Summary
Descriviamo una tecnica per etichettare i neuroni ei loro processi tramite iniezioni anterograda o traccianti retrogradi in nuclei cerebrali con una preparazione in vitro. Abbiamo modificato un metodo esistente di i n vitro tracciante elettroporazione sfruttando fluorescente mutanti di topo attrezzatura ottica e di base al fine di aumentare la precisione di etichettatura.
Abstract
Presentiamo una tecnica che combina un protocollo in vitro iniezione tracciante, che utilizza una serie di impulsi elettrici, di pressione per aumentare colorante assorbimento attraverso elettroporazione in espianti cerebrali con illuminazione laser mirati e congrui occhialini filtro durante la procedura. La tecnica descritta di elettroporazione in vitro per sé produce relativamente buon controllo visivo rivolti determinate aree del cervello. Attraverso la combinazione con il laser di eccitazione di marcatori genetici fluorescenti e la loro lettura attraverso gli occhiali di filtro a banda passante, che possono raccogliere le emissioni dei geneticamente etichettati cellule / nuclei e il colorante tracciamento fluorescente, un ricercatore può aumentare notevolmente la precisione delle iniezioni trovando l'area di interesse e di controllo per il colorante diffuso / assorbimento nella zona di iniezione molto più efficiente. Inoltre, la tecnica di illuminazione laser consente di studiare la funzionalità di un dato neurocircuit dal provIding informazioni sul tipo di neuroni che proiettano una certa area in casi in cui l'espressione della GFP è legata al tipo di trasmettitore espressa da una sottopopolazione di neuroni.
Introduction
Per definire un certo (micro) circuito neuronale, si deve avviare da trovare vari partecipanti di detto circuito, e il loro modello di connessione. Da quando la pubblicazione di Waller su neurofiber rintracciare attraverso la lesione 1 una grande varietà di tecniche di tracciamento neuroanatomiche è stata stabilita. Alcune di queste tecniche possono essere applicate in tessuto fissato post mortem 2-4, altri si basano sul trasporto attivo del colorante nei neuroni vivi, come scoperto nel 1971 5-6. Quest'ultimo può essere ulteriormente suddiviso in due gruppi discriminano tra metodi sfruttando retrograda attiva (dalla zona iniettata alla sorgente di sporgenze, cioè. Somata di neuroni che sono sporgenti da detta area) e anterograda attiva (dal iniettato zona al target di una data di proiezione, cioè. le proiezioni assonale ei terminali assonale dei neuroni marcati) di trasporto. Inoltre, in alcuni casi di tramateriale cer viene iniettato in animali vivi che poi sopravvivono l'iniezione di diversi giorni o settimane (a iniezioni vivo tracciante), mentre in altri casi cervelli espiantati vengono iniettati e incubare per diverse ore dopo l'iniezione di liquido cerebrospinale artificiale (in vitro iniezioni tracciante) .
In questo protocollo abbiamo modificato uno esistente in vitro tecnica elettroporazione 7-8 per etichettare somata e processi neuronale nel anterograda e tracciamento retrogrado esperimenti usando choleratoxin subunità-b e tetramethylrhodamine destrano le sostanze tracciamento. L'obiettivo generale di questo protocollo è quello di fornire neuroscienziati con uno strumento efficiente per tracciare modelli di connettività tra i diversi nuclei neuronali del cervello, usufruendo di linee disponibili topo transgenico ed apparecchiature ottiche di base al fine di aumentare la precisione di mira durante le iniezioni traccianti. Sebbene il metodo di anterograda e retrograda usando tracingcholeratoxin e ammina destrano e rispettivi coniugati fluorescente non è nuova 9-13 (come è il metodo di elettroporazione, per es. Haas et al. 14), la combinazione di iniezioni traccianti con elettroporazione in una preparazione in vitro coinvolgono blocchi di tessuto cerebrale è uno sviluppo più recente 7. Il principale vantaggio rispetto alle tecniche di tracciatura neuronali utilizzando lo stesso tipo di coloranti traccianti di animali vivi è la maggiore intensità di etichettatura, a causa della maggiore efficienza con cui il colorante elettroporate viene ripreso dai neuroni. Un ulteriore vantaggio è il termine abbreviato di incubazione (necessario per il trasporto di colorante) e la sua maggiore accuratezza bersaglio durante l'iniezione tracciante, perché lo sperimentatore ha il controllo visivo sull'area bersaglio di iniezione. Quest'ultimo significa anche che non costose apparecchiature stereotassica è richiesto per trovare il nucleo o il cervello area di interesse.
