Summary
We beschrijven een techniek voor neuronen en hun processen label via anterograde of retrograde tracer injecties in de hersenen kernen met een in vitro bereiding. We pasten een bestaande methode i n vitro tracer elektroporatie door gebruik te maken van fluorescent gelabelde muis mutanten en eenvoudige optische apparatuur om de nauwkeurigheid etikettering te verhogen.
Abstract
Wij presenteren een techniek die in vitro tracer injectieprotocol, die gebruik maakt van een reeks elektrische pulsen en druk kleurstof opname in hersenen explantaten met gerichte laserbelichting en bijpassende filter goggles verhogen door elektroporatie tijdens de procedure combineert. De beschreven techniek van in vitro elektroporatie zelf levert relatief goede visuele controle voor het richten bepaalde hersengebieden. Door combinatie met laser excitatie van fluorescerende genetische merkers en hun uitlezing doorgaande band passeren filter bril, die halen de emissies van het genetisch gelabelde cellen / kernen en fluorescerende traceren kleurstof, een onderzoeker in hoofdzaak nauwkeurigheid van injecties vergroten door het vinden van het gebied van de rente en het beheersen van de kleurstof-spread / opname in de injectieplaats veel efficiënter. Bovendien, de laserverlichting techniek kan de functionaliteit van een bepaald neurocircuit van prov bestuderenIDing informatie over het type van neuronen projecteren op een bepaald gebied wanneer het GFP-expressie is gekoppeld aan het type zender door een subpopulatie van neuronen tot expressie.
Introduction
Om een bepaalde neuronale (micro) circuit definiëren, moet men beginnen door het vinden van de verschillende deelnemers van de schakeling, en de verbinding patroon. Sinds de publicatie Waller over neurofiber traceren door middel van laesie 1 een grote verscheidenheid van neuroanatomische tracing technieken is vastgesteld. Sommige van deze technieken kunnen in vaste weefsel post mortem 2-4 worden toegepast, andere vertrouwen op het actieve transport van de kleurstof in levende neuronen, zoals ontdekt in 1971 6/5. De laatste kunnen worden onderverdeeld in twee groepen discrimineren tussen verschillende maken van actieve retrograde (van het geïnjecteerde gebied om de bron van een bepaalde projectie, dwz. De somata van neuronen die uitsteken aan genoemde gebied) en actieve anterograde (van de geïnjecteerde gebied om de doelstelling van een bepaalde projectie, dwz. de axonale projecties en de axonale terminals van de gelabelde neuronen) vervoer. Ook in sommige gevallen tracer materiaal wordt geïnjecteerd in levende dieren die vervolgens overleven de injectie van verscheidene dagen of weken (in vivo tracer injecties), terwijl in andere gevallen geëxplanteerde hersenen geïnjecteerd en incubeer gedurende enkele uren na de injectie in kunstmatige cerebrospinale vloeistof (in vitro tracer injecties) .
In dit protocol gewijzigde we een bestaand in vitro elektroporatie techniek 7-8 neuronale somata en processen labelen in anterograde en retrograde tracing experimenten met choleratoxin subunit-b en tetramethylrhodamine dextran als tracing stoffen. De algemene doelstelling van dit protocol is te neurowetenschappers te voorzien van een efficiënt hulpmiddel om neuronale connectiviteit patronen tussen verschillende hersenkernen traceren, terwijl gebruik te maken van beschikbare transgene muis lijnen en eenvoudige optische apparatuur om targeting nauwkeurigheid tijdens tracer injecties te verhogen. Hoewel de werkwijze anterograde en retrograde traceren met behulpcholeratoxin en dextran amine en hun fluorescent gemerkte conjugaten niet nieuw 9-13 (volgens de methode van elektroporatie, bijv. Haas et al. 14), de combinatie van tracer injecties met elektroporatie in een in vitro bereiding met blokken van hersenweefsel is een meer recente ontwikkeling 7. Zijn belangrijkste voordeel ten opzichte neuronale tracing technieken met dezelfde soort tracer kleurstoffen in levende dieren is de toegenomen labeling intensiteit, vanwege de hogere efficiëntie waarmee de geëlektroporeerde kleurstof wordt opgenomen door neuronen. Een bijkomend voordeel is de verkorte incubatietijd (vereist voor de kleurstof transport) en de grotere nauwkeurigheid doel tijdens de tracer injectie, omdat de experimentator visuele controle over het doelgebied van de injectie. Dit laatste betekent tevens dat geen dure stereotactische apparatuur nodig om de kern of hersengebied interessegebied.
Om addinaal verhogen targeting nauwkeurigheid, we hebben gebruik gemaakt van een transgene muis lijn, die GFP uitdrukt in zijn glycinergic subpopulatie van neuronen 15 en eenvoudige optische apparatuur, bestaande uit een hand-held laser pointer van 405 nm golflengte en bijpassende banddoorlaatfiltering goggles (450 - 700 nm). Zo behaalden we een aanzienlijke verdere stijging van de doelgerichtheid nauwkeurigheid door de injectieplaats te identificeren door middel van haar fluorescerend signaal en door een fijnere manier om te controleren voor de kleurstof verspreiding in de injectie gebied door middel van de waarneming van de interactie tussen de inheemse GFP-signaal en de tracer fluorescentie. De techniek maakt het ook mogelijk om de functionaliteit van een circuit ontdekken met de connectiviteit door het identificeren van GFP-positieve remmende neuronen (of prikkelende andere muizenlijnen) die waren gevuld met de tracer.
