Summary
Nous décrivons une technique d'étiqueter les neurones et leurs processus via antérograde ou rétrograde traceurs injections dans les noyaux du cerveau en utilisant une préparation in vitro. Nous avons modifié une méthode existante de i n vitro traceur électroporation en profitant de marqué par fluorescence mutants de souris et de l'équipement optique de base afin d'augmenter la précision de l'étiquetage.
Abstract
Nous présentons une technique qui combine un protocole vitro traceur dans d'injection, qui utilise une série d'impulsions électriques et de pression pour augmenter l'absorption du colorant par électroporation dans des explants de cerveau avec un éclairage laser ciblée et correspondant à des lunettes filtrantes pendant la procédure. La technique décrite de l'électroporation in vitro par lui-même des rendements relativement bon contrôle visuel pour ciblant certaines zones du cerveau. En combinant avec excitation laser de marqueurs génétiques fluorescentes et leur lecture à travers des lunettes de filtre bande-passe, qui peut ramasser les émissions des cellules / noyaux génétiquement marqués et le colorant de traçage fluorescent, un chercheur peut augmenter considérablement la précision des injections en trouvant la zone d'intérêt et contrôle de la propagation de colorant / absorption dans la zone d'injection beaucoup plus efficacement. En outre, la technique d'éclairage au laser permet d'étudier la fonctionnalité d'une neurocircuit donnée par provIding informations sur le type de neurones se projetant dans une certaine zone dans les cas où l'expression de la GFP est liée au type d'émetteur exprimé par un sous-population de neurones.
Introduction
Afin de définir un certain neuronale (micro) circuit, il faut commencer par trouver les différents acteurs de ce circuit, et leur mode de connexion. Depuis la publication de Waller propos neurofiber traçage travers lesioning 1 une grande variété de techniques de traçage neuroanatomiques a été établi. Certaines de ces techniques peuvent être appliquées dans les tissus post-mortem 2-4 fixe, d'autres comptent sur le transport actif du colorant dans les neurones vivants, comme l'a découvert en 1971 5-6. Celui-ci peuvent être subdivisés en deux groupes de discrimination entre les méthodes qui prennent avantage de rétrograde active (à partir de la zone injectée à la source d'une projection donnée, ie. Le soma des neurones qui sont saillie vers ladite zone) et antérograde active (de la injecté zone à la cible d'une projection donnée, ie. les projections axonales et les terminaisons axonales des neurones marqués) transport. En outre, dans certains cas, tramatériel de CER est injecté dans les animaux vivants qui a ensuite survivent à l'injection de plusieurs jours ou semaines (en injections de traceurs in vivo), tandis que dans d'autres cas cerveaux explantées sont injectés et incuber pendant plusieurs heures après l'injection dans le liquide céphalo-rachidien artificiel (in vitro injections de traceurs) .
Dans ce protocole, nous avons modifié un existant in vitro technique d'électroporation 7-8 à étiqueter soma et les processus neuronale dans antérograde et rétrograde traçage des expériences utilisant dextran choleratoxine la sous-unité B et tétraméthylrhodamine que les substances de traçage. L'objectif global de ce protocole est de fournir des neuroscientifiques un outil efficace de suivre les modèles de connectivité neuronale entre les différents noyaux du cerveau, tout en profitant des lignées de souris transgéniques et des équipements disponibles optique de base afin d'augmenter la précision de ciblage lors des injections de traceurs. Bien que la méthode de traçage antérograde et rétrograde en utilisanttoxine cholérique et amine dextrane et leurs conjugués marqués par fluorescence respectifs sont pas nouvelles 9-13 (ce qui est la méthode de l'électroporation, par exemple. Haas et al. 14), la combinaison d'injections traçantes avec une électroporation dans une préparation in vitro impliquant des blocs de tissu de cerveau est un développement plus récent 7. Son principal avantage par rapport aux techniques de traçage de neurones en utilisant le même type de colorants traceurs dans les animaux vivants est l'intensité de marquage accru, en raison de la plus grande efficacité avec laquelle le colorant est une électroporation repris par les neurones. Un avantage supplémentaire est la période d'incubation de raccourci (obligatoire pour le transport de colorant) et de sa précision accrue cible lors de l'injection du traceur, parce que l'expérimentateur a le contrôle visuel sur la zone cible de l'injection. Ce dernier signifie aussi qu'aucun équipement stéréotaxique coûteux est nécessaire de trouver le noyau ou le cerveau zone d'intérêt.
Pour Addilement augmenter la précision du ciblage, nous avons profité d'une lignée de souris transgénique qui exprime la GFP dans son sous-population glycinergique de neurones 15 et l'équipement optique de base consistant en un pointeur de 405 nm lunettes de filtrage passe-bande de longueur d'onde et l'appariement laser à main (450 - 700 nm). Ainsi, nous avons réalisé une nouvelle augmentation significative dans le ciblage de précision en identifiant la zone d'injection au travers de son signal fluorescent et en fournissant un moyen plus fin pour contrôler la propagation du colorant dans la zone d'injection à travers l'observation de l'interaction entre le signal de la GFP indigène et le traceur fluorescence. Notre technique permet également de découvrir la fonctionnalité d'un circuit en même temps que sa connectivité en identifiant les neurones inhibiteurs GFP-positives (ou d'autres excitateurs dans des lignées de souris) qui ont été remplis avec le traceur.
