Summary
אנו מתארים טכניקה לתייג נוירונים והתהליכים שלהם באמצעות זריקות אנטרוגרדית או נותב מדרדר לגרעיני מוח באמצעות הכנה במבחנה. אנחנו שונה בשיטה הקיימת שלי n המבחנה electroporation נותב על ידי ניצול של שכותרתו fluorescently מוטציות עכבר וציוד אופטי בסיסי כדי להגדיל את דיוק תיוג.
Abstract
אנו מציגים טכניקה המשלבת במבחנה פרוטוקול הזרקה נותב, אשר עושה שימוש בסדרה של פולסים חשמליים ולחץ כדי להגדיל את ספיגת צבע באמצעות electroporation בexplants המוח עם תאורת לייזר ממוקדת ומשקפי מסנן התאמה במהלך ההליך. הטכניקה המתוארת של electroporation במבחנה על ידי עצמו מניבה שליטה חזותית טובה יחסית לה ממוקדים באזורים מסוימים של המוח. על ידי שילוב של זה עם עירור לייזר של סמנים גנטיים ניאון וקריאה דרך המשקפים מסננים-עובר להקה, שיכול להרים את הפליטה של תאים / גרעינים שכותרתו גנטית וצבע איתור הניאון, חוקר יכול להגדיל באופן משמעותי את דיוקם של זריקות על ידי מציאת השטח של עניין ושליטה לצבע-התפשטות / הספיגה באזור ההזרקה ביעילות רבה יותר. בנוסף, טכניקת תאורת הלייזר מאפשרת ללמוד את הפונקציונליות של neurocircuit ניתנו על ידי providing מידע על הסוג של הנוירונים מקרינים לאזור מסוים במקרים שבהם הביטוי של GFP קשור לסוג של משדר מתבטא בתת-אוכלוסייה של תאי עצב.
Introduction
על מנת להגדיר מעגל מסוים עצבי (מיקרו), יש להתחיל על ידי מציאת המשתתפים השונים של מעגל אמר, ודפוס הקשר שלהם. מאז הפרסום של וולר על neurofiber התחקות דרך lesioning 1 מגוון רחב של טכניקות מעקב neuroanatomical כבר נקבע. חלק מטכניקות אלה ניתן ליישם בנתיחה שלאחר מות רקמות קבועות 2-4, אחרים מסתמכים על התחבורה הפעילה של הצבע בתאי עצב חי, כפי שהתגלו בשנת 1971 5-6. האחרון יכול להיות מחולק חלוקה נוספת בשתי קבוצות להפלות בין שיטות ניצול של מדרדר פעיל (מהאזור המוזרק למקור של הקרנה נתון, כלומר. Somata של נוירונים שמקרינים לאמר אזור) ואנטרוגרדית הפעילה (מהזריק אזור ליעד של הקרנה נתון, כלומר. תחזיות axonal ומסופי axonal של התחבורה) נוירונים שכותרת. כמו כן, במקרים מסוימים traחומר מוזרק לתוך CER בעלי חיים שלאחר מכן לשרוד את הזריקה בכמה ימים או שבועות (בזריקות נותב vivo), ואילו במקרים אחרים מוח explanted מוזרקים ודגירה במשך כמה שעות לאחר ההזרקה בנוזל השדרתי מלאכותי (במבחנה זריקות נותב) .
בפרוטוקול זה אנו שונה קיימים בטכניקת electroporation מבחנה 7-8 לתייג somata ותהליכים עצביים בניסויי אנטרוגרדית ומעקב מדרדר באמצעות dextran choleratoxin מקטע-ב וtetramethylrhodamine כחומרי התחקות. המטרה הכללית של פרוטוקול זה היא לספק מדעני מוח עם כלי יעיל כדי לעקוב אחר דפוסי קישוריות עצביים בין גרעינים שונים במוח, תוך ניצול קווים זמינים מהונדסים עכבר וציוד אופטי בסיסי כדי להגדיל את דיוק מיקוד במהלך זריקות נותב. למרות שהשיטה של אנטרוגרדית ומעקב מדרדר באמצעותcholeratoxin והאמין dextran וconjugates שכותרתו fluorescently שלהם הוא לא חדש 9-13 (כמו השיטה של electroporation, למשל. et al האס. 14), השילוב של זריקות נותב עם electroporation בהכנה במבחנה מעורב בלוקים של רקמת המוח הוא התפתחות האחרונה יותר 7. היתרון העיקרי שלה על פני שיטות מעקב עצביות באמצעות אותו הסוג של צבעים נותב בבעלי חיים הוא עוצמת התיוג המוגברת, בשל היעילות גבוהה יותר שבה צבע electroporated הוא נלקח על ידי תאי עצב. יתרון נוסף הוא התקופה המקוצרת הדגירה (הנדרשת להובלת הצבע) ודיוק היעד המוגבר שלה במהלך ההזרקה נותב, כי הנסיין יש שליטה חזותית על אזור היעד של ההזרקה. האחרון גם אומר שאין צורך בציוד יקר stereotactic למצוא את אזור הגרעין או מוח של עניין.
לaddiלהגדיל tionally מיקוד דיוק, אנו ניצלנו קו עכבר מהונדס, המבטא GFP בתת-אוכלוסיית glycinergic של נוירונים 15 וציוד אופטי בסיסי בהיקף של מצביע לייזר כף יד של משקפי סינון אורך גל והתאמת להקה עובר 405 ננומטר (450 - 700 ננומטר). כך, השגנו גידול משמעותי נוסף במיקוד דיוק בזיהוי אזור ההזרקה באמצעות אות הניאון שלה ועל ידי מתן דרך עדינה יותר כדי לשלוט על התפשטות הצבע בתוך אזור ההזרקה באמצעות ההתבוננות באינטראקציה בין אות ה- GFP ילידים ונותבו פלוּאוֹרסצֵנצִיָה. הטכניקה שלנו גם מאפשרת לחשוף את הפונקציונליות של מעגל יחד עם הקישוריות שלה על ידי זיהוי נוירונים מעכבים GFP החיובי (או מעוררת בקווי עכבר אחרים) שהיו מלא בנותבה.