Kortom, we verder versterkt een krachtig instrument om de neurowetenschappelijk connectoom van de gewervelde hersenen te bestuderen en te beoordelen thij verschillende neuroanatomische kenmerken van een bepaalde neurocircuit. Met behulp van transgene muizen met goedkope en overal verkrijgbaar optische apparatuur konden we aanzienlijke verhoging van de targeting nauwkeurigheid van onze injecties. Bovendien is de transgene muizen lieten het type getraceerd verbindingen, die hielp blootleggen van de functionaliteit van een remmende microcircuit in de auditieve hersenstam identificeren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Optische Genotyping
1. Optische Genotypering van Muis Pups
- Controleer expressie van de respectieve fluorescerende merker met een laser pointer van het juiste excitatie golflengte (405 nm in de hier beschreven experimenten) en bijbehorende filter bril blokkeren excitatiegolflengte maar langs de emissiegolflengte (450 - 700 nm in de hier beschreven experimenten) . Richt de laser pointer aan de achterkant van het hoofd of het ruggenmerg van de muis pup (zie figuur 1). Vermijd schijnt de laser in de ogen en langdurige blootstelling van de huid aan laserlicht.
2. optische Genotypering van oudere dieren
- Diep verdoven van de muis (leeftijd p14 aan p138 in de hier beschreven experimenten) met een overdosis pentobarbital door een intraperitoneale injectie (120 mg / kg lichaamsgewicht). Bevestig de juiste verdoving door het controleren van reflexen van het dier (kort knijpen het topje van the ear of één van de achterpoten om het terugtrekken van de reflex of poot) wekken.
- Opmerking: Ondanks het gebruik van een overdosis pentobarbital (120 mg / kg lichaamsgewicht) wordt verwezen naar de injectieprocedure als "diepe verdoving" in plaats van euthanasie, omdat het dier idealiter nog in leven (bijvoorbeeld het hart blijft kloppen), wanneer de chirurgie en de perfusie beginnen. Dit zorgt voor een efficiëntere perfusie van de inwendige organen zoals de hersenen.
- Zodra het dier geen reflexen vertonen zorgvuldig de huid die over de schedel (Figuur 2A) verwijderd door een incisie in de huid die de achterkant van het hoofd en snijden om de buik van de schedel. Expose de schedel ontdekt laserlicht en observeer de fluorescentie door het filter bril zoals hierboven beschreven. Als een positief GFP-signaal wordt waargenomen, ga dan naar stap 2, zo niet, offeren het dier door middel van onthoofding (tweede / zorgen vorm van euthanasie na onzeIACUC regelgeving).
Opmerking: In nog oudere muizen (> 1 maand) de fluorescentie worden waargenomen door de ogen van het dier.
2. transcardial perfusie en Brain Voorbereiding
- Perfuseren transcardially met ijskoude fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS; NaCI: 137 mM, KCl 2,7 mM, KH 2PO 4: 1,76 mM Na 2 HPO 4: 10 mM) met een 30 G injectienaald om het bloed uit grotendeels verwijderen het dier.
- Eerste, voorzichtig open de ribbenkast met een scherpe schaar en duw de naald in de linker ventrikel van het hart. Start de pompen PBS in het hart en de aorta en onmiddellijk na deze stap opent het rechter atrium van het hart met de schaar om het bloed naar het lichaam te verlaten. Opmerking: perfusie duurt 5 - 10 min afhankelijk van de grootte van het dier.
- Na verbloeding door middel van perfusie, onthoofden het dier veilig zijn kop met pin needles (of 30 G injectienaalden) door piercing ze door de oogkassen in een preparaat schaal en verwijder de hersenen uit de schedel.
- Gebruik eerst scherpe schaar af te snijden van de huid overlappen schedel: een kleine incisie in het achterhoofd, en snijd over de middellijn aan de dorsale zijde van de kop, gesneden om de zijkanten net caudaal van de ogen van het dier en tenslotte gesneden in de caudale richting volledig de flappen van de huid te verwijderen aan de achterkant van het hoofd.
- Vervolgens herhaalt u dezelfde snijden patroon voor de schedel zelf, zorg ervoor dat zowel cochleas in het proces te verwijderen, omdat deze aanzienlijk zal het verwijderen van de hersenstam aan het eind vereenvoudigen. Na deze procedure de caudale helft van de hersenen zou moeten liggen volledig bloot.
- In de volgende stap, met een scherp scheermesje of een scalpel door de gehele voorhersenen te snijden onder een hoek van ongeveer 45 ° en ongeveer 2 mm rostraal van het cerebellum. Schep het gescheiden voorste helft van de hersenen met abent spatel.
- Gebruik de spatel om de caudale helft van de hersenen verhogen rostrale aan zijn uiteinde en vervolgens dwars door de craniale zenuwen die nog steeds verbonden met de hersenstam aan de buikzijde. Als resultaat moeten de caudale helft van de hersenen inclusief de hersenstam vrij van de rest van de bereide dierkop vallen.
- Flip de verwijderde caudale helft van de hersenen om de buikzijde bloot en snijd langs de frontale vlak net rostraal (voor de anterograde injecties) of gewoon staartvin (voor de retrograde injecties) van de ventraal gelegen "bollen" met de trapezium lichaam (zie stap 2,3).
