Potassium phosphate monobasic | P5655 | ||
| Sodium phosphate di-basic | S907 | ||
| Magnesium chloride | M2670 | ||
| Calcium chloride | C5080 | ||
| Glucose | G7528 | ||
| Sodium bicarbonate | S6297 | ||
| Ascorbic acid | A4544 | ||
| Myo-inositol | I5125 | ||
| Sodium pyruvate | P2256 | ||
| Bovine serum albumine | A2153 | optional, for additional (immuno)histochemistry | |
| Triton-X-100 | X100 | optional, for additional (immuno)histochemistry | |
| Poly(ethylene glycol), 8000 MW | P2139 | optional, for brain clearing | |
| Formamide | Fisher Scientific | F84 | optional, for brain clearing |
| Choleratoxin subunit-b | Molecular Probes | C-34776 (Alexa 555) | |
| Dextrane tetramethyl-rhodamine | Molecular Probes | D-7162 (Alexa 555) | |
| Fluorescent Nissl | Invitrogen | N-21479 (blue) | optional |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | SF93 | |
| Agarose | Invitrogen | 16520 | |
| Fluoromount-G | Southern Biotech | 0100-01 | |
| Pentobarbi-tal | Vortech Pharmaceuticals | Fatal-Plus | |
| Borosilicate glass filaments | Harvard Apparatus | G150F-10 | |
| Pipette puller | Zeitz Instruments, Germany | DMZ Universal Puller | |
| Perfusion setup | Custom-made | ||
| Laser pointer | laserpointerpro.com, Hong Kong | HK-88007294 (405 nm) | |
| Filter/safety goggles | Dragon Lasers, China | LSG09 (band-pass 450-700 nm) | |
| Bionocular microscope | Wild Heerbrugg, Switzerland | Wild M3 | Equipped with high-intensity illuminator (MI-150; Dolan-Jenner Inc.) |
| Picospritzer | Parker Instruments | Picospritzer III | |
| PC with installed MC Stimulus software | Multi Channel Sys-tems, Germany (software) | ||
| 2-channel stimulator | Multi Channel Sys-tems, Germany | STG-1002 | |
| Stimulation isolation unit | A.M.P.I., Israel | Iso-Flex | |
| Micromanipulator | Narishige, Japan | YOU-1 | |
| Vibratome | Leica, Germany | VT1000S |
References
- Waller, A. Experiments on the sections of glossopharyngeal and hypoglossal nerves of the frog and observations of the alterations produced thereby in the structure of their primitive fibers. Philos. Trans. R. Soc. Lond. 140, 423-429 (1850).
- Fink, R. P., Heimer, L. Two methods for selective silver impregnation of degenerating axons and their synaptic endings in the central nervous system. Brain Res. 4, 369-374 (1967).
- Nauta, W. J. Selective silver impregnation of degenerating axons in the central nervous system. Stain Technol. 27, 175-179 (1952).
- Ramón y Cajal, S. Histologie du système nerveux de l'Homme et des vertébrés. , Maloine, Paris. (1911).
- Kristensson, K., Olsson, Y. Uptake and retrograde transport of peroxidase in hypoglossal neurons. Electron microscopical localization in the neuronal perikaryon. Acta Neuropathol. 19, 1-9 (1971).
- Kristensson, K., Olsson, Y. Retrograde axonal transport of protein. Brain Res. 29, 363-365 (1971).
- Burger, R. M., Cramer, K. S., Pfeiffer, J. D., Rubel, E. W. Avian superior olivary nucleus provides divergent inhibitory input to parallel auditory pathways. J. Comp. Neurol. 481, 6-18 (2005).
- Ford, M. C., Grothe, B., Klug, A. Fenestration of the calyx of Held occurs sequentially along the tonotopic axis, is influenced by afferent activity, and facilitates glutamate clearance. J. Comp. Neurol. 514, 92-106 (2009).
- Glover, J. C., Petursdottir, G., Jansen, J. K. S. Fluorescent dextran amines used as axonal tracers in the nervous system of chicken embryo. J. Neurosci. Methods. 18, 243-254 (1986).
- Trojanowski, J. Q., Gonatas, J. O., Gonatas, N. K. Conjugates of horseradish peroxidase (HRP) with cholera toxin and wheat germ agglutinin are superior to free HRP as orthograde transported markers. Brain Res. 223, 381-385 (1981).
- Trojanowski, J. Q., Gonatas, J. O., Steiber, A., Gonatas, N. K. Horseradish peroxsidase (HRP) conjugates of cholera toxin and lectins are more sensitive retrograde transported markers than free HRP. Brain Res. 231, 33-50 (1982).