לסיכום, אנו נוספים משופרים כלי נירולוגית מדעי רב עוצמה כדי לחקור connectome של מוח החוליות ולהעריך tהוא תכונות neuroanatomical שונות של neurocircuit נתון. על ידי שימוש בעכברים מהונדסים יחד עם ציוד אופטי זול וזמין באופן נרחב הצלחנו להגביר את דיוק המיקוד שלנו באופן משמעותי הזריקות. יתר על כן, העכברים הטרנסגניים אפשרו לנו לזהות את סוג הקשרים לייחס, שסייעו לחשוף את הפונקציונליות של microcircuit מעכב בגזע המוח השמיעתי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Genotyping האופטי
1. האופטי Genotyping של גורי עכבר
- בדקו ביטוי של סמן פלואורסצנטי המתאים באמצעות מצביע לייזר של גל העירור המתאים (405 ננומטר בניסויים שתוארו כאן) ומתאימים משקפי מסנן חוסמים את גל העירור אבל עובר את אורך גל הפליטה (450-700 ננומטר בניסויים שתוארו כאן) . כוון את מצביע הלייזר בחלק האחורי של הראש או בחוט השדרה של גור העכבר (ראה איור 1). הימנע זורח הלייזר בעיניים והחשיפה ממושכת של העור לאור הלייזר.
2. האופטי Genotyping של בעלי חיים ישנים יותר
- עמוק להרדים את העכבר (P14 הגיל לp138 בניסויים שתוארו כאן) עם מנת יתר של pentobarbital באמצעות זריקת intraperitoneal (120 מ"ג / קילוגרם משקל גוף). אשר הרדמה תקינה על ידי בדיקת הרפלקסים של החיה (לצבוט את הקצה של ה בקצרהאוזן דואר או באחד מרגליו האחוריות כדי לעורר את רפלקס הנסיגה של האוזן או רגל).
- הערה: למרות השימוש במנת יתר של pentobarbital (120 מ"ג / קילוגרם משקל גוף) אנו מתייחסים להליך ההזרקה כ" הרדמה עמוקה "במקום המתת חסד, כי בעלי החיים הוא באופן אידיאלי עדיין בחיים (כלומר לבו עדיין פועם), כאשר ניתוח ולהתחיל זלוף. הדבר מבטיח זלוף יעיל יותר של האיברים הפנימיים כולל המוח.
- ברגע שבעלי החיים לא מראים שום רפלקסים, להסיר בזהירות את העור שמעל הגולגולת (איור 2 א) על ידי ביצוע חתך בעור המכסה את החלק האחורי של הראש וחיתוך לבטן של הגולגולת. לחשוף את הגולגולת שנחשפה לאור הלייזר ולבחון את הקרינה באמצעות משקפי המסנן כמתואר לעיל. אם אות ה- GFP חיובית הוא ציין, המשך לשלב 2, אם לא, להקריב בעלי החיים באמצעות עריפת הראש (שני / הבטחת צורה של המתת חסד הבאה שלנותקנות IACUC).
הערה: בעכברים אפילו מבוגרים (> 1 חודש) ניתן לראות את הקרינה דרך עיניו של בעל החיים.
2. Transcardial זלוף ומוח הכנה
- Perfuse transcardially עם פוספט קר כקרח שנאגרו (PBS; NaCl: 137 מ"מ, KCl: 2.7 מ"מ, KH 2 PO 4: 1.76 מ"מ, Na 2 HPO 4: 10 מ"מ) באמצעות מחט מזרק 30 G כדי להסיר במידה רבה את הדם מ החיה.
- ראשית, לפתוח בזהירות את כלוב הצלעות עם מספריים חדים ולאחר מכן דחף את המחט לתוך החדר השמאלי של הלב. להתחיל לשאוב PBS לתוך הלב ואב העורקים ומייד לאחר שלב זה לפתוח את אטריום ימין של הלב עם המספריים כדי לאפשר לדם כדי לצאת מהגוף. הערה: זלוף לוקח 5 - 10 דקות, תלוי בגודל של החיה.
- לאחר exsanguination באמצעות זלוף, לערוף את החיה, לאבטח את ראשה עם n הסיכהeedles (או 30 מחטי מזרק G) על ידי הפירסינג דרך ארובות עיניים בצלחת הכנה ולהסיר את המוח מהגולגולת.
- ראשית, להשתמש במספריים חדים לחתוך את העור שכיסה את הגולגולת: לעשות חתך קטן בחלק האחורי של הראש, ואז לחתוך לאורך קו האמצע בצד הגב של הראש, לחתוך לצדדים רק caudally של העיניים של בעלי החיים ולבסוף חתך לכיוון הזנב להסיר לחלוטין את הדשים של עור בחלק האחורי של הראש.
- הבא, לחזור על אותה תבנית החיתוך לגולגולת עצמה, הקפד להסיר את שני cochleas בתהליך, כי זה יהיה משמעותי לפשט את ההסרה של גזע המוח בסופו של הדבר. לאחר הליך זה חצי הזנב של המוח צריך לשקר חשוף לחלוטין.
- בשלב הבא, להשתמש בסכין גילוח חד או אזמל כדי לחתוך את כל המוח הקדמי בזווית של 45 מעלות ועל כ -2 מ"מ מקורי מהמוח הקטן. לגרוף את החלק הקדמי של המוח המופרד עם abמרית אף אוזן גרון.
- השתמש במרית כדי להעלות את מחצית הזנב של המוח בסוף מקורי שלה ולאחר מכן לחתוך את עצבי גולגולת שעדיין מחוברים לגזע המוח בצד הגחון שלה. כתוצאה סופית, חצי הזנב של המוח כולל גזע המוח צריך ליפול באופן חופשי את שאר ראש החיה מוכן.
