Summary
Wir beschreiben eine Technik, um Neuronen und ihre Prozesse über anterograden oder retro Tracer Injektionen in Hirnkernen unter Verwendung eines in vitro-Präparat zu bezeichnen. Wir modifiziert eine vorhandene Methode der i n vitro Tracer Elektroporation durch die Nutzung von fluoreszenzmarkierte Mausmutanten und grundlegende optische Geräte, um die Kennzeichnung Genauigkeit zu erhöhen.
Abstract
Präsentieren wir eine Technik, die eine in vitro-Tracer Injektionsprotokoll, das eine Reihe elektrischer und Druckimpulse verwendet, um die Farbstoffaufnahme durch Elektroporation in Gehirn Explantate mit gezielten Laserbeleuchtung und passende Filterbrille während des Verfahrens zu erhöhen verbindet. Die beschriebene Technik der in vitro-Elektroporation von selbst ergibt eine relativ gute Sichtkontrolle für Targeting bestimmter Bereiche des Gehirns. Durch die Kombination mit Laseranregung fluoreszierender genetischen Markern und deren Auslesen durch Band-Passing-Filterbrille, die abholen können die Emissionen der genetisch markierten Zellen / Kerne und der Fluoreszenz Tracing-Farbstoff, ein Forscher kann im Wesentlichen die Genauigkeit der Einspritzungen zu erhöhen von der Suche nach den interessierenden Bereich und Controlling für das Farbstoff-Ausbreitung / Aufnahme im Injektionsbereich sehr viel effizienter. Außerdem ermöglicht das Laserbeleuchtungstechnik, um die Funktionalität eines gegebenen neurocircuit Prov studierenIding Informationen über die Art von Neuronen auf einen bestimmten Bereich in den Fällen, wo der GFP-Expression in den Typ des Senders von einer Subpopulation von Neuronen verbunden vorsteht.
Introduction
Um eine bestimmte neuronale (Mikro-) Schaltung zu definieren, muß man durch Auffinden der verschiedenen Teilnehmer der Schaltung und ihre Verbindungsstruktur zu beginnen. Seit Wallers Publikation über neurofiber Verfolgung durch Läsion 1 eine Vielzahl von neuroanatomischen Tracing-Techniken hergestellt wurde. Einige dieser Techniken können in festen Gewebe post mortem 2-4 angewendet werden, andere stützen sich auf den aktiven Transport des Farbstoffes in lebenden Neuronen, wie 1971 5-6 entdeckt. Letztere kann weiter in zwei Gruppen Unterscheiden zwischen Methoden unter Ausnutzung der aktiven retrograden unterteilt werden (von der Injektionsstelle zu der Quelle eines gegebenen Vorsprungs, dh. Die Zellkörper von Neuronen, die vorstehen, sind an der Fläche) und aktive anterograde (von der eingespritzten Bereich in den Ziel einer gegebenen Projektion, d. axonalen Vorsprüngen und den axonalen Anschlüssen des markierten Neuronen) transport. Auch in einigen Fällen tracer Material in lebende Tiere, die dann überleben die Injektion von mehreren Tagen oder Wochen (in vivo Tracer Injektionen), während in anderen Fällen explantierten Gehirn injiziert werden und Inkubation für mehrere Stunden nach der Injektion in der künstlichen Cerebrospinalflüssigkeit injiziert (in vitro Tracer Injektionen) .
In diesem Protokoll modifizierten wir ein in vitro Elektroporationstechnik 7-8 bestehende neuronale Zellkörper und Prozesse in anterograden und retrograden Verfolgungsexperimente mit Choleratoxin-Untereinheit B und Tetramethylrhodamin Dextran als Verfolgungssubstanzen zu markieren. Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, Neurowissenschaftler mit einem effizienten Werkzeug, um neuronale Konnektivität Muster zwischen verschiedenen Hirnkerne verfolgen zu schaffen, und gleichzeitig die Vorteile der verfügbaren transgenen Mauslinien und Grund optische Geräte, um die Zielgenauigkeit beim Tracer Injektionen erhöhen. Obwohl das Verfahren der anterograden und retrograden Verfolgung mitCholeratoxin und Dextran Amin und ihre jeweiligen fluoreszenzmarkierten Konjugaten ist nicht neu 9-13 (ebenso wie die Methode der Elektroporation, z. Haas et al. 14), die Kombination von Tracer-Injektionen mit Elektroporation in einem in vitro-Präparat mit Blöcken von Hirngewebe ist eine neuere Entwicklung 7. Sein Hauptvorteil, neuronale Verfolgungstechniken unter Verwendung der gleichen Art von Tracer Farbstoffe in lebenden Tieren ist die erhöhte Markierungsintensität, wegen der höheren Effizienz, mit der das elektroporierte Farbstoff wird durch Neuronen entnommen. Ein zusätzlicher Vorteil ist die verkürzte Inkubationszeit (für die Farbstofftransport erforderlich) und seine erhöhte Zielgenauigkeit während der Tracerinjektion, weil der Experimentator visuelle Kontrolle über den Zielbereich der Injektion. Letzteres bedeutet, dass auch keine teuren stereo Ausrüstung erforderlich, um den Kern oder Gehirnbereich von Interesse zu finden.