- Conte, W. L., Kamishina, H., Corvin, J. V., Reep, R. L. Topography in the projections of lateral posterior thalamus with cingulate and medial agranular cortex in relation to circuitry for directed attention and neglect. Brain Res. 1240, 87-95 (2008).
- Conte, W. L., Kamishina, H., Reep, R. L. Multiple neuroanatomical tract-tracing using fluorescent Alexa Fluor conjugates of cholera toxin subunit B in rats. Nat. Protoc. 4, 1157-1166 (2009).
- Haas, K., Jensen, K., Sin, W. C., Foa, L., Cline, H. T. Targeted electroporation in Xenopus tadpoles in vivo- from single cells to the entire brain. Differentiation. 70, 148-154 (2002).
- Zeilhofer, H. U., et al. Glycinergic neurons expressing enhanced green fluorescent protein in bacterial artificial chromosome transgenic mice. J. Comp. Neurol. 482, 123-141 (2005).
- Poyatos, I., Ponce, J., Aragön, C., Giménez, C., Zafra, F. The glycine transporter GLYT2 is a reliable marker for glycine-immunoreactive neurons. Brain. Res. Mol. Brain Res. 49, 63-67 (1997).
- Gong, S., et al. A gene expression atlas of the central nervous system based on bacterial artificial chromosomes. Nature. 425, 917-925 (2003).
- Heintz, N. Bac to the future: the use of BAC transgenic mice for neuroscience research. Nat. Rev. Neurosci. 2, 861-870 (2001).
- Franklin, K. B. J., Paxinos, G. The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , 3rd ed, Elsevier/Academic Press. New York. (2008).
- Kuwajima, T., Sitko, A. A., Bhansali, P., Jurgens, C., Guido, W., Mason, C. ClearT: a detergent- and solvent-free clearing method for neuronal and non-neuronal tissue. Development. 140, 1364-1368 (2013).
- Wouterlood, F. G., Jorritsma-Byham, B. The anterograde neuroanatomical tracer biotinylated dextran amine: comparison with the tracer PHA-L in preparations for electron microscopy. J. Neurosci. Methods. 48, 75-87 (1993).
- Lanciego, J. L., Wouterlood, F. G. A half century of experimental neuroanatomical tracing. J. Chem. Neuroanat. 42, 157-183 (2011).
- Rodriguez-Contreras, A., Silvio, J., van Hoeve, S., Habets, L. P., Locher, H., Borst, J. G. G. Dynamic development of the calyx of Held synapse. PNAS. 105 (14), 5603-5608 (2008).
- Albrecht, O., Dondzillo, A., Mayer, F., Thompson, J. A., Klug, A. Inhibitory projections from the ventral nucleus of the trapezoid body to the medial nucleus of the trapezoid body in the mouse. Front. Neural Circuits. 8, 83 (2014).
- Benson, D. A., Teas, D. C. Single unit of binaural interaction in the auditory cortex of the chinchilla. Brain Res. 103, 313-338 (1976).
- Koka, K., Jones, H. G., Thornton, J. L., Lupo, J. E., Tollin, D. J. Sound pressure transformations by the head and pinnae of the adult Chinchilla (Chinchilla lanigera). Hear Res. 272 (1-2), 135-147 (2011).
- Ryan, A. Hearing sensitivity of the mongolian gerbil, Meriones unguiculatus. J. Acoust. Soc. Am. 59 (5), 1222-1226 (1976).
- Zwicker, E., Fastl, H. Psychoacoustics Facts and Models. , Springer. (1990).
- Chu, G., Hayakawa, H., Berg, P. Electroporation for the efficient transfection of mammalian cells with DNA. Nucleic Acids Res. 15 (3), 1311-1326 (1987).
- Klenchin, V. A., Sukharev, S. I., Serov, S. M., Chernomordik, L. V., Chizmadzhev, Y. A. Electrically induced DNA uptake by cells is a fast process involving DNA electrophoresis. Biophys J. 60 (4), 804-811 (1991).
- Elias, L., Kriegstein, A. Organotypic Slice Culture of E18 Rat Brains. J. Vis. Exp. (6), e235 (2007).
- Gähwiler, B. H. Organotypic monolayer cultures of nervous tissue. J. Neurosci. Methods. 4 (4), 329-342 (1981).
- Tallini, Y. N., et al. BAC transgenic mice express enhanced green fluorescent protein in central and peripheral cholinergic neurons. Physiol Genomics. 27 (3), 391-397 (2006).