En résumé, nous avons amélioré un outil puissant pour étudier neuroscientifique le connectome du cerveau des vertébrés et évaluer til différentes fonctions neuro-anatomiques d'un neurocircuit donné. En utilisant des souris transgéniques avec l'équipement optique peu coûteux et largement disponible, nous avons réussi à augmenter significativement la précision de ciblage de nos injections. En outre, les souris transgéniques nous a permis d'identifier le type de connexions tracées, ce qui a permis la découverte de la fonctionnalité d'un microcircuit inhibitrice dans le tronc cérébral.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Génotypage optique
1. optique génotypage des chiots souris
- Arrivée à l'expression du marqueur fluorescent respectif au moyen d'un pointeur laser de la longueur d'onde d'excitation appropriée (405 nm dans les expériences décrites ici) et des lunettes de filtre de blocage de la longueur d'onde d'excitation correspondant, mais en passant la longueur d'onde d'émission (450 - 700 nm dans les expériences décrites ici) . Dirigez le pointeur laser à l'arrière de la tête ou de la moelle épinière du chiot de la souris (voir la figure 1). Évitez de diriger le laser dans les yeux et une longue exposition de la peau à la lumière laser.
2. optique génotypage des animaux âgés
- Profondément anesthésier la souris (p14 ans à p138 dans les expériences décrites ici) avec un surdosage de pentobarbital par une injection intrapéritonéale (120 mg / kg de poids corporel). Confirmez anesthésie appropriée en cochant les réflexes de l'animal (pincer brièvement la pointe du ee oreille ou l'une des pattes arrière pour susciter le réflexe de retrait de la patte ou oreille).
- Remarque: Malgré l'utilisation d'un surdosage de pentobarbital (120 mg / kg de poids corporel) nous nous référons à la procédure d'injection comme «anesthésie profonde" à la place de l'euthanasie, parce que l'animal est idéalement encore vivant (ie son cœur bat encore), lorsque le la chirurgie et la perfusion ne commencent. Ceci assure une perfusion plus efficace des organes internes, y compris le cerveau.
- Une fois que l'animal ne présente pas de réflexe, retirez soigneusement la peau recouvrant le crâne (figure 2A) en faisant une incision dans la peau qui recouvre l'arrière de la tête et à l'abdomen coupe du crâne. Exposer le crâne découvert à la lumière laser et d'observer la fluorescence à travers les lunettes de filtres comme décrit ci-dessus. Si un signal de GFP positive est observée, passez à l'étape 2, sinon, sacrifier l'animal par décapitation (deuxième / assurant forme d'euthanasie suite à notreRèglements IACUC).
Note: Chez la souris, même plus âgés (> 1 mois) la fluorescence peut être observée à travers les yeux de l'animal.
2. Transcardial Perfusion et préparation cerveau
- Perfuser transcardiaque avec glacée tampon phosphate salin (PBS; NaCl: 137 mM, KCl: 2,7 mM, KH 2 PO 4: 1,76 mM, Na 2 HPO 4: 10 mm) à l'aide d'une aiguille de seringue de 30 G pour éliminer en grande partie le sang l'animal.
- Tout d'abord, ouvrir avec précaution la cage thoracique avec des ciseaux pointus, puis pousser l'aiguille dans le ventricule gauche du cœur. Commencez le pompage du PBS dans le cœur et l'aorte et immédiatement après cette étape ouvre l'oreillette droite du cœur avec les ciseaux pour permettre au sang de quitter le corps. Remarque: La perfusion prend de 5 à 10 min selon la taille de l'animal.
- Après exsanguination par perfusion, décapiter l'animal, assurer sa tête avec la broche needles (ou 30 g aiguilles de seringues) en les perçant à travers les orbites dans un plat de préparation et retirer le cerveau du crâne.
- Tout d'abord, utiliser des ciseaux bien aiguisés pour couper la peau recouvrant le crâne: faire une petite incision dans le dos de la tête, puis couper le long de la ligne médiane sur la face dorsale de la tête, couper les côtés juste caudale des yeux de l'animal et la coupe enfin dans la direction caudale pour supprimer complètement les volets de la peau à l'arrière de la tête.
- Ensuite, répéter le même schéma de coupe pour le crâne lui-même, assurez-vous de retirer les deux cochlées dans le processus, parce que cela va simplifier considérablement le retrait du tronc cérébral à la fin. Après cette procédure, la moitié caudale du cerveau devrait se situer complètement exposé.
- Dans l'étape suivante, utiliser une lame de rasoir ou un scalpel pour couper à travers l'ensemble du cerveau antérieur à un angle d'environ 45 ° et environ 2 mm rostrale du cervelet. Scoop sur la moitié avant séparée du cerveau avec abspatule ent.
- Utilisez la spatule pour élever la moitié caudale du cerveau à son extrémité rostrale et couper ensuite à travers les nerfs crâniens qui sont encore connectés à la tige du cerveau sur sa face ventrale. Comme un résultat final, la moitié caudale du cerveau, y compris du tronc cérébral doit tomber librement hors du reste de la tête préparés pour animaux.
- Retournez la moitié caudale retiré du cerveau pour exposer son côté ventral et une coupe le long du plan coronal juste rostrale (pour les injections de antérograde) ou tout simplement caudale (pour les injections rétrogrades) des "ampoules" ventre situés contenant le corps de trapèze (voir l'étape 2.3).