- הפוך את מחצית הזנב הוסרה מהמוח כדי לחשוף צד הגחון שלה ולחתוך לאורך מישור העטרה מקורי רק (לזריקות אנטרוגרדית) או רק הזנב (לזריקות מדרדר) של "נורות" ממוקם ventrally מכיל גוף הטרפז (ראה שלב 2.3).
- השתמש תמיד בסכין גילוח חד או אזמל להליך החיתוך כדי למזער מוות של תאים הנגרם על ידי לחץ מכאני מוגזם ברקמות. כתוצאה סופית, צריך התקבלו explant המוח פורש כ 1 סנטימטר באורך ומכיל קומפלקס olivary מעולה המלא לאורך אזורים אחרים במוח.
הערה: פרוטוקול זה מדגים את הליך הזרקה נותב לתוך גוף הטרפז ממוקם בגזע המוח השמיעתי. להתאים את המיקום וכיוון של מטוסי החיתוך ואתרי הזרקה בהתאם לצורך. אם האזורים במוח fluorescing של שקר הריבית קרוב מספיק למשטח המוח, כך שהם יכולים להיות מזוהים והזריקו בלי לחתוך את המוח (ראו איור 2), ולאחר מכן ניתן להשמיט את צעד חיתוך העטרה.
- זהה את גוף הטרפז כשני "נורות" בולט הגחון המכיל את גרעין הגחון של גוף הטרפז (VNTB).
הערה: התייחסות אנטומיים נוספת בדבר מיקום stereotactic המשוער של מטוסי חיתוך אלה, ראה פרנקלין ופקסינוס, 2008. לוח 78 לאטלס, גבחת ~ -5.7 מ"מ מראה את הגרעין המדיאלי של גוף הטרפז (= MNTB) שכותרתו "צ ". לוח 69 מציג את גרעין הגחון של bo הטרפזdy (VNTB) שכותרתו "MVPO" (גרעין periolivary medioventral) 19.
3. אנטרוגרדית / מדרדר איתור
הערה: בצע את כל הנהלים הבאים ב RT (25 מעלות צלזיוס).
- לאחר החיתוך, למקם את explant גזע המוח בצלחת הכנה מכיל חומץ (95% O 2, 5% CO 2) לנתח פתרון (NaCl: 125 מ"מ, KCl: 2.5 מ"מ, MgCl 2: 1 מ"מ, CaCl 2: 0.1 מ"מ, גלוקוז : 25 מ"מ, Nah 2 PO 4: 1.25 מ"מ, NaHCO 3: 25 מ"מ, חומצה אסקורבית: 0.4 מ"מ, מיו-אינוזיטול: 3 מ"מ, פירובט: 2 מ"מ), המאבטחת אותו עם 30 מחטי מזרק G. ודא שהאזור של הזרקה פונה כלפי מעלה.
- משוך טפטפות הזרקה מהזכוכית בורוסיליקט ולמלא אותם באחד משלושת הפתרונות הבאים: א) פתרון 1.0 מ"ג / מיליליטר של choleratoxin מקטע-ב מצומדות לfluorophore Alexa 555 ב PBS 12-13 (משמש בעיקר לתחבורה מדרדר), ב ) -d 1%ilution מלוחים 0.9% מtetramethylrhodamine dextran 555 (3,000 מגוואט, המשמש בעיקר לתחבורה מדרדר) או ג) -dilution 1% בתמיסת מלח 0.9% 10,000 מגה וואט dextran-TRITC 555 (משמש בעיקר לתחבורת אנטרוגרדית).
- להבטיח טווח התנגדויות פיפטה ההזרקה ש2.5-3.5 mOhm וכי הם מיוצרים ב 3 - 4 מחזורים מושכים. לניסויים שתוארו כאן, להשיג זאת על ידי בחירת אלגוריתם מושך מתוכנתים מראש על חולץ פיפטה.
- להאיר את explant המוח באמצעות מצביע לייזר רכוב סטטי של אורך הגל המתאים (פריט מס '2 באיור 3 א; 405 אורך גל בניסויים שתוארו כאן). השתמש במצביע הלייזר כמדריך לזריקות, ולכוון את קרן הלייזר בגרעין המוח שכותרתו fluorescently או תאים של ריבית שהוזרקו.
- מצא ולבחון את אזור היעד המואר באמצעות מיקרוסקופ משקפת בעת לובש משקפי מסנן התואמים (450-70מסנן להקה עוברת 0 ננומטר בניסויים שתוארו כאן). הכנס את האלקטרודה ההזרקה באמצעות micromanipulator לאזור של עניין.
- להזריק את החומר נותב. הזריקות מורכבות של 2 - 10 פעימות בלחץ 15 PSI 50 msec כל, שימוש במכשיר הזרקה בלחץ, בבימויו בניצב לאזור של העניין (ROI) בתוך קטע המוח. לנהל דופק בכל לחץ במרווחים של 10 - 15 שניות כדי לאפשר לצבע להתפשט.
- במקרה של זריקות tetramethylrhodamine (TRITC), גם לעורר חשמלי כדי לשפר את ספיגת הצבע באמצעות electroporation עם אלקטרודה ממוקמת באזור המוח של עניין (MNTB וVNTB בניסויים שתוארו כאן).
- השתמש 8 פולסים TTL של 8 וולט עבור 50 אלפיות שניים עם 50 אלפיות שניים interpulse מרווחים, מונעים על ידי ממריץ ומוגבר ל -55 V עם יחידת בידוד גירוי (פריטי מס '7 ו -9 באיור 3). השתמש 10 - 20 חזרות של פרוטוקול, מינהל זהtered על פני כמה דקות 7,8. הקפד להאריק את האלקטרודה כראוי - חוט ההארקה צריך להיות מחובר לפתרון האמבטיה!