- Gebruik altijd een scherp scheermesje of een scalpel voor het snijden procedure om celdood veroorzaakt door overmatige mechanische belasting op het weefsel te minimaliseren. Als resultaat moet een brain explantaat uitstrekt over ongeveer 1 cm in lengte en dat het volledige superieure olivaris complex langs andere hersengebieden zijn verkregen.
Opmerking: Dit protocol toont de procedure voor een tracer injectie in het lichaam trapezoïde in de auditieve hersenstam. Pas de locatie en oriëntatie van de snijvlakken en injectieplaatsen indien nodig. Indien de fluorescerende hersengebieden plaats liggen dicht genoeg bij het hersenoppervlak, zodat zij kunnen worden geïdentificeerd en geïnjecteerd zonder dat de hersenen (zie figuur 2B), dan is de coronale snij stap kan worden overgeslagen.
- Identificeer de trapezium lichaam als twee ventrale prominente "bollen" met de ventrale kern van de trapezium lichaam (VNTB).
Opmerking: Voor meer anatomische referentie met betrekking tot de geschatte stereotactische locatie van deze snijvlakken, zie Franklin en Paxinos, 2008. Panel 78 van de atlas, Bregma ~ -5,7 mm toont de mediale kern van de trapezium lichaam (= MNTB) bestempeld als "Tz ". Paneel 69 toont het ventrale kern van de trapezium body (VNTB) bestempeld als "MVPO" (medioventral periolivary nucleus) 19.
3. Anterograde / Retrograde Tracing
Opmerking: Voer alle volgende procedures bij kamertemperatuur (25 ° C).
- Na het snijden plaatst de hersenstam explantaat in een preparaat schotel met geoxygeneerde (95% O2, 5% CO 2) ontleden oplossing (NaCl 125 mM, KCl 2,5 mM, MgCl2 1 mM, CaCl2: 0,1 mM, glucose : 25 mM, NaH 2 PO 4: 1,25 mm, NaHCO3: 25 mM, ascorbinezuur: 0,4 mm, myoinositol: 3 mm pyrodruivenzuur: 2 mm), het veiligstellen van het met 30 G injectienaalden. Zorg ervoor dat het gebied van de injectie naar boven is gericht.
- Trek injectie pipetten van borosilicaatglas en vullen met een van de volgende drie oplossingen: a) 1,0 mg / ml oplossing van choleratoxin subunit-b geconjugeerd aan een fluorofoor Alexa 555 in PBS 12-13 (hoofdzakelijk voor retrograde transport), b ) een 1% -dilution in 0,9% zoutoplossing van dextran tetramethylrhodamine 555 (3000 MW, hoofdzakelijk voor retrograde transport) of c) een 1% -dilution in 0,9% zoutoplossing van 10.000 MW dextran-TRITC 555 (hoofdzakelijk voor anterograde transport).
- Ervoor zorgen dat de injectie pipet weerstanden bereik van 2,5 om 3,5 MOhm en ze worden geproduceerd in 3 - 4 trekken cycli. Voor de hier beschreven experimenten, dit te bereiken door in te voorgeprogrammeerde trekken algoritme de pipet trekker.
- Verlichten de hersenen explant met behulp van een statisch gemonteerde laser pointer van de juiste golflengte (item nummer 2 in figuur 3A; 405 nm golflengte in de hier beschreven experimenten). Gebruik de laser pointer als leidraad voor de injecties, en richt de laserstraal op het fluorescent gelabelde hersenen kern of de cellen van belang, dat zal worden geïnjecteerd.
- Zoek en observeer de verlichte doelgebied door een binoculair microscoop, terwijl het dragen van de compatibele filter bril (450-700 nm banddoorlaatfilter in de hier beschreven experimenten). Plaats de injectie elektrode via de micromanipulator in het gebied van belang.
- Injecteer de tracer stof. De injecties uit 2 - 10 drukstoten bij 15 psi gedurende 50 msec elk onder een druk injectie-inrichting, loodrecht gericht in het gebied van belang (ROI) in het gedeelte hersenen. Dien elke drukpuls met tussenpozen van 10 - 15 sec om de kleurstof te verspreiden.
- Bij de tetramethylrhodamine (TRITC) injecties, aanvullend elektrisch stimuleren de kleurstofopname verbeteren door middel van elektroporatie met de elektrode geplaatst in de hersenen interessegebied (MNTB en VNTB in de hier beschreven experimenten).
- Met 8 TTL pulsen van 8 volt bij 50 msec met 50 msec interpuls intervallen, aangedreven door een stimulator en versterkt tot 55 V met een stimulatie isolatie-eenheid (items nr 7 en 9 in figuur 3B). Gebruik 10-20 herhalingen van dit protocol, administratreerd op enkele minuten 7,8. Zorg ervoor dat de elektrode goed geaard - de aarding draad moet worden aangesloten op het bad oplossing!
- Controleer succes van de injectie. Aangezien een fluorescerende tracer met een langere emissiegolflengte zendt ook een fluorescerend signaal na excitatie laser met kortere golflengten, visueel op de kleurstofopname / verspreid in het doelgebied geïnjecteerde tijdens het belichten met de laser en het waarnemen door het filter bril.