Um additional erhöht Zielgenauigkeit, nutzten wir eine transgene Mauslinie, die GFP in seiner glycinergen Subpopulation von Neuronen 15 und optischen Grundausrüstung, bestehend aus einem Hand-Laser-Pointer von 405 nm Wellenlänge und passenden Bandpassfilterung Brille (450 drückt - 700 nm). Somit eine erhebliche weitere Steigerung erzielten wir die Zielgenauigkeit durch die Identifizierung der Injektionsbereich durch seine Fluoreszenzsignals und durch Vorsehen einer feineren Weg für den Farbstoff Streuung in der Injektionsbereich durch Beobachtung der Wechselwirkung zwischen der indigenen GFP-Signals und der Kopierregel Fluoreszenz. Unser Verfahren ermöglicht es auch, die Funktion eines Schaltkreises zusammen mit der Konnektivität durch Identifizieren GFP-positive inhibitorische Neuronen (oder in anderen exzitatorischen Mauslinien), die mit dem Tracer gefüllt waren aufzudecken.
Zusammenfassend haben wir weiter verbessert ein leistungsfähiges Werkzeug, um die neuro Connectome des Wirbeltiergehirns zu studieren und zu beurteilen ter verschiedene neuroanatomische Merkmale eines gegebenen neurocircuit. Durch Verwendung von transgenen Mäusen zusammen mit preiswerten und überall erhältlich optische Geräte konnten wir die Zielgenauigkeit der Injektionen deutlich erhöhen. Darüber hinaus konnten wir die transgenen Mäuse, die Art der zurück Verbindungen, die Aufdeckung der Funktionalität einer inhibitorischen Mikroschaltung im auditorischen Hirnstamm geholfen zu identifizieren.
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Protocol
1. Optische Genotypisierung
1. Optische Genotypisierung von Maus Pups
- Check für die Expression des jeweiligen Fluoreszenzmarker mit einem Laserzeiger des geeigneten Anregungswellenlänge (405 nm in den hier beschriebenen Experimenten) und entsprechenden Filterbrille Blockierung der Anregungswellenlänge aber Passieren der Emissionswellenlänge (450 - 700 nm in den hier beschriebenen Experimente) . Richten Sie den Laserpointer auf der Rückseite des Kopfes oder das Rückenmark der Maus pup (siehe Abbildung 1). Vermeiden Aufstrahlen des Lasers in den Augen und langwierige Exposition der Haut mit Laserlicht.
2. Optische Genotypisierung von älteren Tieren
- Die Maus (im Alter von p14 an p138 in den hier beschriebenen Experimenten) mit einer Überdosis Pentobarbital tief betäuben durch eine intraperitoneale Injektion (120 mg / kg Körpergewicht). Überprüfen Sie die ordnungsgemäße Betäubung durch Überprüfung des Tieres Reflexe (kurz Prise der Spitze the Ohr oder einem der Hinterbeine auf die Rückzugsreflex des Ohres oder Bein) hervorzurufen.
- Hinweis: Trotz der Verwendung einer Überdosis Pentobarbital (120 mg / kg Körpergewicht), verweisen wir auf das Injektionsverfahren als "tiefe Narkose" statt Euthanasie, weil das Tier ist im Idealfall noch am Leben (dh seinen Herz noch schlägt), wenn die Chirurgie und die Durchblutung beginnen. Dies gewährleistet eine effizientere Perfusion der inneren Organe, einschließlich des Gehirns.
- Sobald das Tier keine Reflexe zeigen, aufmerksam, indem sie ein Schnitt in der Haut für den Hinterkopf und Schneiden, um den Mittelteil des Schädels entfernen Sie die Haut über den Schädel (2A). Setzen Sie das aufgedeckt Schädel mit Laserlicht und beobachten die Fluoreszenz durch die Filterbrille, wie oben beschrieben. Wenn eine positive GFP-Signal beobachtet wird, fahren Sie mit Schritt 2 zweite, wenn nicht, zu opfern das Tier durch Enthauptung (/ Gewährleistung Form von Euthanasie nach unsererIACUC Vorschriften).
Anmerkung: In noch älteren Mäusen (> 1 Monat) der Fluoreszenz kann durch die Augen der Tiere beobachtet werden.
2. transkardialer Perfusion und Neuro Vorbereitung
- Perfundieren transkardial mit eiskalter phosphatgepufferter Salzlösung (PBS; NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM, KH 2 PO 4 1,76 mM, Na 2 HPO 4: 10 mm) unter Verwendung einer 30 G-Spritzennadel, um das Blut weitgehend entfernen das Tier.
- Zunächst öffnen Sie vorsichtig den Brustkorb mit einer scharfen Schere, und drücken Sie dann die Nadel in die linke Herzkammer. Pumpen die PBS in das Herz und die Aorta und unmittelbar nach diesem Schritt zu öffnen in den rechten Vorhof des Herzens mit der Schere, um die Blut zuzulassen, um den Körper zu verlassen. Hinweis: Perfusion dauert 5 - 10 min in Abhängigkeit von der Größe des Tieres.