- בדוק להצלחה של ההזרקה. מאז נותב ניאון עם אורך גל פליטה יותר גם פולט אות ניאון על עירור לייזר עם אורכי גל קצרים יותר, מבחינה ויזואלית לבדוק את ספיגת הצבע / התפשטה באזור היעד המוזרק בעת מאיר את האזור עם הלייזר וההתבוננות דרך המשקפים מסננים.
4. דגירה
- לאחר ההזרקה, דגירה brainstems בנוזל השדרתי מלאכותי מחומצן (ACSF; NaCl: 125 מ"מ, KCl: 2.5 מ"מ, MgCl 2: 1 מ"מ, CaCl 2: 2 מ"מ, גלוקוז: 25 מ"מ, Nah 2 PO 4: 1.25 מ"מ, NaHCO 3: 25 מ"מ, חומצה אסקורבית: 0.4 מ"מ, מיו-אינוזיטול: 3 מ"מ, פירובט: 2 מ"מ, מבעבע עם 95% O 2 - 5% CO 2) בטמפרטורת חדר (RT, 25 מעלות צלזיוס) במשך 1 - 4 שעות, ואילוהצבע הוא להיות מועבר. בועת הפתרון במשך כל תקופת הדגירה.
- בהמשך לכך, להעביר את brainstems paraformaldehyde 4% (PFA) מומס בPBS (כ -100 מיליליטר;. PH 7 לתמהיל PFA / PBS) דגירה אותם ב 4 ° C כדי לאפשר לאחר קיבוע-לילה (O / N).
5. רקמות חיתוך והרכבה
- למחרת, לשטוף את המוח שלוש פעמים PBS (5 דקות לכל שלב כביסה), לכסות אותו באגר 4% ואז לחתוך ל50-80 מיקרומטר פרוסות עבות על vibratome. פרוסות הר באמצעות הרכבה בינונית בשקופית זכוכית, וcoverslip.
- לחלופין, לתייג חלקים עם Nissl פלורסנט במשך 25 דקות (לדוגמא Nissl הכחול של 1: בתקשורת AB דילול 100).
- כדי להכין תקשורת AB, לערבב 250 מיליליטר של 0.2 M חיץ פוספט (PB; 51 מ"מ KH 2 PO 4, 150 מ"מ Na 2 HPO 4), 15 מיליליטר 5 M NaCl, 15 מיליליטר 10% Triton-X, 220 מיליליטר DDH 2 O וalbumine סרום שור 5 גרם.
- בר דודדה ולהצליח צעד Nissl תיוג על ידי 3 שלבי כביסה בPBS (10 דקות כל אחד).
הערה: במקרים בהם חלקים עבים צריכים להיות מותקנים ונותחו (בניסויים שתוארו כאן פרוסות כזה היו 100-500 מיקרון העבה לשמר קשרי axonal על פני מרחקים גדולים יותר), הטכניקה יכולה להיות משולבת עם סליקת רקמה. מצאנו ClearT2 12 כדי להצליח 20. כאשר צעד סליקת רקמה כלול, לבצע אותו לפני ההרכבה החלקים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
נתונים מראה 1 ו -2 איך מצביע לייזר ומשקפי בלייזר יכולים לשמש לגנוטיפ במהירות ובזול חיות חיוביות GFP מהמלטה. במקרים של גורי עכבר צעירים, הטכניקה יכולה לשמש כדי לזהות noninvasively תווית ה- GFP במוח של החיה דרך הגולגולת והעור שמעליה (איור 1 א - ד). הקרינה נפלטת ניתן לראות דרך העור והגולגולת של גורי עכבר לפחות עד יום לידה 3 (איור 1 ג). ההליך מוצג באיור 1 לחלבון ירוק-הניאון שלנו (GFP) שכותרתו קו העכבר להביע GFP בתת-האוכלוסייה שלה glycinergic של נוירונים (GlyT2-GFP). בבעלי חיים מבוגרים עם גולגולות עבות יותר ועור פיגמנט, תווית GFP מציגה פחות טובה דרך עור ועצמות, ולכן העור על הראש ו / או צוואר צריך להסיר לפני genotyping האופטי (איור 2 א).
לאחר מרוססבעלי החיים המוח נלקחים החוצה ומואר שוב כדי למצוא את הגרעינים שכותרתו fluorescently של עניין. המבנים הבהירים שמאירים קרוב לפני שטח הגחון של גזע המוח באיור 2 הם שני גרעיני הגחון של גוף הטרפז, שבו אנו משמשים כשני מדריך ויעד לזריקות נותב. איורים 4 ו -5 להראות תוצאות נציג הזרקת אנטרוגרדית לתוך גרעין הגחון של גוף הטרפז dextrane tetramethylrhodamine באמצעות (VNTB) (TRITC;. איור 4) ושתי זריקות מדרדר לתוך הגרעין המדיאלי של גוף הטרפז (MNTB) באמצעות מקטע-ב choleratoxin (CTB; 5A דמויות ו B) וTRITC (5C דמויות ו- D). תיוג axonal בהיר מצביע (במקרה זה מעכב) תחזיות מVNTB לMNTB ניתן לראות הבא הזרקת אנטרוגרדית לVNTB (איור 4). דמויות 5A ו5C להראות סקירה על האתרהזרקה (MNTB) עם הגרעין המכיל את תאי שכותרת retrogradely (VNTB) לידו. איורים תמונות מוגדלות מופע 5 ו5D של retrogradely כותרת somata של תאי VNTB glycinergic בהם החלקים כמוצגים באיור 5 א 'ו -5 ג. שים לב איך המעקב המדרדר עם CTB תוצאות בדפוס יותר punctate 12-13 (איור 5), ואילו תאי VNTB כותרת retrogradely עם TRITC להציג תיוג צפוף מאוד כמו Golgi-21 (איור 5D).