- Toujours utiliser une lame de rasoir ou un scalpel pour la procédure de coupe pour minimiser la mort cellulaire provoquée par le stress mécanique excessive sur le tissu. En tant que résultat final, un explant de cerveau couvrant environ 1 cm de longueur et contenant le complexe olivaire supérieur le long de toutes les autres régions du cerveau aurait été obtenue.
Remarque: Ce protocole illustre la procédure pour une injection de traceur dans le corps de trapèze située dans le tronc cérébral. Adapter l'emplacement et l'orientation des plans de coupe et les sites d'injection selon les besoins. Si les régions du cerveau fluorescence d'intérêt se trouvent assez près de la surface du cerveau, de sorte qu'ils puissent être identifiés et injectés sans couper le cerveau (voir Figure 2B), puis l'étape de coupe coronale peut être omis.
- Identifier le corps de trapèze comme deux "ampoules" éminents ventraux contenant le noyau ventral du corps de trapèze (VNTB).
Remarque: Pour plus de renseignements concernant l'emplacement anatomique stéréotaxique approximative de ces plans de coupe, voir Franklin & Paxinos, 2008. 78 du Groupe spécial de l'atlas, Bregma ~ -5,7 mm montre le noyau médial du corps de trapèze (= MNTB) étiqueté comme "Tz ». Panneau 69 montre le noyau ventral de la bo de trapèzedy (VNTB) étiqueté comme "MVPO" (de noyau periolivary medioventral) 19.
3. antérograde / rétrograde Tracing
Remarque: Effectuer toutes les procédures suivantes à la température ambiante (25 ° C).
- Après la coupe, placer l'expiant du tronc cérébral dans un plat de préparation contenant oxygéné (95% O 2, CO 2 5%) dissection solution (NaCl: 125 mM, KCl: 2,5 mM, MgCl 2: 1 mM, CaCl 2: 0,1 mM, glucose : 25 mM, NaH 2 PO 4: 1,25 mM, NaHCO 3: 25 mM, de l'acide ascorbique: 0,4 mM, myo-inositol: 3 mM, acide pyruvique: 2 mM), en le fixant avec 30 g aiguilles de seringue. Assurez-vous que la zone d'injection est orientée vers le haut.
- Tirer pipettes d'injection à partir de verre de borosilicate et de les remplir avec l'une des trois solutions suivantes: a) une solution à 1,0 mg / ml de toxine cholérique sous-unité b conjugué à un fluorophore Alexa 555 dans du PBS 12 à 13 (principalement utilisé pour le transport rétrograde), b ) une -d 1%ilution salée à 0,9% de dextran tétraméthylrhodamine 555 (3.000 MW, principalement utilisé pour le transport rétrograde) ou c) une dilution à 1% dans une solution saline à 0,9% de 10.000 MW dextran-TRITC 555 (principalement utilisé pour le transport antérograde).
- Veiller à ce que des résistances gamme de pipettes d'injection entre 2,5 et 3,5 MOhm et qu'ils sont fabriqués dans 3 - 4 cycles de traction. Pour les expériences décrites ici, faire cela par un algorithme tirant pré-programmé sur l'extracteur de la pipette.
- Eclairer l'explantation de cerveau à l'aide d'un pointeur laser monté statiquement de la longueur d'onde appropriée (point n ° 2 sur la figure 3A; 405 nm de longueur d'onde dans les expériences décrites ici). Utiliser le pointeur laser en tant que guide pour les injections, et diriger le faisceau laser au niveau du noyau du cerveau marqué par fluorescence ou des cellules d'intérêt qui sera injecté.
- Trouvez et observer la zone de cible éclairée par le biais d'un microscope binoculaire, tout en portant les lunettes de filtres compatibles (450 - 700 nm filtre passe-bande dans les expériences décrites ici). Insérez l'électrode d'injection par l'intermédiaire du micromanipulateur dans la zone d'intérêt.
- Injecter la substance de traceur. Les injections se composent de 2 - 10 impulsions de pression à 15 psi pendant 50 ms chacune, au moyen d'un dispositif d'injection sous pression, dirigé perpendiculairement à la région d'intérêt (ROI) dans la même section du cerveau. Administrer chaque impulsion de pression à des intervalles de 10 à 15 secondes pour permettre au colorant de se propager.
- Dans le cas des injections de tétraméthylrhodamine (TRITC), stimuler électriquement en outre à améliorer l'absorption du colorant par électroporation avec l'électrode placée dans la zone d'intérêt de cerveau (MNTB VNTB et dans les expériences décrites ici).
- Utilisation 8 impulsions TTL de 8 Volts pendant 50 ms à 50 ms, des intervalles interimpulsions entraînés par un stimulateur et amplifiés à 55 V avec une unité d'isolation de stimulation (éléments de n ° 7 et 9 sur la figure 3B). Utilisez 10 - 20 répétitions de ce protocole, adminisnominatives sur plusieurs minutes 7,8. Assurez-vous à la masse l'électrode correctement - le fil de mise à la terre doit être connecté à la solution de bain!
- Vérifiez pour le succès de l'injection. Depuis un traceur fluorescent à une longueur d'onde d'émission plus longue est également émettre un signal fluorescent lors de l'excitation de laser avec des longueurs d'onde plus courtes, vérifier visuellement pour l'absorption de colorant / propager dans la zone cible injecté tout en éclairant la surface avec le laser et l'observation à travers des lunettes filtrantes.