- Nach dem Ausbluten durch Perfusion, enthaupten, das Tier, sichern Sie den Kopf mit Stift needles (oder 30 G Spritzennadeln) durch Durchstechen sie durch die Augenhöhlen in einer Zubereitung Schale und entfernen Sie das Gehirn aus dem Schädel.
- Verwenden Sie zuerst eine scharfe Schere zu schneiden Sie die Haut, die über der Schädel: einen kleinen Schnitt in der Rückseite des Kopfes, dann entlang der Mittellinie auf der Rückenseite des Kopfes geschnitten, an den Seiten nur kaudal der Augen des Tieres geschnitten und schließlich Kürzung der kaudal vollständig die Klappen der Haut zu entfernen, an der Rückseite des Kopfes.
- Weiter, wiederholen Sie den gleichen Schnittmuster für den Schädel selbst, stellen Sie sicher, beide Kochleas in dem Prozess zu entfernen, da dies wesentlich die Entfernung der Hirnstamm am Ende zu vereinfachen. Nach diesem Vorgang ist die Schwanzgehirnhälfte sollte vollständig ausgesetzt liegen.
- Im nächsten Schritt, mit einem scharfen Rasierklinge oder einem Skalpell durch den gesamten Vorderhirn in einem Winkel von etwa 45 ° und etwa 2 mm rostral aus dem Cerebellum ausgeschnitten. Scoop aus der abgetrennten vorderen Hälfte des Gehirns mit abent Spachtel.
- Verwenden Sie den Spachtel, um den kaudalen Hirnhälfte an seinem rostralen Ende zu erheben und anschließend durch den Hirnnerven, die noch auf den Hirnstamm auf ihrer Bauchseite verbunden sind, geschnitten. Als Ergebnis sollte der kaudalen Hirnhälfte einschließlich des Hirnstamms frei aus dem Rest der präparierten Tier den Kopf fallen.
- Klappen Sie den entfernt kaudale Hälfte des Gehirns, seine Bauchseite freizulegen und entlang der Frontalebene nur rostral geschnitten (für die anterograde Injektionen) oder einfach Schwanz (für die retrograde Injektionen) der ventral gelegen "Birnen", die die trapezförmige Körper (siehe Schritt 2.3).
- Verwenden Sie immer eine scharfe Rasierklinge oder einem Skalpell für den Schneidvorgang, um den Zelltod durch übermäßige mechanische Beanspruchung des Gewebes zu minimieren. Als Endergebnis sollte ein Gehirn Explantat spannt etwa 1 cm in der Länge und mit der vollständigen oberen Olivenkomplex entlang anderen Hirnregionen erhalten worden sein.
Hinweis: Dieses Protokoll zeigt die Vorgehensweise für eine Tracerinjektion in die Trapezkörper im auditorischen Hirnstamm befindet. Passen Sie die Position und Ausrichtung der Schnittebenen und Injektionsstellen nach Bedarf. Wenn die fluoreszierende Gehirnregionen von Interesse liegen nahe genug an der Hirnoberfläche, so dass sie identifiziert und ohne Schneiden des Gehirns injiziert werden kann (siehe 2B), kann der koronalen Schneideschritt weggelassen werden.
- Identifizieren Sie die trapezförmigen Körper als zwei ventralen prominente "Birnen", die den ventralen Kern der Trapezkörper (VNTB).
Hinweis: Weitere anatomischen Referenz über die ungefähre stereotaktische Position dieser Schnittebenen finden Franklin & Paxinos, 2008 Steuerung 78 des Atlas, Bregma ~ -5,7 mm zeigt die mediale Kern der Trapezkörper (= MNTB) als "Tz markiert ". Panel 69 zeigt die ventralen Kern des Trapezes body (VNTB) als "MVPO" (medioventralen periolivary Kern) 19 bezeichnet.
3. Anterograde / Retrograde Tracing
Hinweis: Führen Sie alle folgenden Schritte bei RT (25 ° C).
- Nach dem Schneiden, legen den Hirnstamm Explantat in einer Zubereitung Schale mit oxygeniertem (95% O 2, 5% CO 2) Präparieren Lösung (NaCl: 125 mM, KCl: 2,5 mM, MgCl 2 1 mM, CaCl 2 0,1 mM, Glucose : 25 mM NaH 2 PO 4 1,25 mM, NaHCO 3: 25 mM Ascorbinsäure: 0,4 mM, myo-Inosit 3 mM, Brenztraubensäure: 2 mm) und schützt sie mit 30 g Spritzennadeln. Sicherzustellen, dass der Bereich der Injektion nach oben zeigt.
- Pull-Spritzen Pipetten aus Borosilikatglas und füllen sie mit einer der folgenden drei Lösungen: a) einer 1,0 mg / ml Lösung von Choleratoxin-Untereinheit-b konjugierten auf ein Fluorophor Alexa 555 in PBS 12-13 (vor allem für die retrograden Transport verwendet), b ) eine 1% -dilution in 0,9% Salzlösung von Dextran Tetramethylrhodamin 555 (3000 MW, die hauptsächlich für den retrograden Transport verwendet wird) oder c) ein 1% Herkunft des Verdünnungs in 0,9% Salzlösung von 10.000 MW Dextran-TRITC 555 (hauptsächlich für anterograden Transport verwendet wird).