Per addizionale aumentare la precisione di mira, abbiamo approfittato di una linea di topi transgenici, che esprime GFP nella sottopopolazione glicinergica di neuroni 15 ed apparecchiature ottiche di base che consistono di un puntatore laser portatile di 405 nm occhiali passa-banda di lunghezze d'onda e la congruenza di filtraggio (450 - 700 nm). Così, abbiamo ottenuto un ulteriore significativo aumento di targeting accuratezza individuando la zona di iniezione attraverso il suo segnale fluorescente e fornendo un modo più fine di controllare per la diffusione di colorante all'interno dell'area di iniezione attraverso l'osservazione dell'interazione tra il segnale GFP indigena e il tracciante fluorescenza. La nostra tecnica permette anche di scoprire la funzionalità di un circuito con la sua connettività identificando neuroni inibitori GFP-positive (o eccitatorio in altre linee di topo), che sono stati riempiti con il tracciante.
In sintesi, abbiamo ulteriormente migliorato un potente strumento per studiare la neuroscientifica connettoma del cervello dei vertebrati e valutare tha diverse caratteristiche neuroanatomiche di un determinato neurocircuit. Utilizzando topi transgenici con apparecchiature ottiche economico e largamente disponibile siamo stati in grado di aumentare significativamente la precisione di mira dei nostri iniezioni. Inoltre, i topi transgenici ha permesso di identificare il tipo di connessioni tracciate, che hanno contribuito scoprire la funzionalità di un microcircuito inibitorio nel tronco cerebrale uditivo.
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Protocol
1. genotipizzazione ottico
1. Optical genotipizzazione del mouse Pups
- Controllare espressione del marcatore fluorescente rispettivo usando un puntatore laser di adeguata lunghezza d'onda di eccitazione (405 nm negli esperimenti qui descritti) e corrispondenti occhiali filtro di blocco alla lunghezza d'onda di eccitazione, ma passando la lunghezza d'onda di emissione (450-700 nm negli esperimenti qui descritti) . Puntare il puntatore laser sul retro della testa o del midollo spinale del cucciolo mouse (vedi Figura 1). Evitare che splende il laser negli occhi e lunga esposizione della pelle alla luce laser.
2. ottica genotipizzazione degli anziani animali
- Profondamente anestetizzare il mouse (di età compresa tra P14 a P138 negli esperimenti qui descritti), con una overdose di pentobarbital attraverso un'iniezione intraperitoneale (120 mg / kg di peso corporeo). Confermare anestesia corretta verificando i riflessi degli animali (brevemente pizzicare la punta di the orecchio o una delle zampe posteriori per suscitare il riflesso retrazione dell'orecchio o della gamba).
- Nota: Nonostante l'uso di una dose eccessiva di pentobarbital (120 mg / kg di peso corporeo) si fa riferimento alla procedura di iniezione come "profonda anestesia" invece di eutanasia, perché l'animale è idealmente ancora vivo (cioè il suo cuore batte ancora), quando la chirurgia e la perfusione cominciano. Questo assicura una più efficiente perfusione degli organi interni compreso il cervello.
- Una volta che l'animale non mostra riflessi, rimuovere con attenzione la pelle sovrastante il cranio (Figura 2A) facendo un'incisione nella pelle che copre la parte posteriore della testa e taglio al tronco del cranio. Esporre il cranio scoperto alla luce laser e osservare la fluorescenza attraverso gli occhiali filtro come descritto sopra. Se un segnale GFP positivo viene osservato, passare al punto 2, se non, sacrifica l'animale attraverso decapitazione (secondo / garantendo forma di eutanasia seguendo il nostroRegolamenti IACUC).
Nota: Nei topi, anche più grandi (> 1 mese) la fluorescenza può essere osservata attraverso gli occhi dell'animale.
2. transcardial Perfusione e Cervello Preparazione
- Profumato transcardiaca con tampone fosfato salino ghiacciata (PBS; NaCl: 137 mm, KCl 2,7 mM, KH 2 PO 4: 1.76 mM, Na 2 HPO 4: 10 mm) con una siringa ago da 30 G per rimuovere gran parte del sangue da l'animale.