4. Incubation
- Après l'injection, incuber les tronc cérébral dans le liquide céphalo-rachidien artificiel oxygénée (ACSF; NaCl: 125 mM, KCl: 2,5 mM, MgCl 2: 1 mM, CaCl 2: 2 mM, glucose: 25 mM, NaH 2 PO 4: 1,25 mM, NaHCO 3: 25 mM, de l'acide ascorbique: 0,4 mM, myo-inositol: 3 mM, acide pyruvique: 2 mM, barbotage avec 95% de O 2 - 5% CO 2) à température ambiante (TA, 25 ° C) pendant 1 - 4 h, tandis quele colorant est transporté. Bubble la solution au cours de la période d'incubation entier.
- Par la suite, les transférer tronc cérébral dans du paraformaldéhyde 4% (PFA) dissous dans du PBS (environ 100 ml;. PH 7 pour le mélange PFA / PBS) et incuber à 4 ° C pour permettre post-fixation pendant une nuit (O / N).
5. tissus tranchage et de montage
- Le lendemain, laver le tronc cérébral trois fois dans du PBS (5 min pour chaque étape de lavage), le couvrir de 4% de gélose, puis les couper en 50 - 80 um d'épaisses tranches sur une vibratome. Tranches de montage en utilisant un milieu de montage sur une lame de verre, et lamelle.
- Eventuellement, étiqueter les sections avec Nissl fluorescente pendant 25 min (par exemple bleu Nissl à une dilution de 1: 100 dans AB médias).
- Pour préparer AB médias, mélanger 250 ml de 0,2 M de tampon phosphate (PB; 51 mM de KH 2 PO 4, 150 mM de Na 2 HPO 4), 15 ml de NaCl 5 M, 15 ml 10% de Triton-X, 220 ml ddH 2 O et 5 g d'albumine de sérum bovin.
- Preceet de réussir l'étape de marquage par Nissl 3 étapes de lavage dans du PBS (10 minutes chacun).
Remarque: Dans les cas où des sections plus épaisses doivent être montés et analysé (dans les expériences décrites ici ces tranches étaient 100 - 500 microns d'épaisseur pour préserver connexions axonales plus grandes distances), la technique peut être combiné avec compensation de tissu. Nous avons trouvé le ClearT2 12 à 20 soit un succès. Quand une étape de compensation de tissu est inclus, l'exécuter avant de monter les sections.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figures 1 et 2 montrent comment le pointeur laser et lunettes laser peuvent être utilisés pour le génotypage rapide et peu coûteuse GFP animaux positifs d'une portée. Dans les cas de jeunes souriceaux, la technique peut être utilisée pour identifier de manière non invasive l'étiquette de la GFP dans le cerveau de l'animal à travers le crâne et la peau sus-jacente (figure 1A - D). Fluorescence émise peut être vu à travers la peau et le crâne des souriceaux au moins jusqu'au jour postnatal 3 (figure 1C). La procédure est représentée sur la Figure 1 pour notre protéine vert fluorescent (GFP) marqué lignée de souris exprimant la GFP dans sa sous-population de neurones glycinergique (GlyT2-GFP). Chez les animaux plus âgés avec des crânes plus épais et la peau pigmentée, l'étiquette de la GFP montre moins bien à travers la peau et les os, et donc la peau de la tête et / ou le cou doit être supprimé avant la génotypage optique (figure 2A).
Après la perfusionle cerveau des animaux est prélevé à nouveau allumé et à trouver les noyaux marqués par fluorescence d'intérêt. Les structures lumineuses qui éclairent à proximité de la surface ventrale du tronc cérébral sur la figure 2B sont les deux noyaux ventral du corps trapézoïde, que nous avons utilisé à la fois comme un guide et une cible pour les injections traçantes. Les figures 4 et 5 montrent des résultats représentatifs de une injection antérograde dans le noyau ventral du corps trapézoïde (VNTB) en utilisant tétraméthylrhodamine dextrane (TRITC;. la figure 4) et deux injections rétrograde dans le noyau médian du corps de trapèze (MNTB) en utilisant toxine cholérique sous-unité B (CTB, les figures 5A et B) et TRITC (figures 5C et D). Étiquetage clair indiquant axonale (dans ce cas inhibitrice) projections de VNTB à MNTB peut être vu après une injection antérograde dans VNTB (Figure 4). Les figures 5A et 5C montrent un aperçu sur le sited'injection (MNTB) avec le noyau contenant les cellules marqués de façon rétrograde (VNTB) à côté de lui. Les figures 5B et 5D montrent agrandie images de marqués de façon rétrograde soma des cellules VNTB glycinergiques dans les mêmes sections comme affiché dans la figure 5A et 5C. Notez comment le traçage rétrograde CTB se traduit par un modèle plus ponctuée 12-13 (figure 5B), tandis que les cellules VNTB marqués de façon rétrograde avec TRITC affichent une Golgi comme l'étiquetage très dense 21 (Figure 5D).
Figure 1:. Optique génotypage des GlyT2-GFP-positives et GlyT2-GFP-négatif Souris Les souris GFP-positives ont été photographiés sous (A) des conditions d'éclairage normales, (B) lors de l'illumination laser avec un pointeur laser à 405 nm sans le serre Lunettes de filtrage (C) etlors de l'illumination laser avec les lunettes de sécurité laser et UV. Un signal de GFP forte est visible dans la zone au-dessus du cervelet et le tronc cérébral. (D) En revanche, les chiots GlyT2-GFP-négatif de la lignée de souris même et l'âge (p2) ne montrent pas de signes de fluorescence dans les mêmes régions ( arrière de la tête et la moelle épinière). La lumière laser bleue est effectivement filtré par les lunettes.