- Stellen Sie sicher, dass die Injektionspipette Widerstände Bereich von 2,5 bis 3,5 MOhm und dass sie in 3 hergestellt - 4 Ziehen Zyklen. Für die hier beschriebenen Experimente erreichen dies durch Auswahl einer vorprogrammierten Algorithmus Ziehen an der Pipettenzieher.
- Beleuchten das Gehirn Explantat mit einem statisch montiert Laserzeiger der geeigneten Wellenlänge (Element No. 2 in 3A; 405 nm Wellenlänge in die hier beschriebenen Experimente). Verwenden Sie den Laserpointer als Leitfaden für die Injektionen, und das Ziel des Laserstrahls an der fluoreszierend markierten Hirnkern oder Zellen von Interesse, die eingespritzt wird.
- Suchen und durch ein Binokular beachten Sie die beleuchtete Zielbereich beim Tragen die kompatiblen Filterbrille (450-700 nm Bandpassfilter in den hier beschriebenen Experimenten). Legen Sie die Injektionselektrode über den Mikromanipulator in das Gebiet von Interesse.
- Spritzen Sie die Tracersubstanz. Die Einspritzungen bestehen aus 2 bis 10 Druckimpulse bei 15 psi für 50 msec, unter Verwendung einer Einspritzvorrichtung, die senkrecht in die Region von Interesse (ROI) gerichtet im Gehirn an. Verwalten jeder Druckimpuls in Intervallen von 10 bis 15 sec, damit der Farbstoff verteilt.
- Im Fall der Tetramethylrhodaminisothiocyanat (TRITC) Injektionen stimulieren zusätzlich elektrisch mit der Farbstoffaufnahme durch Elektroporation mit der Elektrode in dem Bereich des Gehirns von Interesse (MNTB und VNTB in den hier beschriebenen Experimenten) platziert zu verbessern.
- 8 verwenden TTL-Impulse von 8 Volt für 50 msec 50 msec Impulsintervallen durch einen Stimulator mit einer Stimulationsisolationseinheit (Artikel No. 7 und 9 in 3B) angetrieben wird und mit 55 V verstärkt. Verwenden von 10 bis 20 Wiederholungen dieses Protokolls VerwalNamen über mehrere Minuten 7,8. Stellen Sie sicher, um die Elektrode richtig geschliffen - das Erdungskabel sollte auf die Badlösung angeschlossen werden!
- Überprüfen Sie für den Erfolg der Injektion. Da ein fluoreszierender Tracer mit einer längeren Emissionswellenlänge wird auch Emittieren eines Fluoreszenzsignals auf die Laseranregung mit kürzeren Wellenlängen, visuell zu überprüfen, für die Farbstoffaufnahme / der eingespritzten Zielfläche verteilt, während Beleuchten der Fläche mit dem Laser und die Beobachtung durch die Filterbrille.
4. Inkubation
- Nach der Injektion inkubieren brainstems in oxygeniertem künstlicher Zerebrospinalflüssigkeit (ACSF; NaCl: 125 mM, KCl: 2,5 mM, MgCl 2 1 mM, CaCl 2 2 mM, Glucose: 25 mM NaH 2 PO 4 1,25 mM, NaHCO 3: 25 mM Ascorbinsäure: 0,4 mM, myo-Inosit 3 mM, Brenztraubensäure: 2 mm, mit 95% O 2 eingeblasen - 5% CO 2) bei Raumtemperatur (RT, 25 ° C) für 1 - 4 Stunden, währendder Farbstoff transportiert wird. Blasen die Lösung während der gesamten Inkubationszeit.
- Anschließend übertragen die brainstems in 4% Paraformaldehyd (PFA), gelöst in PBS (ca. 100 ml;. PH 7 für den PFA / PBS mix) und inkubieren bei 4 ° C, um nach der Fixierung über Nacht ermöglicht (O / N).
5. Tissue Slicing und Montage
- Am nächsten Tag, waschen Sie den Hirnstamm dreimal in PBS (5 min pro Waschschritt), bedecken Sie es in 4% Agar und dann in 50 geschnitten - 80 & mgr; m dicke Scheiben auf einem Vibratom. Berg Scheiben mit Hilfe eines Montagemedium auf einen Objektträger und Deckglas.
- Wahlweise kennzeichnen die Abschnitte mit fluoreszierenden Nissl für 25 Minuten (zum Beispiel blau Nissl bei einer 1: 100 Verdünnung in AB-Medien).
- Um AB Medien vorzubereiten, mischen Sie 250 ml von 0,2 M Phosphatpuffer (PB; 51 mM KH 2 PO 4, 150 mM Na 2 HPO 4), 15 ml 5 M NaCl, 15 ml 10% Triton-X, 220 ml ddH 2 O und 5 g Rinderserumalbumin.
- Precede und erfolgreich die Nissl Kennzeichnung Schritt 3 Waschschritten in PBS (jeweils 10 Minuten).