איור 1:. עכברים האופטי Genotyping של GlyT2-GFP חיובי וGlyT2-GFP-שלילי עכברי GFP החיובי צולמו תחת () תנאי תאורה רגילים, (ב) על תאורת לייזר עם מצביע לייזר 405 ננומטר ללא ירוק משקפי סינון ו- (ג)על תאורת לייזר עם משקפי בטיחות הלייזר וUV. אות ה- GFP חזקה גלויה באזור שמעל המוח הקטן וגזע המוח. (ד), לעומת זאת, גורי GlyT2-GFP-שלילי מאותו קו העכבר והגיל (P2) לא מראים שום סימנים של הקרינה באותם האזורים ( חלק אחורי של הראש וחוט השדרה). אור הלייזר הכחול מסונן ביעילות על ידי המשקפים.
איור 2: האופטי Genotyping וexplant המוח הוכן. גולגולתו של גור עכבר () P4 GlyT2-GFP חשוף לתאורת לייזר ונצפתה דרך משקפי סינון להקה עוברת. GFP שזורח בניתן לצפות דרך הגולגולת. Explant המוח (ב ') מאותו הגור בצלחת הכנה על תאורת לייזר, כפי שניתן לראות דרך משקפי הסינון. האקסונים Glycinergic וגרעינים מוח, כגון גרעין הגחון של גוף הטרפז (VNTB) ניתן לראות כVerמבני y בהירים קרובים למשטח המוח.
איור 3: סקירה כללית במהלך במבחנה הזרקה בלחץ והתקנת Electroporation. stereoscope, 2: 1 () מצביע לייזר רכוב (אורך גל nm 405), 3: headstage עם פיפטה הזרקה רכובה על micromanipulator, 4: צלחת הכנה המכילה את explant המוח, 5: מחשב עם תוכנת Stimulus MC מותקן, 6: מכשיר לחץ הזרקה, מחובר לפיפטה ההזרקה דרך צינורות (ב) 7:. יחידת גירוי בידוד, 8: הפנס בעוצמה גבוהה, 9: ממריץ. ממריץ מחובר לאלקטרודה בפיפטה באמצעות יחידת בידוד גירוי ומונע על ידי המחשב.
איור 4: איתור אנטרוגרדית של חיבורים מעכבים מVNTB לגרעין המדיאלי של גוף הטרפז (MNTB). מוצגת היא השלכה המרבית של מחסנית confocal נלקחה בפרוסה אופקית פורש כ -200 מיקרון בעומק במוח פינה של עכבר GlyT2-GFP P14. בעקבות הזרקת dextrane tetramethylrhodamine (TRITC) לחלק caudo-המדיאלי של VNTB, שכותרתו במאור קשרי axonal (ובמקרים מסוימים הסופים טרמינל) מVNTB לMNTB ניתן לצפות. בר סולם: 200 מיקרומטר.
איור 5:. מדרדר זריקות נותב לMNTB לחשוף מלאה תאי Glycinergic בVNTB מוצגים הם תחזיות המרביות של ערימות confocal נלקחו בפרוסות העטרה של P88 (A, B) וP80 (C, D (המשתרעות על כ -50 מיקרומטר.) הזרקה) עכבר GlyT2-GFP. (א) סקירה של choleratoxin מקטע-ב (CTB) לחלק המדיאלי של MNTB. (ב) תאי Glycinergic בVNTB מלאים CTB (puncta האדום בתוך somata התא) כתוצאה מההזרקה שמוצגת באיור 5 א. חלק מpuncta מופיע מחוץ לתאים, אשר יכול להצביע על סוגי תאי GFP-שלילי (לא glycinergic) אחרים בVNTB להיות מלאה, כמו גם (בגלל סיבים פצועים של מעבר באזור ההזרקה, למשל) . (ג) סקירה נוספת של הזרקת TRITC מדרדר מיקוד MNTB. הערה, איך מספר התאים מלא בTRITC בMNTB הבא electroporation (בניגוד לCTB הטהור-הזריק לחץ באיור 5 א '). תיוג מדרדר של תאי VNTB glycinergic לאחר הזרקת TRITC בMNTB (אותו הזרקה (D) כפי שמוצג באיור 5 ג). רוב התאים להציג תיוג צהוב או כתום צפוף, בגלל התערובת של שני אותות ניאון (הביטוי של GFP ילידים והמילוי עם TRITC האדום). השווה עם תא GFP חיובי שמסיבה כלשהילא לקח את הצבע (חץ כחול) ותא ה- GFP-שלילי שכותרתו נותב מופיע עמוק אדום ואולי מלא, בגלל פציעת axonal באזור ההזרקה (חץ אדום). שים לב לדפוס הצביעה שונה של תאי סומא בזריקות נותב מדרדר באמצעות CTB (איור 5) וTRITC (איור 5D). ברים סולם: 5A דמויות ו5C: 200 מיקרומטר, איורים 5 ו5D: 20 מיקרומטר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
כוח כללי של במבחנה electroporation נותב, בניגוד למחקרי in vivo מעקב, הוא שזה נותן לחוקרי גישה טובה יותר לאזור במוח של עניין ולכן, אינו כרוך stereotactic יקרה (ולעתים קרובות אלקטרו) ציוד. בנוסף, תקופת ההישרדות נדרשת לexplants המוח משתרעת רק כמה שעות (1 - 4) במקום ימים או אפילו שבועות במקרה של in vivo זריקות נותב (ראה סקירה מפורטת על השימוש באמיני dextran וקליעים נותבים אחרים ב בזריקות vivo על ידי Lanciego וWouterlood, 2011 22, אלא גם רודריגז-קונטררס, et al., 2008 23), כך שיכולות להיות מזוהות זריקות לא מוצלחות כבר בבמהלך הליך ההזרקה או לכל המאוחר, ביום שלמחרת, כך כי יכולים להיות מותאמים הפרמטרים ההזרקה בהתאם. תקופת ההישרדות הקצרה לexplants המוח גם אומרת שבדרך כלל יש הבדל קטן בין <em> יעיל לכאורה (האזור שבו הצבע שנשפך, מבלי שנלקח) אתר הזרקה (אזור, שבו הצבע נלקח על ידי תאי עצב באנטרוגרדית או מסופי axonal בזריקות מדרדר), ולמרות שהבדל זה אף פעם לא יכול לשלול לחלוטין וניתן לכמת רק / מבוקר לפוסט-הוק, אשר במקרים מסוימים יכול להיות בלתי אפשרית לחלוטין (ראה אלברכט et al., 2014 לדיון מפורט יותר 24).