- Innanzitutto, aprire con cautela la gabbia toracica con forbici affilate e poi spingere l'ago nel ventricolo sinistro del cuore. Avviare il pompaggio PBS nel cuore e l'aorta e immediatamente dopo questa fase aprire nell'atrio destro del cuore con le forbici per consentire al sangue di uscire dal corpo. Nota: perfusione richiede 5 - 10 min a seconda della taglia dell'animale.
- Dopo dissanguamento mediante perfusione, decapitare il animali, garantire la sua testa con il perno needles (o 30 G aghi delle siringhe) da loro penetrante attraverso le orbite in un piatto preparato e rimuovere il cervello dal cranio.
- Innanzitutto, utilizzare forbici affilate per tagliare la pelle sovrapponendo cranio: fare una piccola incisione nella parte posteriore della testa, poi tagliare lungo la linea mediana sul lato dorsale della testa, tagliati ai lati appena caudalmente degli occhi dell'animale e infine tagliato in direzione caudale rimuovere completamente i lembi di pelle nella parte posteriore della testa.
- Successivamente, ripetere lo stesso schema di taglio per il cranio stesso, assicurarsi di rimuovere due coclee nel processo, perché questo semplifica notevolmente la rimozione del tronco cerebrale alla fine. Dopo questa procedura, la parte caudale del cervello dovrebbe giacciono completamente esposto.
- Nella fase successiva, utilizzare una lama di rasoio affilata o un bisturi per tagliare attraverso tutta proencefalo ad un angolo di circa 45 ° e circa 2 mm rostrale dal cervelletto. Scoop fuori la metà anteriore separata del cervello con abspatola ent.
- Utilizzare la spatola per elevare la parte caudale del cervello alla sua estremità rostrale e successivamente tagliare i nervi cranici che sono ancora collegate al tronco cerebrale sul lato ventrale. Come risultato finale, la parte caudale del cervello incluso il tronco cerebrale deve cadere liberamente fuori il resto della testa di animale preparato.
- Capovolgere la parte caudale rimosso del cervello per esporre il suo lato ventrale e tagliare lungo il piano coronale solo rostrale (per le iniezioni anterograda) o semplicemente caudale (per le iniezioni retrogradi) delle "lampadine" ventrale situati contenenti il corpo trapezoidale (vedere il passaggio 2.3).
- Utilizzare sempre una lama di rasoio affilata o un bisturi per la procedura di taglio per ridurre al minimo la morte cellulare causata da eccessiva sollecitazione meccanica sul tessuto. Come risultato finale, un espianto cervello attraversa circa 1 cm di lunghezza e contenente la completa oliva pontina lungo altre regioni del cervello avrebbe dovuto essere ottenuta.
Nota: Questo protocollo illustra la procedura di iniezione tracciante nel corpo trapezoidale situato nel tronco cerebrale uditivo. Adattare la posizione e l'orientamento dei piani di taglio e siti di iniezione come necessario. Se le regioni cerebrali fluorescenti di interesse si trovano abbastanza vicino alla superficie del cervello, in modo che possano essere identificati e iniettati senza tagliare il cervello (vedere la Figura 2B), allora la fase di taglio coronale può essere omesso.
- Identificare il corpo trapezoidale come due ventrali "lampadine" di spicco che contengono il nucleo ventrale del corpo trapezoidale (VNTB).
Nota: per ulteriori riferimenti anatomici per quanto riguarda la localizzazione stereotassica approssimativa di questi piani di taglio, vedere Franklin & Paxinos, 2008. Panel 78 dell'atlante, Bregma ~ -5.7 mm mostra il nucleo mediale del corpo trapezoidale (= MNTB) etichettato come "Tz ". Panel 69 mostra il nucleo ventrale del bo trapeziody (VNTB) etichettato come "MVPO" (medioventral nucleo periolivary) 19.
3. anterograda / retrograda Tracing
Nota: Eseguire tutte le procedure di seguito a temperatura ambiente (25 ° C).
- Dopo il taglio, posizionare l'espianto tronco cerebrale in un piatto preparato contenente ossigenata (95% O 2, CO 2 5%) dissezione soluzione (NaCl: 125 mm, KCl: 2,5 mm, MgCl 2: 1 mm, CaCl 2: 0,1 mm, il glucosio : 25 mM, NaH 2 PO 4: 1,25 mM, NaHCO 3: 25 mM, acido ascorbico: 0.4 mM, mio-inositolo: 3 mM, acido piruvico: 2 mM), fissandolo con 30 aghi siringa G. Assicurarsi che la zona di iniezione è rivolta verso l'alto.