Anmerkung: Für den Fall, dickeren Abschnitten montiert werden müssen und analysiert (hier solche Scheiben beschriebenen Experimente wurden 100 bis 500 Mikrometer dick, um Axon-Verbindungen über größere Distanzen zu erhalten), kann die Technik mit Gewebe Clearing kombiniert werden. Wir fanden das ClearT2 12 erfolgreiche 20 zu sein. Wenn ein Gewebe Verrechnungsschritt enthalten ist, führen sie vor der Montage der Teile.
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Representative Results
Die 1 und 2 zeigen, wie der Laserpointer und Laserschutzbrillen verwendet werden, um GFP-positiven Tieren schnell und kostengünstig Genotyp aus einem Wurf werden. In Fällen von jungen Maus Jungtieren kann die Technik verwendet werden, um nicht-invasiv zu identifizieren GFP Label in das Tier Gehirn durch den Schädel und die darüber liegende Haut (1A - D) werden. Emittierte Fluoreszenz durch die Haut und dem Schädel des Maus Welpen mindestens bis zur postnatalen Tag 3 (1C) zu erkennen. Die Vorgehensweise ist in Abbildung 1 für unsere grün-fluoreszierende Protein (GFP) markiert dargestellt Mauslinie, die GFP in seiner glycinergen Subpopulation von Neuronen (GlyT2-GFP). Bei älteren Tieren mit dickeren Schädel und pigmentierter Haut, die GFP-Label zeigt weniger gut durch Haut und Knochen, und damit die Haut auf dem Kopf und / oder Hals auf, bevor der optische Genotypisierung (2A) entfernt werden.
Nach Perfusion derTier das Gehirn entnommen und wieder beleuchtet, um die fluoreszenzmarkierten Keime von Interesse zu finden. Die hellen Strukturen, die aufleuchten, nahe an der ventralen Oberfläche des Hirnstamms in 2B sind die beiden ventralen Kerne des Trapezkörpers, die wir als sowohl eine Führung und ein Ziel für unsere Tracer Injektionen verwendet. Die 4 und 5 sind repräsentative Ergebnisse eine anterograde Injektion in die Bauch Kern des Trapezes Körper (VNTB) mit Tetramethylrhodamin Dextran (TRITC;. Figur 4) und zwei Rückinjektionen in den medialen Nucleus des Trapezes Körper (MNTB) unter Choleratoxin-Untereinheit B (CTB, 5A und B) und TRITC (5C und D). Hell axonalen Kennzeichnung anzeigt (in diesem Fall inhibitorische) Vorsprünge von VNTB zu MNTB kann nach einer Injektion in anterograde VNTB (Figur 4) betrachtet werden. Die Figuren 5A und 5C zeigen eine Übersicht über die Websiteder Injektion (MNTB) mit dem Kern, der die retrograd markierten Zellen (VNTB) daneben. 5B und 5D zeigen vergrößerte Bilder von retrograd Somata glycinergen VNTB Zellen markiert in den gleichen Abschnitten wie in 5A und 5C dargestellt. Beachten Sie, wie die retrograde Tracing mit CTB resultiert in einem punktförmigen Muster 12-13 (5B), während VNTB Zellen retrograd mit TRITC markiert angezeigt werden ein sehr dichtes Golgi-ähnliche Kennzeichnung 21 (5D).
Abb. 1: Optische Genotypisierung von GlyT2-GFP-positive und GlyT2-GFP-negative Mäuse Die GFP-positive Mäuse wurden unter (A) normalen Lichtverhältnissen, (B) bei der Laserbeleuchtung mit einem 405 nm Laser-Pointer ohne Treib- fotografiert Filterbrille und (C)auf Laserbeleuchtung mit den Laser und UV-Schutzbrille. Eine starke GFP-Signal ist im Bereich oberhalb des Kleinhirns und des Hirnstamms sichtbar. (D) hingegen GlyT2-GFP-negative Welpen aus der gleichen Mauslinie und Alter (p2) keine Anzeichen von Fluoreszenz in den gleichen Bereichen zeigen ( Rückseite des Kopfes und des Rückenmarks). Die blaue Laserlicht effektiv durch die Brille gefiltert.
Abbildung 2: Optische Genotypisierung und eine vorbereitete Gehirn Explantation. Die (A) ein P4 GlyT2-GFP-Maus pup Schädel ist mit Laserbeleuchtung ausgesetzt und durch Bandpassfilterung Brille angesehen. Das fluoreszierende GFP kann durch den Schädel von der gleichen Pup in einer Zubereitung Schale auf Laserbeleuchtung beobachtet werden kann. (B) ein Gehirn Explantat, wie durch die Filterbrille gesehen. Glycinergen Axonen und Gehirn Kerne, wie das ventrale Kern des Trapezes Körper (VNTB) als ver sehen isty hellen Strukturen in der Nähe der Hirnoberfläche.