יש לציין את זה, כי קשרים של כמעט כל אורך ניתן ללמוד בשיטה זו, כל עוד הניסוי הוא מסוגל לשמור על שניהם באזור המוזרק ואזור היעד או מקורו של תחזיות axonal בחתיכה אחת של רקמת המוח. ההדמיה של חיבורים כאלה יכול להיות מושגת באמצעות שני השחזור של ערימות confocal תמונה שנרכשו לאחר חיתוך והרכבת המוח (כפי שמתואר כאן) או המוח כולו / טכניקות הדמיה לוח מוח לאחר ביצוע רקמה ברורהפרוטוקולי ing (ראה סעיף 5 בפרוטוקול זה לדוגמא).
היתרון העיקרי של הטכניקה של בelectroporation המבחנה מונחת לייזר שלנו הוא הגידול המשמעותי במיקוד דיוק בזריקות נותב. השיטה המקורית של במבחנה electroporation מסתמכת על שליטה רק חזותית על ידי מיקוד סמנים טופוגרפיים מסוימים או להשתמש בהם מדריכים משוערים כלאזור הזרקה. הדבר נכון גם להתפשטות הצבע באזור היעד: ניתן לראות את הצבע מתפשט, אבל זה לא קל לשלוט על התפשטות הצבע בצורה עדינה יותר. עם השינוי בלייזר בשיטה זו, חוקר יכול למצוא בקלות גרעינים ותאים של עניין ולבחון את התפשטות הצבע באוכלוסיית גרעין / התא של עניין דרך האינטראקציה של הקרינה מונעת גנטי ילידים והקרינה של הצבע. לפיכך, רווחי חוקר יותר שליטה על הניסוי שלו / שלה מעקב על ידי צמצום תוצאות חיוביות שגויות בantero- או מדרדרסתימות, כי תאים / מסופים axonal מחוץ לגרעין / שטח של העניין היו מלאים במהלך ההזרקה, כמו גם. ברור, זה לא אומר ששליטה מוחלטת על האתר היעיל של הזרקה, אשר, כאמור, יכול להיות שונה מהאתר הנראית לעין. אזהרה של טכניקה זו היא כמובן הזמינות של אורגניזמים מהונדסים גנטי. עכברים הם אורגניזם מודל גנטי בשימוש נרחב במחקרים של יונקים, שהוא גם נכון לשדה השמיעה, אבל בחלק מהדגמים יונקים יכולים להיחשב טובים יותר, כי הם דומים audiogram האנושי מדויקים יותר. לפיכך, טכניקות אחרות יכולות להיות מועסקות לתייג אוכלוסיות נוירונים בבעלי החיים wildtype של מינים אחרים מתאימים יותר לסוג מסוים של שדה מחקר (למשל גרבילים או צ'ינצ'ילות במחקרים של מערכת השמיעה 25-28): זה יכול לכלול זריקות נגיפיות מנצלות יזמים מסוימים מיקוד רק תאים מסוימים של מוח fluoresc ולהביעסמנים אף אוזן גרון וברק קבוצת משנה של תאי מוח. באופן טבעי, טיפול נוסף צריך לנקוט כדי להבטיח את תוקפו של בונה הגנטית המתבטאת בתת-האוכלוסייה תקין של תאי עצב, לא משנה אם מבנים אלה באים לידי ביטוי באופן ויראלי בבעלי החיים wildtype או indigenously בנוק-בקווי עכבר.
כפי שציין קודם לכן, את היתרון של מוטציות עכבר לבטא חלבוני ניאון בתת אוכלוסיות מסוימות של תאי עצב גם מאפשר לאפיון הפונקציונלי של מערכת חשמלית במוח (במקרה שלנו היינו יכול לאפיין תחזיות מעכבות מגרעין גזע המוח שמיעתי אחד לעוד 24 על ידי הדמיה טהורה של התוצאות של ניסויי ההתחקות שלנו). שוב, את תוקפו של בונה הגנטית הביעה צריכה להיות אישר לפני כל פרשנות של תוצאות ניסויי המעקב יכולה להתקיים.
כוח כללי נוסף של electroporation במבחנה הוא התאימות שלה עם othשיטות אה אנטומיים, כגון היסטוכימיה (החיסונית) וסליקת המוח. כפי שהודגם בעבר 24, הוא אינו מושפע על ידי היישום של טכניקות צביעה נוספות כגון Nissl, או שיטת סליקת מוח הנקראת ClearT2 12 20,24. החסרון העיקרי שצריך לזכור הוא שעומק החדירה של Nissl וכתמי נוגדן יקטן עם עובי רקמה גובר, לכן יש לשקול את האפשרויות של שימור תהליך axonal בפרוסות עבות לעומת עוצמת אות של נוסף (חיסוני) histochemical צביעה בניסויים שבם יש צורך בשני שיטות התיוג אנטומיים. כמובן, גורם נוסף שיש לשקול היא הפרדת רוחב פס עירור / פליטה של תוויות ניאון השונות, מאז המספר המינימלי של תוויות מתחיל בשלושה סמנים בשלב זה (ביטוי חלבון פלואורסצנטי ילידים, נותב וNissl / תיוג נוגדן).