4. Incubation
- Na de injectie, incubeer de brainstems in geoxygeneerde kunstmatige cerebrospinale vloeistof (ACSF, NaCl 125 mM, KCl 2,5 mM, MgCl2 1 mM, CaCl2 2 mM, glucose 25 mM, NaH 2 PO 4: 1,25 mM, NaHCO 3: 25 mM ascorbinezuur: 0,4 mM myo-inositol: 3 mM pyrodruivenzuur: 2 mM, geborreld met 95% O2 - 5% CO 2) bij kamertemperatuur (RT, 25 ° C) gedurende 1 - 4 uur, terwijlde kleurstof wordt getransporteerd. Bubble de oplossing gedurende de gehele incubatieperiode.
- Vervolgens overdracht van de brainstems in 4% paraformaldehyde (PFA) opgelost in PBS (ca. 100 ml;. PH 7 voor PFA / PBS mix) en incubeer ze bij 4 ° C na fixatie overnacht staan (O / N).
5. Tissue Snijden en Montage
- De volgende dag was de hersenstam drie keer in PBS (5 min per wasstap), bedekken in 4% agar en vervolgens in 50 - 80 urn dikke plakken op een vibratome. Mount segmenten met een fixeermiddel op een glasplaatje, en dekglaasje.
- Eventueel etiket de secties met fluorescerende Nissl gedurende 25 min (bv blauwe Nissl bij een 1: 100 verdunning in AB media).
- AB media voor te bereiden, meng 250 ml van 0,2 M fosfaatbuffer (PB; 51 mm KH 2 PO 4, 150 mM Na 2 HPO 4), 15 ml 5 M NaCl, 15 ml 10% Triton-X, 220 ml DDH 2 O en 5 g runderserumalbumine.
- Precede slagen en de Nissl etikettering stap 3 wasstappen in PBS (10 min elk).
NB: In gevallen waarin dikkere secties moeten worden gemonteerd en geanalyseerd (in experimenten hier beschreven zoals plakjes waren 100-500 micron dik aan axonale verbindingen over grotere afstanden te behouden), kan de techniek worden gecombineerd met weefsel clearing. We vonden de ClearT2 12 20 succesvol te zijn. Wanneer een weefsel clearing stap is opgenomen, uit te voeren voordat de montage van de secties.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figuren 1 en 2 tonen hoe de laser pointer en laser bril kan worden gebruikt om snel en goedkoop genotype GFP positieve dieren uit een nest. In het geval van de jonge muis pups, kan de techniek worden gebruikt om GFP label noninvasively identificeren in de hersenen van het dier door de schedel en de bovenliggende huid (Figuur 1A - D). Uitgezonden fluorescentie kan ten minste tot postnatale dag 3 (Figuur 1C) worden gezien door de huid en de schedel van de muis pups. De procedure wordt getoond in figuur 1 voor de groene fluorescerende proteïne (GFP) gemerkt muizen tot expressie GFP in zijn glycinergic subpopulatie van neuronen (GlyT2-GFP). In oudere dieren met dikkere schedels en gepigmenteerde huid, het GFP-label geeft minder goed door de huid en botten, en derhalve de huid van het hoofd en / of nek nodig voordat de optische genotypering (Figuur 2A) verwijderd worden.
Na de perfusiedier de hersenen wordt gehaald en weer verlicht om de fluorescent gelabelde kernen van belang te vinden. De heldere structuren die oplichten nabij het ventrale oppervlak van de hersenstam in figuur 2B zijn de twee ventrale kernen van het trapezium lichaam, die we gebruikten de leidraad en een doelwit voor onze tracer injecties. Figuren 4 en 5 tonen representatieve resultaten van een anterograde injectie in de ventrale kern van het trapezium lichaam (VNTB) via tetramethylrhodamine dextran (TRITC,. Figuur 4) en twee retrograde injecties in de mediale nucleus van de trapezoïde lichaam (MNTB) via choleratoxin subunit B (CTB, Figuren 5A en B) en TRITC (Figuren 5C en D). Bright axonale etiket aangeeft (in dit geval remmende) projecties van VNTB tot MNTB blijkt na een anterograde injectie in VNTB (figuur 4). Figuren 5A en 5C tonen een overzicht van het terreinvan injectie (MNTB) met de kern met de retrogradely gelabelde cellen (VNTB) ernaast. Figuren 5B en 5D tonen vergrote afbeeldingen van retrogradely gelabelde somata van glycinergic VNTB cellen in dezelfde secties zoals weergegeven in figuur 5A en 5C. Merk op hoe de retrograde traceren met CTB stelselmatig een punctata patroon 12-13 (figuur 5B), terwijl VNTB cellen retrograde gelabeld met TRITC vertonen een zeer dichte Golgi-achtige labeling 21 (figuur 5D).
Figuur 1:. Optische Genotypering van GlyT2-GFP-positieve en GlyT2-GFP-negatieve muizen Het GFP-positieve muizen werden gefotografeerd onder (A) normaal licht, (B) na laser belichting met een 405 nm laser pointer zonder groen- filtering veiligheidsbril en (C)na laser belichting met de laser en UV-veiligheidsbril. Een sterk GFP-signaal is zichtbaar in de ruimte boven het cerebellum en de hersenstam. (D) Daarentegen hebben GlyT2-GFP-negatieve pups uit dezelfde muizenlijn en leeftijd (p2) geen tekenen van fluorescentie in dezelfde gebieden ( achterkant van het hoofd en het ruggenmerg). De blauwe laser licht effectief wordt gefilterd door de bril.