Abbildung 3: Überblick über ein in vitro-Druck Injektion und Elektroporation-Setup. (A) 1: Stereoskop 2: montiert Laserpointer (405 nm Wellenlänge), 3: heads mit Injektionspipette auf einem Mikromanipulator befestigt, 4: Herstellung Schale, die das Gehirn Explantat, 5: ein PC mit installiertem MC Stimulus Software, 6: Druck-Einspritzvorrichtung, in die Injektionspipette über Schläuche verbunden (B). 7: Reizisolationseinheit, 8: Hochintensitätslicht, 9: Stimulator. Der Stimulator ist mit der Elektrode in die Pipette über die Stimulationsisolationseinheit verbunden und wird durch den PC gesteuert.
Abbildung 4: Anterograde Tracing der inhibitorischen Verbindungen von VNTB zur medialen Nucleus des Trapezkörper (MNTB). Gezeigt wird eine maximale Projektion eines konfokalen Stapel in einer horizontalen Scheibe überspannt etwa 200 Mikrometer in der Tiefe auf eine freie Gehirn eines p14 GlyT2-GFP-Maus gemacht. Im Anschluss an eine Tetramethylrhodamin Dextran (TRITC) Injektion in den caudo-Mittelteil der VNTB, hell markierten axonalen Verbindungen (und in einigen Fällen ihre Klemmenenden) aus VNTB zu MNTB beobachtet werden kann. Maßstabsbalken: 200 & mgr; m.
Abb. 5: Die retrograde Tracer Injektionen in MNTB Reveal Gefüllt glycinergen Cells im VNTB sind Höchst Projektionen der konfokalen Stapel in koronalen Scheiben eines p88 genommen (A, B) und p80 (C, D (die sich über ca. 50 & mgr; m.) ) GlyT2-GFP-Maus. (A) einen Überblick über ein Choleratoxin-Untereinheit B (CTB) Injektion in den Mittelteil der MNTB. (B) glycinergen Zellen im VNTB mit CT gefülltenB (rot puncta innerhalb der Zelle somata) infolge des in 5A gezeigten Injektion. Einige der puncta erscheinen außerhalb der Zellen, was auf andere GFP-negative (nicht glycinergen) Zelltypen im VNTB gefüllt, ebenso sein kann (wegen der verletzten Fasern des Durchgangs im Bereich der Injektion, zum Beispiel) . (C) Eine weitere Übersicht über eine retrograde TRITC Injektion gezielt den MNTB. Note, wie eine Reihe von Zellen mit TRITC im MNTB nach der Elektroporation (im Gegensatz zu dem rein druck injiziert CTB in 5A) gefüllt ist. (D) retrograde Markierung glycinerger VNTB Zellen nach einem TRITC-Injektion in die MNTB (gleiche Injektions wie in 5C gezeigt). Die meisten Zellen weisen eine dichte gelbe oder orange Markierung aufgrund der Mischung von zwei Fluoreszenzsignale (die indigene GFP-Expression und die Füllung mit dem roten TRITC). Vergleichen Sie mit einem GFP-positive Zelle, die aus irgendeinem Grundnicht nehmen den Farbstoff (blauer Pfeil) und ein Tracer-markierten GFP-negative Zell tief rot und möglicherweise gefüllt ist, wegen einer axonalen Schädigung im Bereich der Injektion (roter Pfeil) erscheint. Beachten Sie die unterschiedliche Färbungsmuster von Zell Somata in retrograde Tracer Injektionen mit CTB (5B) und TRITC (5D). Maßstabsbalken: 5A und 5C: 200 & mgr; m, 5B und 5D: 20 & mgr; m.
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Discussion
Eine allgemeine Stärke in vitro Tracer Elektroporation, im Gegensatz zu in vivo Darstellung Studien ist, dass es Forschern besseren Zugang zum Gehirn Bereich von Interesse und folglich nicht teuer stereo (und oft elektro) Ausrüstung umfassen. Darüber hinaus ist die für das Gehirn Explantate erforderliche Überlebenszeit erstreckt sich über nur ein paar Stunden (1 - 4) anstelle von Tagen oder sogar Wochen im Fall von in vivo-Tracer Injektionen (siehe eine detaillierte Überprüfung auf der Verwendung von Dextran Amine und andere Tracer in In-vivo-Injektionen von Lanciego und Wouterlood 2011 22, aber auch Rodriguez-Contreras, et al., 2008, 23), so dass nicht erfolgreich Injektionen können bereits während der Injektion festgestellt werden oder spätestens am nächsten Tag um, so dass die Einspritzparameter angepasst werden. Die kurze Überlebenszeit für die Gehirn Explantate bedeutet auch, dass es in der Regel eine kleinere Differenz zwischen dem <em> wirksam (Bereich, in dem der Farbstoff wurde von Neuronen in anterograde oder axonale Terminals in retrograder Injektionen entnommen) und die scheinbare (Bereich, in dem der Farbstoff vergossen, ohne aufgenommen) der Injektionsstelle, obwohl dieser Unterschied kann nie ausgeschlossen werden, vollständig und kann nur quantifiziert / werden für die post-hoc, die in einigen Fällen völlig unmöglich sein kann, gesteuert (siehe Albrecht et al., 2014 für eine ausführlichere Diskussion 24).