- Tirare pipette iniezione da vetro borosilicato e riempirli con uno dei seguenti tre soluzioni: a) una soluzione di 1,0 mg / ml di choleratoxin subunità b coniugato ad un fluoroforo Alexa 555 in PBS 12-13 (utilizzato principalmente per il trasporto retrogrado), b ) un -d 1%ilution in soluzione fisiologica 0,9% di destrano tetramethylrhodamine 555 (3.000 MW, utilizzato principalmente per il trasporto retrogrado) oppure c) una diluizione, 1% in soluzione fisiologica 0,9% di 10.000 MW-destrano TRITC 555 (utilizzato principalmente per il trasporto anterogrado).
- Assicurarsi che le resistenze gamma pipetta di iniezione 2,5-3,5 MOhm e che sono fabbricati in 3 - 4 cicli di trazione. Per gli esperimenti qui descritti, ottenere ciò selezionando un algoritmo tirando preprogrammato sul estrattore pipetta.
- Illuminare l'espianto del cervello utilizzando un puntatore laser montato in modo statico della lunghezza d'onda appropriata (punto n ° 2 nella figura 3A; 405 nm di lunghezza d'onda negli esperimenti qui descritti). Utilizzare il puntatore laser come guida per le iniezioni, e puntare il fascio laser verso il nucleo cerebrale fluorescente o cellule di interesse che verrà iniettato.
- Trovare e osservare il fascio luminoso attraverso un microscopio binoculare mentre indossa gli occhiali filtranti compatibili (450 - 700 nm filtro passa banda negli esperimenti qui descritti). Inserire l'elettrodo di iniezione tramite micromanipolatore nella zona di interesse.
- Iniettare la sostanza tracciante. Le iniezioni sono composti da 2 - 10 impulsi di pressione a 15 psi per 50 msec ciascuno, utilizzando un dispositivo di iniezione a pressione, diretto perpendicolarmente nella regione di interesse (ROI) all'interno della sezione cervello. Somministrare ogni impulso di pressione ad intervalli di 10 - 15 secondi per consentire il colorante di diffondersi.
- Nel caso delle iniezioni tetramethylrhodamine (TRITC), inoltre stimolare elettricamente per migliorare l'assorbimento di colorante attraverso elettroporazione con l'elettrodo posto nella zona del cervello di interesse (MNTB e VNTB negli esperimenti qui descritti).
- Utilizzare 8 impulsi TTL di 8 volt per 50 msec con 50 msec inter intervalli, guidati da uno stimolatore e amplificati a 55 V con una unità di isolamento di stimolazione (articoli n ° 7 e 9 nella Figura 3B). Usare 10 - 20 ripetizioni di questo protocollo, amminitrato per diversi minuti 7,8. Assicurati di massa l'elettrodo correttamente - il filo di terra deve essere collegato al soluzione del bagno!
- Controllare successo dell'iniezione. Dal momento che un tracciante fluorescente con una lunghezza d'onda di emissione è più anche emettendo un segnale fluorescente su eccitazione laser con lunghezza d'onda più corte, per controllare visivamente il colorante captazione / diffondersi nella zona di destinazione iniettata mentre illuminando la zona con il laser e osservando attraverso gli occhiali del filtro.
4. Incubazione
- Dopo l'iniezione, incubare le brainstems nel liquido cerebrospinale artificiale ossigenato (ACSF; NaCl: 125 mM, KCl 2,5 mM, MgCl 2 1 mM, CaCl 2: 2 mM, glucosio 25 mM, NaH 2 PO 4: 1.25 mM, NaHCO 3: 25 mM, acido ascorbico: 0.4 mM, myo-inositolo: 3 mM, acido piruvico: 2 mM, bollito con 95% O 2 - 5% 2) a temperatura ambiente CO (RT, 25 ° C) per 1 - 4 ore, mentreil colorante viene trasportato. Bubble soluzione durante l'intero periodo di incubazione.
- Successivamente, trasferire i brainstems in 4% paraformaldeide (PFA) disciolto in PBS (circa 100 ml;. PH 7 per il mix PFA / PBS) e incubate a 4 ° C per consentire post-fissazione overnight (O / N).