Figure 2: Génotypage optique et une explantation cerveau Préparé. Le crâne de (A) un P4 GlyT2-GFP souris chiot est exposé à un éclairage laser et vue à travers des lunettes de filtrage passe-bande. La GFP fluorescence peut être observée à travers le crâne. (B) Une explantation du cerveau de la même chiot dans un plat de préparation lors de l'illumination laser, comme on le voit à travers les lunettes de filtrage. Glycinergiques axones et les noyaux du cerveau, telles que le noyau ventral du corps trapézoïde (VNTB) peuvent être considérés comme verstructures lumineuses y à proximité de la surface du cerveau.
Figure 3: Aperçu Au cours in vitro injection sous pression et l'électroporation Setup. (A) 1: stéréoscope, 2: pointeur laser monté (405 nm de longueur d'onde), 3: headstage à la pipette d'injection monté sur un micromanipulateur, 4: plat de préparation contenant l'expiant de cerveau, 5: un PC avec le logiciel MC stimulation installé, 6: Dispositif de pression d'injection, relié à la pipette d'injection par l'intermédiaire d'un tube (B). 7: unité de stimulation de l'isolement, 8: éclairage de haute intensité, 9: stimulateur. Le stimulateur est connecté à l'électrode dans la pipette par l'intermédiaire de l'unité d'isolement de stimulation et est entraîné par le PC.
Figure 4: traçage antérograde des connexions inhibitrices de VNTB vers le noyau médial du Corps Trapèze (MNTB). Montré est une projection maximale d'une pile confocale prise dans une tranche horizontale couvrant environ 200 microns de profondeur dans un cerveau dégagé d'une souris p14 GlyT2-GFP. Après une tétraméthylrhodamine dextrane (TRITC) injection dans la partie caudo-médial de la VNTB, brillamment marqué connexions axonales (et dans certains cas leurs terminaisons terminales) de VNTB à MNTB peut être observée. Barre d'échelle: 200 um.
Figure 5:. Rétrogrades Tracer injections dans MNTB Reveal Filled cellules glycinergiques dans le VNTB indiqués sont des projections maximales de piles confocale prises en coupes coronales d'une p88 (A, B) et une p80 (C, D (couvrant plus environ 50 um.) ) souris GlyT2-GFP. (a) un aperçu d'une toxine cholérique sous-unité B (CTB) injection dans la partie médiane de la MNTB. (B) cellules glycinergiques dans le VNTB sont remplis de CTB (rouge puncta à l'intérieur du corps cellulaires des cellules) à la suite de l'injection représenté sur la figure 5A. Certains des points lacrymaux apparaissent à l'extérieur des cellules, qui pourrait être indicatif d'autres GFP-négatif (non glycinergique) types de cellules dans le VNTB étant rempli, ainsi (en raison des fibres lésées de passage dans la zone d'injection, par exemple) . (C) Un autre aperçu d'une injection de TRITC rétrograde ciblant le MNTB. Notez comment un certain nombre de cellules est rempli avec TRITC dans la MNTB suivant l'électroporation (par opposition à la CTB purement de pression injecté dans la figure 5A). (D) de marquage rétrograde des cellules VNTB glycinergiques après une injection TRITC dans la MNTB (même par injection comme représenté sur la Figure 5C). La plupart des cellules afficher un marquage jaune ou orange dense, en raison du mélange des deux signaux fluorescents (d'expression de la GFP indigène et le remplissage avec le TRITC rouge). Comparer avec une cellule de GFP-positives que pour des raisonsne pas prendre le colorant (flèche bleue) et une cellule de traceur marqué GFP-négatif apparaissant profondément rouge et éventuellement chargée, en raison d'une blessure axonale dans la zone d'injection (flèche rouge). Notez la coloration différente de modèle de corps cellulaires des cellules dans des injections de traceur rétrograde à l'aide de CTB (figure 5B) et TRITC (figure 5D). Les barres d'échelle: les figures 5a et 5c: 200 um, les figures 5B et 5D: 20 pm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
A force générale in vitro traceur électroporation, par opposition aux études in vivo de traçage, est qu'il donne aux chercheurs un meilleur accès à la zone du cerveau d'intérêt et, par conséquent, ne comporte pas stéréotaxique coûteuse (et souvent électrophysiologique) équipement. En outre, la période de survie requis pour les explants de cerveau couvre seulement quelques heures (1 - 4) au lieu des jours, voire des semaines dans le cas d'in vivo injections de traceurs (voir un examen détaillé sur l'utilisation des amines de dextran et d'autres traceurs en injections in vivo par Lanciego et Wouterlood, 2011 22, mais aussi Rodriguez-Contreras et al., 2008 23), de sorte que les injections non retenus peuvent être détectés plus tôt au cours de la procédure d'injection ou au plus tard, le jour suivant, de sorte que que les paramètres d'injection peuvent être adaptées en conséquence. La période de survie à court d'explants du cerveau signifie également qu'il n'y a généralement une petite différence entre le <em> efficace (région, où le colorant a été repris par les neurones dans antérograde ou terminaisons axonales en injections rétrogrades) et l'apparente (zone où le colorant renversé, sans être pris) site d'injection, bien que cette différence ne peut jamais être exclu complètement et ne peuvent être quantifiés / contrôlée pour la post-hoc, qui, dans certains cas, peut être tout à fait impossible (voir Albrecht et al., 2014 pour une discussion plus détaillée 24).