ברור, השיטה המתוארת ניתן להרחיב לזריקות של כל סוג של סמני ניאון (כוללים חרוזים קוונטים) לexplants המוח או אפילו פרוסות מוח של עכברים מהונדסים. מאז דיוק ההזרקה תלוי בשניהם, זיהוי ברור יעד (התצפית של גרעינים שכותרתו fluorescently ותאים) ושליטה עדינה יותר על הדליפה של צבע הניאון, רק אחד משני גורמים אלה צריכים להספיק לדיוק הזרקה מוגבר, גם כאשר אחר נעדר. משמעות הדבר היא כי סמנים שאינם ניאון שונים (כמו מבנים נגיפיים או וקטורים / RNA אחרים DNA) ניתן להזריק בדייקנות רבה יותר לגרעיני מוח של עניין, כל עוד גרעיני היעד גלויים לעין לנסיין. יישום זה אחרון הוא מעניין במיוחד, משום שאין electroporation כמו גם 29-30 לאפשר לספיגה יעילה של חומר DNA,, מה שהופך את השיטה שלנו כמעט אידיאלית עבור סוג זה של זריקות. החסרון היחיד שצריך להתחשב בו הוא שבונת DNA לקחת את הזמן כדי לבטא והבעיה של TI החישימור ssue מתעורר. זה להיות יכול להתגבר על ידי הקמת תרבויות פרוסה מוח organotypic 31-32 מבוסס על פרוסות מוזרקות מוח (או בלוקים רקמת המוח-פרוס מחדש), המאפשרים לשימור רקמת חיה בסדר הגודל של שבועות.
וכמובן ניתן להשתמש מוטציות עכבר מהונדסים אחרות לחקור את הקישוריות של סוגים עצביים אחרים כמו תאי עצב כולינרגית (למשל בעכברי צ'אט-GFP 33), מה שהופך את שיטה זו כלי תכליתי ללמוד קישוריות ופונקציונליות של מוח מעגלים (מיקרו).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
יש לנו מה למסור.
Acknowledgments
נתמכים על ידי NIH / ניסויי 011582. הדמיה NIDCD R01 DC בוצעו באוניברסיטת קולורדו אנשוץ הרפואי קמפוס האור מתקדם מיקרוסקופית Core נתמך בחלקו על ידי NIH / NCRR קולורדו CTSI גרנט מספר UL1 RR025780 והפרעות Rocky Mountain Neurlogical Core מרכז גרנט NIH P30NS048154. ד"ר Sascha du Lac ממכון סאלק סיפק לנו עכברי GlyT2-GFP.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | All chemicals are from Sigma-Aldrich, unless noted otherwise. |
| Potassium chloride | P9333 | ||
| Potassium phosphate monobasic | P5655 | ||
| Sodium phosphate di-basic | S907 | ||
| Magnesium chloride | M2670 | ||
| Calcium chloride | C5080 | ||
| Glucose | G7528 | ||
| Sodium bicarbonate | S6297 | ||
| Ascorbic acid | A4544 | ||
| Myo-inositol | I5125 | ||
| Sodium pyruvate | P2256 | ||
| Bovine serum albumine | A2153 | optional, for additional (immuno)histochemistry | |
| Triton-X-100 | X100 | optional, for additional (immuno)histochemistry | |
| Poly(ethylene glycol), 8000 MW | P2139 | optional, for brain clearing | |
| Formamide | Fisher Scientific | F84 | optional, for brain clearing |
| Choleratoxin subunit-b | Molecular Probes | C-34776 (Alexa 555) | |
| Dextrane tetramethyl-rhodamine | Molecular Probes | D-7162 (Alexa 555) | |
| Fluorescent Nissl | Invitrogen | N-21479 (blue) | optional |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | SF93 | |
| Agarose | Invitrogen | 16520 | |
| Fluoromount-G | Southern Biotech | 0100-01 | |
| Pentobarbi-tal | Vortech Pharmaceuticals | Fatal-Plus | |
| Borosilicate glass filaments | Harvard Apparatus | G150F-10 | |
| Pipette puller | Zeitz Instruments, Germany | DMZ Universal Puller | |
| Perfusion setup | Custom-made | ||
| Laser pointer | laserpointerpro.com, Hong Kong | HK-88007294 (405 nm) | |
| Filter/safety goggles | Dragon Lasers, China | LSG09 (band-pass 450-700 nm) | |
| Bionocular microscope | Wild Heerbrugg, Switzerland | Wild M3 | Equipped with high-intensity illuminator (MI-150; Dolan-Jenner Inc.) |
| Picospritzer | Parker Instruments | Picospritzer III | |
| PC with installed MC Stimulus software | Multi Channel Sys-tems, Germany (software) | ||
| 2-channel stimulator | Multi Channel Sys-tems, Germany | STG-1002 | |
| Stimulation isolation unit | A.M.P.I., Israel | Iso-Flex | |
| Micromanipulator | Narishige, Japan | YOU-1 | |
| Vibratome | Leica, Germany | VT1000S |
References
- Waller, A. Experiments on the sections of glossopharyngeal and hypoglossal nerves of the frog and observations of the alterations produced thereby in the structure of their primitive fibers. Philos. Trans. R. Soc. Lond. 140, 423-429 (1850).
- Fink, R. P., Heimer, L. Two methods for selective silver impregnation of degenerating axons and their synaptic endings in the central nervous system. Brain Res. 4, 369-374 (1967).
- Nauta, W. J. Selective silver impregnation of degenerating axons in the central nervous system. Stain Technol. 27, 175-179 (1952).
- Ramón y Cajal, S. Histologie du système nerveux de l'Homme et des vertébrés. , Maloine, Paris. (1911).
- Kristensson, K., Olsson, Y. Uptake and retrograde transport of peroxidase in hypoglossal neurons. Electron microscopical localization in the neuronal perikaryon. Acta Neuropathol. 19, 1-9 (1971).