Figuur 2: Optische genotypering en een Voorbereid Brain Explantatie. Schedel (A) een p4 GlyT2-GFP muis pup wordt blootgesteld aan laser verlichting en bekeken door banddoorlaatfiltering bril. Het fluorescerend GFP kan worden waargenomen door de schedel. (B) Een hersenen van explant dezelfde pup in een preparaat schotel op laser belichting, zoals gezien door de filtering bril. Glycinergic axons en hersenen kernen, zoals de ventrale kern van het trapezium lichaam (VNTB) kunnen worden beschouwd als very heldere structuren in de buurt van de hersenen oppervlak.
Figuur 3: Overzicht Meer dan een in vitro druk injectie en elektroporatie Setup. (A) 1: stereoscoop, 2: gemonteerde laser pointer (405 nm golflengte), 3: headstage met injectie pipet gemonteerd op een micromanipulator, 4: voorbereiding schotel met de hersenen explant, 5: een PC met geïnstalleerde MC Stimulus software, 6: druk injectie-inrichting, verbonden met de injectiepipet sondevoedering (B) 7:. stimulus isolatie-eenheid, 8: hoge intensiteit illuminator, 9: stimulator. De stimulator is verbonden met de elektrode in de pipet via stimulering isolatie-eenheid en wordt aangedreven door de PC.
Figuur 4: Anterograde Tracing van remmende verbindingen van VNTB aan de mediale kern van het Trapezium Body (MNTB). Getoond wordt een maximale projectie van een confocale stack genomen in een horizontale segment uitstrekt over ongeveer 200 micron diep in een open hersenen van een p14 GlyT2-GFP muis. Na een tetramethylrhodamine dextran (TRITC) injectie in de caudo-mediale gedeelte van de VNTB, helder gelabelde axonale verbindingen (en in sommige gevallen de terminal eindes) vanaf VNTB tot MNTB worden waargenomen. Schaal bar: 200 pm.
Figuur 5:. Retrograde tracer Injecties in MNTB Reveal gevuld Glycinergic Cellen in de VNTB Getoond zijn maximaal projecties van confocale stapels die in coronale plakjes van P88 (A, B) en p80 (C, D (in meer dan ca. 50 pm). ) GlyT2-GFP muis. (A) Een overzicht van een choleratoxin subunit B (CTB) injectie in het mediale gedeelte van de MNTB. (B) Glycinergic cellen in de VNTB gevuld met CTB (rood puncta in de cel somata) als gevolg van de in figuur 5A injectie. Enkele puncta vermelden buiten de cellen, die indicatief andere GFP-negatieve (niet-glycinergic) celtypen in het VNTB gevuld, en kan zijn (vanwege gewonden vezels van passage in het gebied van injectie, bijvoorbeeld) . (C) Een overzicht van een retrograde TRITC injectie gericht op de MNTB. Note, hoe een aantal cellen is gevuld met TRITC de MNTB elektroporatie (in tegenstelling tot de zuiver druk ingespoten CTB in figuur 5A). (D) Retrograde labeling van glycinergic VNTB cellen na een TRITC injectie in de MNTB (zelfde injection zie figuur 5C). De meeste cellen vertonen een dikke gele of oranje labeling, omdat het mengsel van twee fluorescentiesignalen (inheemse GFP expressie en de vulling met de rode TRITC). Vergelijk met een GFP-positieve cellen die om wat voor redengingen niet op de kleurstof (blauwe pijl) en een tracer gemerkt GFP-negatieve cel verschijnen diep rood en mogelijk gevuld is, als gevolg van een axonale verwonding op het gebied van injectie (rode pijl). Let op de verschillende kleuringspatroon cel somata in retrograde tracer injecties met CTB (Figuur 5B) en TRITC (Figuur 5D). Schaalbalken: Figuren 5A en 5C: 200 urn, Figuren 5B en 5D: 20 pm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Een algemene kracht van in vitro elektroporatie tracer, in tegenstelling tot in vivo opsporen studies, is dat het onderzoekers betere toegang tot de hersenen interessegebied en dus niet duur stereotactische (vaak elektrofysiologische) materiaal omvatten. Bovendien is de overlevingsperiode nodig voor de hersenen explantaten omvat slechts een paar uur (1 - 4) in plaats van dagen of zelfs weken bij in vivo tracer injecties (zie een gedetailleerd overzicht van het gebruik van dextran aminen en andere tracers in in vivo injecties van Lanciego en Wouterlood, 2011 22, maar ook Rodriguez-Contreras, et al., 2008 23), zodat mislukte injecties al tijdens de injectieprocedure kan worden gedetecteerd of uiterlijk, de volgende dag, zodat dat de injectie parameters dienovereenkomstig worden aangepast. De korte termijn overleving van de hersenen explantaten betekent ook dat er gewoonlijk een kleiner verschil tussen de <em> effectief (gebied waar kleurstof was opgenomen door neuronen in anterograde of axonale terminals in retrograde injecties) en het schijnbare (gebied waar kleurstof gemorst, zonder dat opgenomen) injectieplaats, hoewel dit verschil kan niet worden uitgesloten volledig en alleen kan worden gekwantificeerd / gecontroleerd voor post-hoc, die in sommige gevallen helemaal niet mogelijk kan zijn (zie Albrecht et al., 2014 voor een gedetailleerde bespreking 24).