Il convient de souligner, que les connexions de pratiquement toutes les longueurs peuvent être étudiés par cette méthode, pour autant que l'expérimentateur est capable de préserver à la fois la zone injectée et la cible ou la source zone de projections axonales dans une seule pièce de tissu cérébral. La visualisation de ces connexions peut être réalisée soit par la reconstruction de piles confocale d'image acquises après la coupe et le montage du cerveau (comme décrit ici) ou l'ensemble du cerveau / techniques d'imagerie de la dalle du cerveau après un tissu clair exécutionprotocoles ING (voir la section 5 de ce protocole pour un exemple).
Le principal avantage de notre technique de guidage laser dans électroporation vitro est l'augmentation significative de la précision du ciblage lors des injections de traceurs. La méthode originale de l'électroporation in vitro repose sur un contrôle visuel juste en ciblant certains marqueurs topographiques ou de les utiliser comme guides approximatives pour la zone d'injection. Le même est vrai pour la propagation de colorant dans la zone cible: on peut observer le colorant propagation, mais il est pas facile de contrôler la propagation de colorant de manière plus fine. Avec la modification de laser de cette méthode, un chercheur peut facilement trouver des noyaux et des cellules d'intérêt et d'observer la propagation de colorant dans la population noyau / cellulaire d'intérêt grâce à l'interaction de la fluorescence indigènes génétiquement entraînée et la fluorescence du colorant. Ainsi, un chercheur gains plus de contrôle sur sa / son expérimentation de traçage en minimisant les faux positifs dans antéro ou rétrogradeplombages, parce cellules / terminaisons axonales en dehors du noyau / zone d'intérêt ont été remplis lors de l'injection, ainsi. Évidemment, cela ne signifie pas un contrôle absolu sur le site de l'injection efficace, qui, comme mentionné plus haut, peuvent différer à partir du site apparente. Une mise en garde de cette technique est de toute évidence la disponibilité d'organismes génétiquement modifiés. Les souris sont un organisme modèle génétique largement utilisé dans les études sur les mammifères, ce qui est également vrai pour le domaine auditif, mais certains modèles de mammifères pourraient être considérés comme mieux, parce qu'ils ressemblent à l'audiogramme humaine plus précisément. Ainsi, d'autres techniques peuvent être utilisées pour étiqueter populations neuronales chez les animaux de type sauvage d'autres espèces mieux adaptées pour un certain type de champ de recherche (par exemple les gerbilles ou chinchillas dans les études sur le système auditif 25-28): cela pourrait inclure des injections virales profitant de certains promoteurs de ciblage seuls certains compartiments du cerveau et exprimant Déessmarqueurs ent dans un sous-ensemble des cellules du cerveau. Naturellement, une attention particulière doit être prise pour assurer la validité des constructions génétiques exprimées dans le droit sous-population de neurones, peu importe si de telles constructions sont exprimés de manière virale chez les animaux de type sauvage ou localement dans knock-in des lignées de souris.
Comme indiqué précédemment, l'avantage de mutants de souris exprimant des protéines fluorescentes dans certaines sous-populations de neurones permet également pour la caractérisation fonctionnelle des circuits du cerveau (dans notre cas, nous avons pu caractériser projections inhibitrices d'un noyau du tronc cérébral à l'autre 24 par la visualisation pure les résultats de nos expériences de traçage). Encore une fois, la validité des constructions génétiques exprimées doit être confirmée avant toute interprétation des résultats des expériences de traçage peut avoir lieu.
Une autre force générale de l'électroporation in vitro est sa compatibilité avec OTHméthodes anatomiques er, tels que (immuno) histochimie et le cerveau compensation. Comme démontré précédemment 24, il ne soit pas affectée par l'application de techniques de coloration additionnels tels que Nissl, ou un procédé de compensation cerveau appelée ClearT2 12 20,24. L'inconvénient majeur que l'on doit garder à l'esprit est que la profondeur de Nissl et les taches d'anticorps pénétration diminue avec l'épaisseur croissante de tissu, donc il faut peser les options de axonale la préservation de processus dans des tranches plus épaisses par rapport à la force du signal de supplémentaire (immuno) histochimique coloration dans des expériences où les deux méthodes d'étiquetage anatomiques sont nécessaires. Bien sûr, un autre facteur à considérer est la séparation de la bande passante d'excitation / émission des marqueurs fluorescents différents, puisque le nombre minimal d'étiquettes commence à trois marqueurs à ce point (expression de la protéine fluorescente indigène, traceur et Nissl / marquage de l'anticorps).