5. Tessuto affettare e di montaggio
- Il giorno dopo, lavare il tronco cerebrale per tre volte in PBS (5 minuti per ogni fase di lavaggio), coprire nel 4% agar e poi tagliata a 50 - 80 micron di spessore fette su un vibratomo. Montare le fette con un mezzo di montaggio su un vetrino e coprioggetto.
- Facoltativamente, etichettare le sezioni con Nissl fluorescente per 25 min (per esempio blu Nissl ad una diluizione 1: 100 in AB media).
- Per preparare AB media, mescolare 250 ml di 0,2 M tampone fosfato (PB; 51 KH MM 2 PO 4, 150 mm Na 2 HPO 4), 15 ml di 5 M di NaCl, 15 ml 10% Triton-X, 220 ml DDH 2 O e 5 g albumina di siero bovino.
- Precede e avere successo l'etichettatura Nissl passo da 3 fasi di lavaggio in PBS (10 minuti ciascuno).
Nota: Nei casi in cui devono essere montati e analizzato sezioni più spesse (in esperimenti descritti qui tali fette erano 100 - 500 micron di spessore per mantenere i collegamenti assonale su distanze più grandi), la tecnica può essere combinata con compensazione dei tessuti. Abbiamo trovato il ClearT2 12 per avere successo 20. Quando un passo di compensazione tessuto è incluso, eseguire prima di montare sezioni.
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Representative Results
Figure 1 e 2 mostrano come il puntatore laser e occhiali laser può essere usato al genotipo modo rapido ed economico GFP animali risultati positivi da una cucciolata. In caso di cuccioli di topo, la tecnica può essere utilizzata per identificare in maniera non invasiva etichetta GFP nel cervello dell'animale attraverso il cranio e la pelle sovrastante (Figura 1A - D). Fluorescenza emessa può essere visto attraverso la pelle e il cranio del mouse cuccioli almeno fino al giorno postnatale 3 (Figura 1C). La procedura è illustrata nella Figura 1 per la nostra proteina verde fluorescente (GFP) etichettati linea di topi che esprimono GFP nella sua sottopopolazione glicinergica di neuroni (GlyT2-GFP). Negli animali anziani con crani spessi e pelle pigmentata, l'etichetta GFP mostra meno attraverso la pelle e ossa, e quindi la pelle sulla testa e / o del collo deve essere rimosso prima che la genotipizzazione ottica (Figura 2A).
Dopo la perfusioneanimale il cervello è portato fuori e di nuovo illuminata per trovare i nuclei fluorescente di interesse. Le strutture luminose che illuminano vicino alla superficie ventrale del tronco cerebrale in Figura 2B sono i due nuclei ventrali del corpo trapezoidale, che abbiamo usato sia come guida e un obiettivo per i nostri iniezioni traccianti. Le figure 4 e 5 mostrano risultati rappresentativi di un'iniezione anterograda nel nucleo ventrale del corpo trapezoidale (VNTB) usando tetramethylrhodamine destrano (TRITC;. Figura 4) e due iniezioni retrograda nel nucleo mediale del corpo trapezoidale (MNTB) usando choleratoxin subunità-b (CTB; le Figure 5A e B) e TRITC (Figure 5C e D). Etichettatura assonale luminoso che indica (in questo caso inibitorio) proiezioni da VNTB a MNTB può essere visto dopo una iniezione anterograda in VNTB (Figura 4). Figure 5A e 5C mostrano una panoramica sul sitodi iniezione (MNTB) con il nucleo contenente le cellule retrogrado etichettati (VNTB) accanto ad esso. figure 5B e 5D mostrano ingrandite immagini di retrograda etichettate somata di cellule VNTB glicinergica nelle stesse sezioni come mostrato in Figura 5A e 5C. Si noti come il tracciato retrogrado con CTB si traduce in una più puntata modello 12-13 (Figura 5B), mentre le cellule VNTB retrogrado etichettati con TRITC visualizzare una etichettatura Golgi-come molto denso 21 (Figura 5D).
Figura 1:. Ottica genotipizzazione di GlyT2-GFP-positivi e GlyT2-GFP-negativi topi I topi GFP-positive sono state fotografate sotto (A) normali condizioni di luce, (B) su illuminazione laser con un puntatore laser 405 nm, senza il verde- occhiali filtranti e (C)su illuminazione laser con i laser e UV occhiali di sicurezza. Un segnale forte GFP è visibile nella zona sopra il cervelletto e il tronco encefalico. (D), invece, i cuccioli GlyT2-GFP-negativo della stessa linea di mouse e l'età (p2) non mostrano alcun segno di fluorescenza nelle stesse aree ( posteriore della testa e del midollo spinale). La luce laser blu è efficacemente filtrata dai occhiali.