- Kristensson, K., Olsson, Y. Retrograde axonal transport of protein. Brain Res. 29, 363-365 (1971).
- Burger, R. M., Cramer, K. S., Pfeiffer, J. D., Rubel, E. W. Avian superior olivary nucleus provides divergent inhibitory input to parallel auditory pathways. J. Comp. Neurol. 481, 6-18 (2005).
- Ford, M. C., Grothe, B., Klug, A. Fenestration of the calyx of Held occurs sequentially along the tonotopic axis, is influenced by afferent activity, and facilitates glutamate clearance. J. Comp. Neurol. 514, 92-106 (2009).
- Glover, J. C., Petursdottir, G., Jansen, J. K. S. Fluorescent dextran amines used as axonal tracers in the nervous system of chicken embryo. J. Neurosci. Methods. 18, 243-254 (1986).
- Trojanowski, J. Q., Gonatas, J. O., Gonatas, N. K. Conjugates of horseradish peroxidase (HRP) with cholera toxin and wheat germ agglutinin are superior to free HRP as orthograde transported markers. Brain Res. 223, 381-385 (1981).
- Trojanowski, J. Q., Gonatas, J. O., Steiber, A., Gonatas, N. K. Horseradish peroxsidase (HRP) conjugates of cholera toxin and lectins are more sensitive retrograde transported markers than free HRP. Brain Res. 231, 33-50 (1982).
- Conte, W. L., Kamishina, H., Corvin, J. V., Reep, R. L. Topography in the projections of lateral posterior thalamus with cingulate and medial agranular cortex in relation to circuitry for directed attention and neglect. Brain Res. 1240, 87-95 (2008).
- Conte, W. L., Kamishina, H., Reep, R. L. Multiple neuroanatomical tract-tracing using fluorescent Alexa Fluor conjugates of cholera toxin subunit B in rats. Nat. Protoc. 4, 1157-1166 (2009).
- Haas, K., Jensen, K., Sin, W. C., Foa, L., Cline, H. T. Targeted electroporation in Xenopus tadpoles in vivo- from single cells to the entire brain. Differentiation. 70, 148-154 (2002).
- Zeilhofer, H. U., et al. Glycinergic neurons expressing enhanced green fluorescent protein in bacterial artificial chromosome transgenic mice. J. Comp. Neurol. 482, 123-141 (2005).
- Poyatos, I., Ponce, J., Aragön, C., Giménez, C., Zafra, F. The glycine transporter GLYT2 is a reliable marker for glycine-immunoreactive neurons. Brain. Res. Mol. Brain Res. 49, 63-67 (1997).
- Gong, S., et al. A gene expression atlas of the central nervous system based on bacterial artificial chromosomes. Nature. 425, 917-925 (2003).
- Heintz, N. Bac to the future: the use of BAC transgenic mice for neuroscience research. Nat. Rev. Neurosci. 2, 861-870 (2001).
- Franklin, K. B. J., Paxinos, G. The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , 3rd ed, Elsevier/Academic Press. New York. (2008).
- Kuwajima, T., Sitko, A. A., Bhansali, P., Jurgens, C., Guido, W., Mason, C. ClearT: a detergent- and solvent-free clearing method for neuronal and non-neuronal tissue. Development. 140, 1364-1368 (2013).
- Wouterlood, F. G., Jorritsma-Byham, B. The anterograde neuroanatomical tracer biotinylated dextran amine: comparison with the tracer PHA-L in preparations for electron microscopy. J. Neurosci. Methods. 48, 75-87 (1993).
- Lanciego, J. L., Wouterlood, F. G. A half century of experimental neuroanatomical tracing. J. Chem. Neuroanat. 42, 157-183 (2011).
- Rodriguez-Contreras, A., Silvio, J., van Hoeve, S., Habets, L. P., Locher, H., Borst, J. G. G. Dynamic development of the calyx of Held synapse. PNAS. 105 (14), 5603-5608 (2008).
- Albrecht, O., Dondzillo, A., Mayer, F., Thompson, J. A., Klug, A. Inhibitory projections from the ventral nucleus of the trapezoid body to the medial nucleus of the trapezoid body in the mouse. Front. Neural Circuits. 8, 83 (2014).
- Benson, D. A., Teas, D. C. Single unit of binaural interaction in the auditory cortex of the chinchilla. Brain Res. 103, 313-338 (1976).
- Koka, K., Jones, H. G., Thornton, J. L., Lupo, J. E., Tollin, D. J. Sound pressure transformations by the head and pinnae of the adult Chinchilla (Chinchilla lanigera). Hear Res. 272 (1-2), 135-147 (2011).
- Ryan, A. Hearing sensitivity of the mongolian gerbil, Meriones unguiculatus. J. Acoust. Soc. Am. 59 (5), 1222-1226 (1976).
- Zwicker, E., Fastl, H. Psychoacoustics Facts and Models. , Springer. (1990).
- Chu, G., Hayakawa, H., Berg, P. Electroporation for the efficient transfection of mammalian cells with DNA. Nucleic Acids Res. 15 (3), 1311-1326 (1987).
- Klenchin, V. A., Sukharev, S. I., Serov, S. M., Chernomordik, L. V., Chizmadzhev, Y. A. Electrically induced DNA uptake by cells is a fast process involving DNA electrophoresis. Biophys J. 60 (4), 804-811 (1991).
- Elias, L., Kriegstein, A. Organotypic Slice Culture of E18 Rat Brains. J. Vis. Exp. (6), e235 (2007).
- Gähwiler, B. H. Organotypic monolayer cultures of nervous tissue. J. Neurosci. Methods. 4 (4), 329-342 (1981).
- Tallini, Y. N., et al. BAC transgenic mice express enhanced green fluorescent protein in central and peripheral cholinergic neurons. Physiol Genomics. 27 (3), 391-397 (2006).