Es sollte darauf hingewiesen werden, dass Verbindungen von praktisch jeder Länge können mit diesem Verfahren untersucht werden, solange der Experimentator in der Lage ist, sowohl die Injektionsstelle und dessen Ziel- oder Quellbereich axonale Projektionen in einem einzigen Stück aus Gehirngewebe zu erhalten. Die Visualisierung von solchen Verbindungen können entweder durch Rekonstruktion der konfokalen nach dem Schneiden und Befestigung des Gehirns (wie hier beschrieben) erfassten Bildstapel oder ganzen Gehirn / brain Platte bildgebenden Verfahren nach dem Ausführen Gewebe klar erreicht werdening Protokolle (siehe Abschnitt 5 in diesem Protokoll für ein Beispiel).
Der große Vorteil unserer Technik der lasergelenkten in vitro Elektroporation ist die signifikante Erhöhung der Zielgenauigkeit während Tracer Injektionen. Die ursprüngliche Methode der Elektroporation in vitro beruht auf nur eine visuelle Kontrolle, indem sie auf bestimmte topographische Marker oder sie als Führungen für den ungefähren Bereich der Injektion. Das gleiche gilt für den Farbstoff Ausbreitung im Zielbereich: Man kann den Farbstoff Streuung beachten, aber es ist nicht einfach, den Farbstoff Ausbreitung in einem feineren Weise zu steuern. Mit dem Laser Abwandlung dieses Verfahrens kann ein Forscher einfacher Kerne und Zellen von Interesse und Beachten des Farbstoffs Ausbreitung im Kern / Zellpopulation von Interesse, durch die Wechselwirkung des indigenen genetisch angetrieben Fluoreszenz und die Fluoreszenz des Farbstoffs. So, ein Forscher Gewinne mehr Kontrolle über sein / ihr Verfolgung Experiment durch Minimierung von False Positives in antero- oder retrogradeFüllungen, da Zellen / axonalen Anschlüsse außerhalb des Kerns / Gebiet von Interesse wurden während der Injektion als auch gefüllt. Offensichtlich bedeutet dies nicht eine absolute Kontrolle über die effektive Stelle der Injektion, die, wie bereits erwähnt, kann aus der scheinbaren Ort abweichen. Eine Einschränkung dieser Technik ist natürlich die Verfügbarkeit von gentechnisch veränderten Organismen. Mäuse sind ein weit verbreitetes genetischen Modellorganismus in Säugetierstudien, die auch für den Gehör Feld ist, aber einige Säugermodellen in Betracht gezogen werden besser, weil sie genauer ähneln der menschlichen Audiogramm. Somit können andere Techniken eingesetzt werden, um neuronale Populationen in Wildtyp-Tieren anderer Arten, für eine bestimmte Art von Forschungsfeld besser geeignet (zB Rennmäuse oder Chinchillas in Studien des auditorischen Systems 25-28) zu kennzeichnen: das könnte virale Injektionen nutzen sind bestimmten Promotoren gezielt nur bestimmte Kammern des Gehirns und Exprimieren fluoreszierent Markierungen in nur einer Untergruppe von Gehirnzellen. Natürlich braucht besondere Sorgfalt getroffen werden, um die Gültigkeit der exprimierten genetischen Konstrukte im rechten Unterpopulation von Neuronen zu gewährleisten, egal ob solche Konstrukte viral in Wildtyptieren oder indigenously in Knock-in-Maus-Linien ausgedrückt werden.
Wie bereits erwähnt, kann der Vorteil der Mausmutanten exprimieren fluoreszierenden Proteinen in bestimmten Subpopulationen von Neuronen auch für die funktionelle Charakterisierung von Gehirn-Schaltung (in unserem Fall konnten wir hemmende Vorsprünge von einer Hirnstammzellkern durch reine Visualisierung der Charakterisierung zu einem anderen 24 Die Ergebnisse unserer Versuche Verfolgung). Auch hier wird die Gültigkeit der zum Ausdruck genetische Konstrukte bestätigt werden muss, bevor eine Interpretation der Ergebnisse der Ablaufverfolgung Experimente stattfinden können.
Eine weitere allgemeine Stärke in vitro Elektroporation ist seine Kompatibilität mit other anatomischen Methoden wie (Immuno) Histochemie und Gehirn Lichtung. Wie zuvor gezeigt, 24 ist es nicht durch die Anwendung von zusätzlichen Färbetechniken wie Nissl oder einer Gehirnleermethode genannt ClearT2 12 20,24 beeinflusst. Der größte Nachteil, dass man im Auge zu behalten ist, dass die Eindringtiefe der Nissl und Antikörper färbt mit zunehmender Gewebedicke zu verringern, so muss man die Optionen des axonalen Prozesserhaltung in dickere Scheiben gegenüber Signalstärke des zusätzlichen (immun) histochemische wiegen Färbung in Experimenten, bei denen beide anatomischen Markierungsverfahren benötigt werden. Natürlich ist ein anderer zu berücksichtigender Faktor der Anregungs- / Emissionsbandbreite Trennung der verschiedenen Fluoreszenzmarkierungen, da die minimale Anzahl von Etiketten beginnt bei drei Marker an dieser Stelle (indigenen fluoreszierendes Protein Expression, Tracer und Nissl / Antikörper-Markierung).