Figura 2: Ottico genotipizzazione e un cervello Espianto Preparato. Cranio (A) Un p4 GlyT2-GFP il mouse del cucciolo è esposto a illuminazione laser e visto attraverso gli occhiali di filtro passa-banda. La GFP fluorescenti può essere osservata attraverso il cranio. (B) Un espianto cervello dallo stesso cucciolo in un piatto preparato su illuminazione laser, come si è visto attraverso gli occhiali di filtraggio. Assoni glicinergica e nuclei cerebrali, come il nucleo ventrale del corpo trapezoidale (VNTB) possono essere visti come very strutture luminose vicino alla superficie del cervello.
Figura 3: Panoramica Su una in vitro pressione d'iniezione e l'installazione elettroporazione. (A) 1: stereoscopio, 2: puntatore laser montato (405 nm), 3: headstage con la pipetta di iniezione montato su un micromanipolatore, 4: piatto preparato contenente la espianto cervello, 5: un PC con installato il software MC Stimolo, 6: Dispositivo pressione di iniezione, collegata alla pipetta iniezione tramite la tubazione (B). 7: unità stimolo isolamento, 8: illuminatore ad alta intensità, 9: stimolatore. Lo stimolatore è collegato all'elettrodo nella pipetta attraverso l'unità di isolamento stimolazione ed è guidato dal PC.
Figura 4: Tracing anterograda di connessioni inibitorie da VNTB al mediale Nucleo del Corpo trapezio (MNTB). Viene mostrato un proiezione massima di una pila confocale preso in una fetta orizzontale che attraversa circa 200 micron di profondità in un cervello azzerato di un topo p14 GlyT2-GFP. Dopo un'iniezione tetrametilrodamina destrano (TRITC) nella porzione caudo-mediale del VNTB, brillantemente etichettato collegamenti assonale (e in alcuni casi i loro terminazioni terminale) dal VNTB a MNTB può essere osservato. Scala bar: 200 micron.
Figura 5:. Retrogradi Tracer iniezioni nel MNTB Reveal Filled glicinergica Le celle della VNTB visualizzati sono proiezioni massimo di pile confocale prese in fette coronali di un P88 (A, B) e p80 (C, D (che coprono oltre circa 50 micron). ) Mouse GlyT2-GFP. (A) Una panoramica di un choleratoxin subunità-b (CTB) iniezione nella parte mediale del MNTB. (B), le cellule glicinergica nella VNTB sono pieni di CTB (puncta rossa all'interno del somata cella) a seguito dell'iniezione mostrato in Figura 5A. Alcuni dei puncta appaiono all'esterno delle cellule, che potrebbero essere indicativi di altri GFP-negativi (non glicinergica) tipi di cellule del VNTB essere riempito, nonché (a causa delle fibre danneggiate di passaggio nella zona di iniezione, per esempio) . (C) Un altro quadro di una iniezione TRITC retrogrado mira il MNTB. Nota, come un numero di cellule è riempita con TRITC nel MNTB seguente elettroporazione (in contrapposizione alla CTB puramente pressione iniettato in Figura 5A). (D) etichettatura retrograda di cellule VNTB glicinergica dopo un'iniezione TRITC nella MNTB (stessa iniezione come mostrato in Figura 5C). La maggior parte delle cellule visualizzare una etichettatura giallo o arancione denso, a causa della miscela di due segnali fluorescenti (l'espressione GFP indigena e il riempimento con il TRITC rossa). Confronto con una cellula GFP-positive che per qualche motivonon prendere il colorante (freccia blu) e una cellula GFP-negativo tracciante marcato appare profondamente rossa ed eventualmente riempita, infortunio assonale nella zona di iniezione (freccia rossa). Si noti la diversa pattern di colorazione delle cellule somata nelle iniezioni traccianti retrogradi utilizzando CTB (Figura 5B) e TRITC (Figura 5D). Barre di scala: le figure 5A e 5C: 200 micron, figure 5B e 5D: 20 micron.