Er zij opgemerkt, dat verbindingen van vrijwel elke lengte kan worden bestudeerd met deze werkwijze, zolang de experimentator kan zowel het geïnjecteerde gebied en de doel- of brongebied van axonale uitsteeksels in één stuk hersenweefsel te behouden. De visualisatie van dergelijke verbindingen kan worden bereikt door ofwel reconstructie van confocale afbeeldingsstapels verkregen na het snijden en monteren van de hersenen (zoals hier beschreven) of hele hersen / brain imaging technieken plak na het uitvoeren tissue duidelijkeing protocollen (zie hoofdstuk 5 in dit protocol voor een voorbeeld).
Het grote voordeel van onze techniek van lasergestuurde in vitro elektroporatie is de aanzienlijke toename richten nauwkeurigheid tijdens tracer injecties. De oorspronkelijke methode van in vitro elektroporatie vertrouwt op slechts visuele controle door zich te richten bepaalde topografische markers of het gebruik ervan als benaderende gidsen voor het gebied van de injectie. Hetzelfde geldt voor de kleurstof spreiding in het doelgebied: men kan de kleurstof verspreiden observeren, maar het is niet eenvoudig om de kleurstof verspreid op een fijnere wijze bedienen. Met de laser modificatie van deze werkwijze kan een onderzoeker gemakkelijk kernen en cellen van belang en observeer de kleurstof verspreid in de kern / celpopulatie plaats door de interactie van de inheemse genetisch aangedreven fluorescentie en de fluorescentie van de kleurstof. Zo, een onderzoeker krijgt meer controle over zijn / haar tracing experiment door het minimaliseren van valse positieven in antero of retrogradevullingen, omdat cellen / axonale terminals buiten de kern / gebied van belang tijdens de injectie, maar ook gevuld waren. Dit betekent uiteraard niet dat de absolute controle van het effectieve injectieplaats, die, zoals eerder vermeld, kunnen verschillen van de schijnbare plaats. Een nadeel van deze techniek is natuurlijk de beschikbaarheid van genetisch gemodificeerde organismen. Muizen zijn een veel gebruikte genetisch modelorganisme in zoogdierlijke studies, wat ook geldt voor de auditieve veld, maar zoogdierlijke modellen kan beter worden beschouwd, omdat ze lijken op de menselijke audiogram nauwkeuriger. Aldus kunnen andere technieken worden toegepast om neuronale populaties in wildtype dieren van andere soorten beter geschikt voor een bepaald type onderzoekgebied (bijv gerbils of chinchilla in studies van het gehoorsysteem 25-28) label: dit kan omvatten virale injecties te maken van bepaalde initiatiefnemers richten alleen bepaalde compartimenten van de hersenen en het uiten van tlent markers in slechts een subset van hersencellen. Uiteraard extra zorg moet worden genomen om de geldigheid van de tot expressie genetische constructen waarborgen de juiste subpopulatie van neuronen, ongeacht of dergelijke constructen viraal uitgedrukt in wildtype dieren of binnenland knock-in muis lijnen.
Zoals reeds gezegd, het voordeel muismutanten expressie fluorescente eiwitten in bepaalde subpopulaties van neuronen maakt ook de functionele karakterisatie van hersenenschakelschema (in ons geval konden we remmende projecties karakteriseren van een auditieve hersenstam nucleus een andere 24 door pure visualiseren de resultaten van onze experimenten tracing). Nogmaals, de geldigheid van de tot expressie genetische constructen moet worden bevestigd alvorens de interpretatie van de resultaten van de tracering experimenten kan plaatsvinden.
Een andere algemene sterkte van in vitro elektroporatie is de compatibiliteit met andeer anatomische methoden, zoals (immuno) histochemie en hersenen clearing. Zoals aangetoond eerder 24, wordt niet beïnvloed door de toepassing van de aanvullende vlekken technieken zoals Nissl, of een brain clearing methode genaamd ClearT2 12 20,24. Het grote nadeel dat men in gedachten te houden is dat de penetratie diepte van Nissl en antilichaam vlekken zal afnemen met toenemende dikte van het weefsel, zodat men de mogelijkheden van axonale proces behoud wegen dikkere plakken versus signaalsterkte van extra (immuno) histochemische kleuring in experimenten waarbij zowel anatomische etikettering methoden nodig. Natuurlijk, een andere factor die meespeelt is de excitatie / emissie bandbreedte scheiding van de verschillende fluorescerende labels, omdat de minimale aantal labels begint om drie markers op dit punt (inheemse fluorescerend eiwit expressie, tracer en Nissl / antilichaam labeling).
Uiteraard kan onze beschreven werkwijze worden uitgebreidinjecties van elke vorm van fluorescente markers (inclusief kwantum kralen) in de hersenen explantaten of zelfs de hersenen plakjes van transgene muizen. Daar de nauwkeurigheid injectie hangt zowel een duidelijk doel detectie (de waarneming van fluorescent gelabelde kernen en cellen) en een fijnere controle over de lekkage van de fluorescerende kleurstof, slechts één van deze twee elementen moeten volstaan voor verhoogde nauwkeurigheid injectie, zelfs wanneer de andere afwezig. Dit betekent dat verschillende niet-fluorescerende merkers (zoals virale constructen of andere DNA / RNA-vectoren) kunnen worden geïnjecteerd nauwkeuriger kernen in de hersenen plaats, zolang als het doel kernen zijn duidelijk zichtbaar voor de experimentator. Deze laatste toepassing is bijzonder interessant, omdat elektroporatie toelaat effectieve opname van DNA materiaal en 29-30, waardoor onze werkwijze bijna ideaal voor dergelijke injecties. Het enige nadeel dat moet worden overwogen is dat DNA-constructen tijd nemen te drukken en het probleem van levende tissue behoud ontstaat. Dit kan worden ondervangen door het bewijs organotypische brain slice cultures 31-32 gebaseerd op geïnjecteerd hersencoupes (of opnieuw gesneden hersenweefsel blokken), die het mogelijk maken levend weefsel conservering in de orde van weken.