Offensichtlich können unsere beschriebenen Verfahren ausgebaut werdenInjektionen von jeder Art von fluoreszierenden Markern (einschließlich Quanten Kügelchen) in das Gehirn Explantate oder Gehirnscheiben von transgenen Mäusen. Da die Einspritzgenauigkeit hängt sowohl eine eindeutige Zielerfassung (die Beobachtung der fluoreszenzmarkierten Keime und Zellen) und eine bessere Kontrolle über das Spill des Fluoreszenzfarbstoffs, eine einzige dieser zwei Faktoren für eine erhöhte Einspritzgenauigkeit sollte ausreichen, auch wenn die andere fehlt. Dies bedeutet, daß verschiedene nicht-fluoreszierende Marker (wie virale Konstrukte oder andere DNA / RNA-Vektoren) kann mit höherer Genauigkeit in das Gehirn Kerne von Interesse eingespritzt werden, solange die Zielkeime sind deutlich sichtbar Experimentators. Diese letztere Anwendung ist besonders interessant, weil Elektroporation hat ermöglichen effektive Aufnahme von DNA-Material, sowie 29 bis 30, so dass unsere Methode nahezu ideal für diese Art von Injektionen. Der einzige Nachteil, der berücksichtigt werden muss, ist, dass die DNA-Konstrukte die Zeit nehmen, um auszudrücken, und das Problem der Live tiUSGABE Erhaltung entsteht. Dies könnte durch die Schaffung organotypischen Hirnschnittkulturen überwunden werden 31-32 basierend auf spritzt Hirnschnitten (oder neu geschnittenen Hirngewebe Blöcke), die für Live-Gewebekonservierung in der Größenordnung von Wochen zu ermöglichen.
Und natürlich andere transgene Maus-Mutanten verwendet werden, um die Konnektivität von anderen neuronalen Typen wie cholinergen Neuronen zu untersuchen (zB im Chat-GFP-Mäuse 33), so dass diese Methode ein vielseitiges Werkzeug, um die Konnektivität und Funktionalität des Gehirns (Mikro-) Schaltungen zu studieren.
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Disclosures
Wir haben nichts zu offenbaren.
Acknowledgments
Teilweise durch NIH / NCRR Colorado CTSI Statt Anzahl UL1 RR025780 und den Rocky Mountain Neurlogical Disorders Kernmitte Statt NIH P30NS048154 Unterstützt von NIH / wurden NIDCD R01 DC 011582. Imaging Experimente in der Universität von Colorado Anschutz Medical Campus Advanced Light Microscopy Kerndurchgeführt unterstützt. Dr. Sascha du Lac aus dem Salk Institute hat uns mit den GlyT2-GFP-Mäusen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | All chemicals are from Sigma-Aldrich, unless noted otherwise. |
| Potassium chloride | P9333 | ||
| Potassium phosphate monobasic | P5655 | ||
| Sodium phosphate di-basic | S907 | ||
| Magnesium chloride | M2670 | ||
| Calcium chloride | C5080 | ||
| Glucose | G7528 | ||
| Sodium bicarbonate | S6297 | ||
| Ascorbic acid | A4544 | ||
| Myo-inositol | I5125 | ||
| Sodium pyruvate | P2256 | ||
| Bovine serum albumine | A2153 | optional, for additional (immuno)histochemistry | |
| Triton-X-100 | X100 | optional, for additional (immuno)histochemistry | |
| Poly(ethylene glycol), 8000 MW | P2139 | optional, for brain clearing | |
| Formamide | Fisher Scientific | F84 | optional, for brain clearing |
| Choleratoxin subunit-b | Molecular Probes | C-34776 (Alexa 555) | |
| Dextrane tetramethyl-rhodamine | Molecular Probes | D-7162 (Alexa 555) | |
| Fluorescent Nissl | Invitrogen | N-21479 (blue) | optional |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | SF93 | |
| Agarose | Invitrogen | 16520 | |
| Fluoromount-G | Southern Biotech | 0100-01 | |
| Pentobarbi-tal | Vortech Pharmaceuticals | Fatal-Plus | |
| Borosilicate glass filaments | Harvard Apparatus | G150F-10 | |
| Pipette puller | Zeitz Instruments, Germany | DMZ Universal Puller | |
| Perfusion setup | Custom-made | ||
| Laser pointer | laserpointerpro.com, Hong Kong | HK-88007294 (405 nm) | |
| Filter/safety goggles | Dragon Lasers, China | LSG09 (band-pass 450-700 nm) | |
| Bionocular microscope | Wild Heerbrugg, Switzerland | Wild M3 | Equipped with high-intensity illuminator (MI-150; Dolan-Jenner Inc.) |
| Picospritzer | Parker Instruments | Picospritzer III | |
| PC with installed MC Stimulus software | Multi Channel Sys-tems, Germany (software) | ||
| 2-channel stimulator | Multi Channel Sys-tems, Germany | STG-1002 | |
| Stimulation isolation unit | A.M.P.I., Israel | Iso-Flex | |
| Micromanipulator | Narishige, Japan | YOU-1 | |
| Vibratome | Leica, Germany | VT1000S |
References
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