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Discussion
Una forza generale in vitro tracciante elettroporazione, al contrario di studi in vivo tracciamento, è che dà ricercatori migliore accesso alla zona del cervello di interesse e quindi non comporta stereotassica costose (e spesso elettrofisiologico) attrezzature. Inoltre, il periodo di sopravvivenza richiesto per gli espianti cerebrali estende solo poche ore (1 - 4) invece di giorni o settimane nel caso di vivo iniezioni traccianti in (vedere una recensione dettagliata sull'uso di ammine destrano e altri traccianti in in iniezioni vivo di Lanciego e Wouterlood 2011 22, ma anche Rodriguez-Contreras, et al., 2008 23), in modo che le iniezioni non riusciti possono essere rilevati già nel corso della procedura di iniezione o al più tardi, il giorno successivo, in modo da che i parametri di iniezione possono essere regolati di conseguenza. Il breve periodo di sopravvivenza per espianti cerebrali significa anche che di solito c'è una differenza minore tra i tag <em> efficace (area, in cui il colorante è stato ripreso dai neuroni anterograda o terminali assonali in iniezioni retrograda) e l'apparente (area in cui il colorante versato, senza essere ripreso) sito di iniezione, anche se questa differenza non può mai essere esclusa completamente e può essere quantificato / controllata per la post-hoc, che in alcuni casi può essere completamente impossibile solo (vedi Albrecht et al., 2014 per una discussione più dettagliata 24).
Va sottolineato che le connessioni di praticamente qualsiasi lunghezza possono essere studiati con questo metodo, purché lo sperimentatore è in grado di preservare sia l'area iniettato e la sua origine o di destinazione area di proiezioni assonale in un unico pezzo di tessuto cerebrale. La visualizzazione di tali connessioni può essere raggiunto attraverso uno ricostruzione di pile confocale di immagini acquisite dopo il taglio e il montaggio del cervello (come descritto) o tutto il cervello / tecniche lastra di imaging cerebrale dopo l'esecuzione di tessuto chiaroprotocolli di ING (vedi sezione 5 di questo protocollo per un esempio).
Il principale vantaggio di nostra tecnica di elettroporazione in vitro a guida laser è l'aumento significativo di mira la precisione durante le iniezioni traccianti. Il metodo originale di elettroporazione in vitro si basa sul controllo solo visivo di mira alcuni marcatori topografiche o che li utilizzano come guide approssimativi per la zona di iniezione. Lo stesso vale per la diffusione di colorante nell'area di destinazione: si può osservare il colorante diffusione, ma non è facile controllare la diffusione di colorante in modo più fine. Con la modifica del laser di questo metodo, un ricercatore può facilmente trovare nuclei e le cellule di interesse e osservare la diffusione di colorante nella popolazione nucleo / cellula di interesse attraverso l'interazione degli indigeni fluorescenza geneticamente guidato e la fluorescenza del colorante. Così, un ricercatore guadagna maggiore controllo sulla sua / il suo esperimento tracciamento riducendo al minimo i falsi positivi in antero o retrogradootturazioni, perché cellule / terminali assoni al di fuori del nucleo / area di interesse sono stati riempiti durante l'iniezione, pure. Ovviamente, questo non significa un controllo assoluto sul sito effettiva di iniezione, che, come detto in precedenza, possono differire dal sito apparente. Un avvertimento di questa tecnica è ovviamente la disponibilità di organismi geneticamente modificati. I topi sono ampiamente utilizzati organismo modello genetico negli studi di mammiferi, il che è vero anche per il campo uditivo, ma alcuni modelli di mammiferi potrebbero essere considerati meglio, perché richiamano la audiogramma umano più precisamente. Quindi, altre tecniche possono essere impiegate per etichettare popolazioni neuronali negli animali di tipo selvatico di altre specie più adatte per un certo tipo di campo di ricerca (per esempio gerbilli o cincillà negli studi del sistema uditivo 25-28): ciò potrebbe includere iniezioni virali sfruttando alcuni promotori di targeting solo alcuni comparti della fl cervello e che esprimemarcatori ent in solo un sottoinsieme di cellule cerebrali. Naturalmente, particolare attenzione deve essere presa per assicurare la validità dei costrutti genetici espressi nella giusta sottopopolazione di neuroni, non importa se tali costruzioni sono espressi in modo virale negli animali di tipo selvatico o indigeno in knock-in linee del mouse.