En natuurlijk andere transgene muis mutanten kunnen worden gebruikt om de connectiviteit van andere neuronale types zoals cholinergische zenuwcellen te onderzoeken (bijv ChAT-GFP muizen 33), waardoor deze werkwijze een veelzijdig gereedschap voor connectiviteit en functionaliteit van de hersenen (micro) circuits bestuderen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
We hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Ondersteund door NIH / NIDCD R01 DC 011582. Imaging experimenten werden uitgevoerd aan de Universiteit van Colorado Anschutz Medical Campus Advanced Light Microscopy Core mede ondersteund door NIH / NCRR Colorado CTSI Grant Aantal UL1 RR025780 en de Rocky Mountain Neurlogical Disorders Core Center Grant NIH P30NS048154. Dr. Sascha du Lac van het Salk Institute gaf ons de GlyT2-GFP muizen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | All chemicals are from Sigma-Aldrich, unless noted otherwise. |
| Potassium chloride | P9333 | ||
| Potassium phosphate monobasic | P5655 | ||
| Sodium phosphate di-basic | S907 | ||
| Magnesium chloride | M2670 | ||
| Calcium chloride | C5080 | ||
| Glucose | G7528 | ||
| Sodium bicarbonate | S6297 | ||
| Ascorbic acid | A4544 | ||
| Myo-inositol | I5125 | ||
| Sodium pyruvate | P2256 | ||
| Bovine serum albumine | A2153 | optional, for additional (immuno)histochemistry | |
| Triton-X-100 | X100 | optional, for additional (immuno)histochemistry | |
| Poly(ethylene glycol), 8000 MW | P2139 | optional, for brain clearing | |
| Formamide | Fisher Scientific | F84 | optional, for brain clearing |
| Choleratoxin subunit-b | Molecular Probes | C-34776 (Alexa 555) | |
| Dextrane tetramethyl-rhodamine | Molecular Probes | D-7162 (Alexa 555) | |
| Fluorescent Nissl | Invitrogen | N-21479 (blue) | optional |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | SF93 | |
| Agarose | Invitrogen | 16520 | |
| Fluoromount-G | Southern Biotech | 0100-01 | |
| Pentobarbi-tal | Vortech Pharmaceuticals | Fatal-Plus | |
| Borosilicate glass filaments | Harvard Apparatus | G150F-10 | |
| Pipette puller | Zeitz Instruments, Germany | DMZ Universal Puller | |
| Perfusion setup | Custom-made | ||
| Laser pointer | laserpointerpro.com, Hong Kong | HK-88007294 (405 nm) | |
| Filter/safety goggles | Dragon Lasers, China | LSG09 (band-pass 450-700 nm) | |
| Bionocular microscope | Wild Heerbrugg, Switzerland | Wild M3 | Equipped with high-intensity illuminator (MI-150; Dolan-Jenner Inc.) |
| Picospritzer | Parker Instruments | Picospritzer III | |
| PC with installed MC Stimulus software | Multi Channel Sys-tems, Germany (software) | ||
| 2-channel stimulator | Multi Channel Sys-tems, Germany | STG-1002 | |
| Stimulation isolation unit | A.M.P.I., Israel | Iso-Flex | |
| Micromanipulator | Narishige, Japan | YOU-1 | |
| Vibratome | Leica, Germany | VT1000S |
References
- Waller, A. Experiments on the sections of glossopharyngeal and hypoglossal nerves of the frog and observations of the alterations produced thereby in the structure of their primitive fibers. Philos. Trans. R. Soc. Lond. 140, 423-429 (1850).
- Fink, R. P., Heimer, L. Two methods for selective silver impregnation of degenerating axons and their synaptic endings in the central nervous system. Brain Res. 4, 369-374 (1967).
- Nauta, W. J. Selective silver impregnation of degenerating axons in the central nervous system. Stain Technol. 27, 175-179 (1952).
- Ramón y Cajal, S. Histologie du système nerveux de l'Homme et des vertébrés. , Maloine, Paris. (1911).
- Kristensson, K., Olsson, Y. Uptake and retrograde transport of peroxidase in hypoglossal neurons. Electron microscopical localization in the neuronal perikaryon. Acta Neuropathol. 19, 1-9 (1971).
- Kristensson, K., Olsson, Y. Retrograde axonal transport of protein. Brain Res. 29, 363-365 (1971).
- Burger, R. M., Cramer, K. S., Pfeiffer, J. D., Rubel, E. W. Avian superior olivary nucleus provides divergent inhibitory input to parallel auditory pathways. J. Comp. Neurol. 481, 6-18 (2005).