Il est évident que notre méthode décrite peut être étendue àinjections de tout type de marqueurs fluorescents (y compris les perles quantiques) dans des explants de cerveau ou même des tranches du cerveau de souris transgéniques. Etant donné que la précision de l'injection dépend à la fois, une détection claire cible (l'observation de fluorescence étiquetée noyaux et les cellules) et un contrôle plus fin sur le déversement du colorant fluorescent, un seul de ces deux facteurs devraient suffire pour augmenter la précision de l'injection, même lorsque le autre est absent. Cela signifie que différents marqueurs non fluorescents (tels que des vecteurs viraux ou d'autres vecteurs ADN / ARN) peuvent être injectées avec une plus grande précision dans les noyaux du cerveau d'intérêt, dans la mesure où les noyaux cibles sont clairement visibles à l'expérimentateur. Cette dernière application est particulièrement intéressante, car électroporation ne permet pour l'absorption efficace des matières de l'ADN, ainsi 29-30, faisant de notre méthode quasi idéal pour ce type d'injections. Le seul inconvénient qui doit être considéré est celui des constructions d'ADN prennent le temps d'exprimer et le problème de ti en directla préservation ssu se pose. Ceci peut être surmonté en établissant organotypiques cultures de tranches de cerveau de 31 à 32 sur la base de tranches de cerveau injectés (ou blocs de tissu de cerveau ré-tranches), qui permettent une conservation des tissus vivants de l'ordre de quelques semaines.
Et bien sûr, d'autres mutants de souris transgéniques peuvent être utilisées pour étudier la connectivité d'autres types de neurones comme les neurones cholinergiques (par exemple dans le chat-GFP souris 33), ce qui rend cette méthode un outil polyvalent pour étudier la connectivité et la fonctionnalité du cerveau (micro) circuits.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Nous avons rien à révéler.
Acknowledgments
Soutenu par NIH / NIDCD R01 DC expériences 011582. d'imagerie ont été effectuées à l'Université du Colorado Anschutz médicale Campus avancée microscopie optique minimale prise en charge en partie par NIH / NCRR Colorado CTSI Grant Nombre UL1 RR025780 et les troubles Rocky Mountain Neurlogical Core Center Grant NIH P30NS048154. Dr Sascha du Lac de l'Institut Salk nous a fourni les souris GlyT2-GFP.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | All chemicals are from Sigma-Aldrich, unless noted otherwise. |
| Potassium chloride | P9333 | ||
| Potassium phosphate monobasic | P5655 | ||
| Sodium phosphate di-basic | S907 | ||
| Magnesium chloride | M2670 | ||
| Calcium chloride | C5080 | ||
| Glucose | G7528 | ||
| Sodium bicarbonate | S6297 | ||
| Ascorbic acid | A4544 | ||
| Myo-inositol | I5125 | ||
| Sodium pyruvate | P2256 | ||
| Bovine serum albumine | A2153 | optional, for additional (immuno)histochemistry | |
| Triton-X-100 | X100 | optional, for additional (immuno)histochemistry | |
| Poly(ethylene glycol), 8000 MW | P2139 | optional, for brain clearing | |
| Formamide | Fisher Scientific | F84 | optional, for brain clearing |
| Choleratoxin subunit-b | Molecular Probes | C-34776 (Alexa 555) | |
| Dextrane tetramethyl-rhodamine | Molecular Probes | D-7162 (Alexa 555) | |
| Fluorescent Nissl | Invitrogen | N-21479 (blue) | optional |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | SF93 | |
| Agarose | Invitrogen | 16520 | |
| Fluoromount-G | Southern Biotech | 0100-01 | |
| Pentobarbi-tal | Vortech Pharmaceuticals | Fatal-Plus | |
| Borosilicate glass filaments | Harvard Apparatus | G150F-10 | |
| Pipette puller | Zeitz Instruments, Germany | DMZ Universal Puller | |
| Perfusion setup | Custom-made | ||
| Laser pointer | laserpointerpro.com, Hong Kong | HK-88007294 (405 nm) | |
| Filter/safety goggles | Dragon Lasers, China | LSG09 (band-pass 450-700 nm) | |
| Bionocular microscope | Wild Heerbrugg, Switzerland | Wild M3 | Equipped with high-intensity illuminator (MI-150; Dolan-Jenner Inc.) |
| Picospritzer | Parker Instruments | Picospritzer III | |
| PC with installed MC Stimulus software | Multi Channel Sys-tems, Germany (software) | ||
| 2-channel stimulator | Multi Channel Sys-tems, Germany | STG-1002 | |
| Stimulation isolation unit | A.M.P.I., Israel | Iso-Flex | |
| Micromanipulator | Narishige, Japan | YOU-1 | |
| Vibratome | Leica, Germany | VT1000S |
References
- Waller, A. Experiments on the sections of glossopharyngeal and hypoglossal nerves of the frog and observations of the alterations produced thereby in the structure of their primitive fibers. Philos. Trans. R. Soc. Lond. 140, 423-429 (1850).
- Fink, R. P., Heimer, L. Two methods for selective silver impregnation of degenerating axons and their synaptic endings in the central nervous system. Brain Res. 4, 369-374 (1967).
- Nauta, W. J. Selective silver impregnation of degenerating axons in the central nervous system. Stain Technol. 27, 175-179 (1952).
- Ramón y Cajal, S. Histologie du système nerveux de l'Homme et des vertébrés. , Maloine, Paris. (1911).
- Kristensson, K., Olsson, Y. Uptake and retrograde transport of peroxidase in hypoglossal neurons. Electron microscopical localization in the neuronal perikaryon. Acta Neuropathol. 19, 1-9 (1971).
- Kristensson, K., Olsson, Y. Retrograde axonal transport of protein. Brain Res. 29, 363-365 (1971).
- Burger, R. M., Cramer, K. S., Pfeiffer, J. D., Rubel, E. W. Avian superior olivary nucleus provides divergent inhibitory input to parallel auditory pathways. J. Comp. Neurol. 481, 6-18 (2005).