- Ford, M. C., Grothe, B., Klug, A. Fenestration of the calyx of Held occurs sequentially along the tonotopic axis, is influenced by afferent activity, and facilitates glutamate clearance. J. Comp. Neurol. 514, 92-106 (2009).
- Glover, J. C., Petursdottir, G., Jansen, J. K. S. Fluorescent dextran amines used as axonal tracers in the nervous system of chicken embryo. J. Neurosci. Methods. 18, 243-254 (1986).
- Trojanowski, J. Q., Gonatas, J. O., Gonatas, N. K. Conjugates of horseradish peroxidase (HRP) with cholera toxin and wheat germ agglutinin are superior to free HRP as orthograde transported markers. Brain Res. 223, 381-385 (1981).
- Trojanowski, J. Q., Gonatas, J. O., Steiber, A., Gonatas, N. K. Horseradish peroxsidase (HRP) conjugates of cholera toxin and lectins are more sensitive retrograde transported markers than free HRP. Brain Res. 231, 33-50 (1982).
- Conte, W. L., Kamishina, H., Corvin, J. V., Reep, R. L. Topography in the projections of lateral posterior thalamus with cingulate and medial agranular cortex in relation to circuitry for directed attention and neglect. Brain Res. 1240, 87-95 (2008).
- Conte, W. L., Kamishina, H., Reep, R. L. Multiple neuroanatomical tract-tracing using fluorescent Alexa Fluor conjugates of cholera toxin subunit B in rats. Nat. Protoc. 4, 1157-1166 (2009).
- Haas, K., Jensen, K., Sin, W. C., Foa, L., Cline, H. T. Targeted electroporation in Xenopus tadpoles in vivo- from single cells to the entire brain. Differentiation. 70, 148-154 (2002).
- Zeilhofer, H. U., et al. Glycinergic neurons expressing enhanced green fluorescent protein in bacterial artificial chromosome transgenic mice. J. Comp. Neurol. 482, 123-141 (2005).
- Poyatos, I., Ponce, J., Aragön, C., Giménez, C., Zafra, F. The glycine transporter GLYT2 is a reliable marker for glycine-immunoreactive neurons. Brain. Res. Mol. Brain Res. 49, 63-67 (1997).
- Gong, S., et al. A gene expression atlas of the central nervous system based on bacterial artificial chromosomes. Nature. 425, 917-925 (2003).
- Heintz, N. Bac to the future: the use of BAC transgenic mice for neuroscience research. Nat. Rev. Neurosci. 2, 861-870 (2001).
- Franklin, K. B. J., Paxinos, G. The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , 3rd ed, Elsevier/Academic Press. New York. (2008).
- Kuwajima, T., Sitko, A. A., Bhansali, P., Jurgens, C., Guido, W., Mason, C. ClearT: a detergent- and solvent-free clearing method for neuronal and non-neuronal tissue. Development. 140, 1364-1368 (2013).
- Wouterlood, F. G., Jorritsma-Byham, B. The anterograde neuroanatomical tracer biotinylated dextran amine: comparison with the tracer PHA-L in preparations for electron microscopy. J. Neurosci. Methods. 48, 75-87 (1993).
- Lanciego, J. L., Wouterlood, F. G. A half century of experimental neuroanatomical tracing. J. Chem. Neuroanat. 42, 157-183 (2011).
- Rodriguez-Contreras, A., Silvio, J., van Hoeve, S., Habets, L. P., Locher, H., Borst, J. G. G. Dynamic development of the calyx of Held synapse. PNAS. 105 (14), 5603-5608 (2008).
- Albrecht, O., Dondzillo, A., Mayer, F., Thompson, J. A., Klug, A. Inhibitory projections from the ventral nucleus of the trapezoid body to the medial nucleus of the trapezoid body in the mouse. Front. Neural Circuits. 8, 83 (2014).
- Benson, D. A., Teas, D. C. Single unit of binaural interaction in the auditory cortex of the chinchilla. Brain Res. 103, 313-338 (1976).
- Koka, K., Jones, H. G., Thornton, J. L., Lupo, J. E., Tollin, D. J. Sound pressure transformations by the head and pinnae of the adult Chinchilla (Chinchilla lanigera). Hear Res. 272 (1-2), 135-147 (2011).
- Ryan, A. Hearing sensitivity of the mongolian gerbil, Meriones unguiculatus. J. Acoust. Soc. Am. 59 (5), 1222-1226 (1976).
- Zwicker, E., Fastl, H. Psychoacoustics Facts and Models. , Springer. (1990).
- Chu, G., Hayakawa, H., Berg, P. Electroporation for the efficient transfection of mammalian cells with DNA. Nucleic Acids Res. 15 (3), 1311-1326 (1987).
- Klenchin, V. A., Sukharev, S. I., Serov, S. M., Chernomordik, L. V., Chizmadzhev, Y. A. Electrically induced DNA uptake by cells is a fast process involving DNA electrophoresis. Biophys J. 60 (4), 804-811 (1991).
- Elias, L., Kriegstein, A. Organotypic Slice Culture of E18 Rat Brains. J. Vis. Exp. (6), e235 (2007).
- Gähwiler, B. H. Organotypic monolayer cultures of nervous tissue. J. Neurosci. Methods. 4 (4), 329-342 (1981).
- Tallini, Y. N., et al. BAC transgenic mice express enhanced green fluorescent protein in central and peripheral cholinergic neurons. Physiol Genomics. 27 (3), 391-397 (2006).