- Ford, M. C., Grothe, B., Klug, A. Fenestration of the calyx of Held occurs sequentially along the tonotopic axis, is influenced by afferent activity, and facilitates glutamate clearance. J. Comp. Neurol. 514, 92-106 (2009).
- Glover, J. C., Petursdottir, G., Jansen, J. K. S. Fluorescent dextran amines used as axonal tracers in the nervous system of chicken embryo. J. Neurosci. Methods. 18, 243-254 (1986).
- Trojanowski, J. Q., Gonatas, J. O., Gonatas, N. K. Conjugates of horseradish peroxidase (HRP) with cholera toxin and wheat germ agglutinin are superior to free HRP as orthograde transported markers. Brain Res. 223, 381-385 (1981).
- Trojanowski, J. Q., Gonatas, J. O., Steiber, A., Gonatas, N. K. Horseradish peroxsidase (HRP) conjugates of cholera toxin and lectins are more sensitive retrograde transported markers than free HRP. Brain Res. 231, 33-50 (1982).
- Conte, W. L., Kamishina, H., Corvin, J. V., Reep, R. L. Topography in the projections of lateral posterior thalamus with cingulate and medial agranular cortex in relation to circuitry for directed attention and neglect. Brain Res. 1240, 87-95 (2008).
- Conte, W. L., Kamishina, H., Reep, R. L. Multiple neuroanatomical tract-tracing using fluorescent Alexa Fluor conjugates of cholera toxin subunit B in rats. Nat. Protoc. 4, 1157-1166 (2009).
- Haas, K., Jensen, K., Sin, W. C., Foa, L., Cline, H. T. Targeted electroporation in Xenopus tadpoles in vivo- from single cells to the entire brain. Differentiation. 70, 148-154 (2002).
- Zeilhofer, H. U., et al. Glycinergic neurons expressing enhanced green fluorescent protein in bacterial artificial chromosome transgenic mice. J. Comp. Neurol. 482, 123-141 (2005).
- Poyatos, I., Ponce, J., Aragön, C., Giménez, C., Zafra, F. The glycine transporter GLYT2 is a reliable marker for glycine-immunoreactive neurons. Brain. Res. Mol. Brain Res. 49, 63-67 (1997).
- Gong, S., et al. A gene expression atlas of the central nervous system based on bacterial artificial chromosomes. Nature. 425, 917-925 (2003).
- Heintz, N. Bac to the future: the use of BAC transgenic mice for neuroscience research. Nat. Rev. Neurosci. 2, 861-870 (2001).
- Franklin, K. B. J., Paxinos, G. The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , 3rd ed, Elsevier/Academic Press. New York. (2008).
- Kuwajima, T., Sitko, A. A., Bhansali, P., Jurgens, C., Guido, W., Mason, C. ClearT: a detergent- and solvent-free clearing method for neuronal and non-neuronal tissue. Development. 140, 1364-1368 (2013).
- Wouterlood, F. G., Jorritsma-Byham, B. The anterograde neuroanatomical tracer biotinylated dextran amine: comparison with the tracer PHA-L in preparations for electron microscopy. J. Neurosci. Methods. 48, 75-87 (1993).
- Lanciego, J. L., Wouterlood, F. G. A half century of experimental neuroanatomical tracing. J. Chem. Neuroanat. 42, 157-183 (2011).
- Rodriguez-Contreras, A., Silvio, J., van Hoeve, S., Habets, L. P., Locher, H., Borst, J. G. G. Dynamic development of the calyx of Held synapse. PNAS. 105 (14), 5603-5608 (2008).
- Albrecht, O., Dondzillo, A., Mayer, F., Thompson, J. A., Klug, A. Inhibitory projections from the ventral nucleus of the trapezoid body to the medial nucleus of the trapezoid body in the mouse. Front. Neural Circuits. 8, 83 (2014).
- Benson, D. A., Teas, D. C. Single unit of binaural interaction in the auditory cortex of the chinchilla. Brain Res. 103, 313-338 (1976).
- Koka, K., Jones, H. G., Thornton, J. L., Lupo, J. E., Tollin, D. J. Sound pressure transformations by the head and pinnae of the adult Chinchilla (Chinchilla lanigera). Hear Res. 272 (1-2), 135-147 (2011).
- Ryan, A. Hearing sensitivity of the mongolian gerbil, Meriones unguiculatus. J. Acoust. Soc. Am. 59 (5), 1222-1226 (1976).
- Zwicker, E., Fastl, H. Psychoacoustics Facts and Models. , Springer. (1990).
- Chu, G., Hayakawa, H., Berg, P. Electroporation for the efficient transfection of mammalian cells with DNA. Nucleic Acids Res. 15 (3), 1311-1326 (1987).
- Klenchin, V. A., Sukharev, S. I., Serov, S. M., Chernomordik, L. V., Chizmadzhev, Y. A. Electrically induced DNA uptake by cells is a fast process involving DNA electrophoresis. Biophys J. 60 (4), 804-811 (1991).
- Elias, L., Kriegstein, A. Organotypic Slice Culture of E18 Rat Brains. J. Vis. Exp. (6), e235 (2007).
- Gähwiler, B. H. Organotypic monolayer cultures of nervous tissue. J. Neurosci. Methods. 4 (4), 329-342 (1981).
- Tallini, Y. N., et al. BAC transgenic mice express enhanced green fluorescent protein in central and peripheral cholinergic neurons. Physiol Genomics. 27 (3), 391-397 (2006).