Come sottolineato in precedenza, il vantaggio di mutanti di topo che esprimono proteine fluorescenti in alcune sottopopolazioni di neuroni permette anche per la caratterizzazione funzionale di circuiti cerebrali (nel nostro caso siamo stati in grado di caratterizzare le proiezioni inibitorie da un tronco nucleo uditivo ad un altro 24 per la visualizzazione pura i risultati dei nostri esperimenti tracing). Anche in questo caso, la validità dei costrutti genetici espressi previa conferma prima di qualsiasi interpretazione dei risultati degli esperimenti di tracciamento può avvenire.
Altro punto di forza generale della elettroporazione in vitro è la sua compatibilità con OTHmetodi anatomici er, come ad esempio (immuno) istochimica e di compensazione del cervello. Come dimostrato in precedenza 24, non è influenzato dalla applicazione di tecniche di colorazione aggiuntive come Nissl, o un metodo di compensazione cervello chiamata ClearT2 12 20,24. Lo svantaggio principale che si deve tenere a mente è che la profondità di penetrazione di Nissl e le macchie di anticorpi diminuisce con spessore dei tessuti in aumento, così si deve valutare le opzioni di conservazione processo assonale a fette spesse contro la potenza del segnale di ulteriore (immuno) istochimica colorazione in esperimenti in cui sono necessari entrambi i metodi di etichettatura anatomiche. Naturalmente, un altro fattore da considerare è la separazione di banda di eccitazione / emissione delle diverse etichette fluorescenti, poiché il numero minimo di etichette inizia tre marcatori a questo punto (espressione proteina fluorescente indigena, tracciante e Nissl / etichettatura anticorpo).
Ovviamente, il nostro metodo descritto può essere ampliato ainiezioni di qualsiasi tipo di marcatori fluorescenti (compresi perline quantistica) in espianti cerebrali o anche fettine di cervello di topi transgenici. Poiché la precisione di iniezione dipende sia, una chiara rivelazione del bersaglio (l'osservazione di fluorescenza etichettati nuclei e cellule) e un controllo più fine sopra la caduta del colorante fluorescente, uno solo di questi due fattori dovrebbero essere sufficienti per una maggiore precisione di iniezione, anche quando la altro è assente. Ciò significa che i diversi marcatori non fluorescenti (come costrutti virali o altri vettori di DNA / RNA) possono essere iniettati con maggiore precisione in nuclei cerebrali di interesse, finché i nuclei bersaglio sono chiaramente visibili allo sperimentatore. Quest'ultima applicazione è particolarmente interessante, in quanto non consentono di elettroporazione efficace assorbimento di materiale DNA, nonché 29-30, rendendo il nostro metodo quasi ideale per questo tipo di iniezioni. L'unico inconveniente che deve essere considerato è che i costrutti di DNA richiedono tempo per esprimere e il problema di ti vivoconservazione SSUE si pone. Questo potrebbe essere superato attraverso la definizione di organotipiche cervello culture fetta 31-32 sulla base di fette iniettati di cervello (o blocchi di tessuto cerebrale ri-affettato), che consentono la conservazione tessuto vivo dell'ordine di settimane.
E naturalmente altri mutanti di topo transgenico possono essere utilizzati per studiare la connettività di altri tipi neuronali come neuroni colinergici (ad esempio in videochat-GFP topi 33), rendendo questo metodo uno strumento versatile per studiare la connettività e la funzionalità del cervello (micro) i circuiti.
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Disclosures
Non abbiamo nulla da rivelare.
Acknowledgments
Supportato da NIH / NIDCD R01 DC esperimenti 011582. imaging sono stati effettuati presso l'Università del Colorado Anschutz Medical Campus avanzata Luce Microscopia core supportato in parte dal NIH / NCRR Colorado CTSI Concessione Numero UL1 RR025780 e Disturbi Rocky Mountain Neurlogical Core Center sovvenzione NIH P30NS048154. Dr. Sascha du Lac del Salk Institute ci ha fornito i topi GlyT2-GFP.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | All chemicals are from Sigma-Aldrich, unless noted otherwise. |
| Potassium chloride | P9333 | ||
| Potassium phosphate monobasic | P5655 | ||
| Sodium phosphate di-basic | S907 | ||
| Magnesium chloride | M2670 | ||
| Calcium chloride | C5080 | ||
| Glucose | G7528 | ||
| Sodium bicarbonate | S6297 | ||
| Ascorbic acid | A4544 | ||
| Myo-inositol | I5125 | ||
| Sodium pyruvate | P2256 | ||
| Bovine serum albumine | A2153 | optional, for additional (immuno)histochemistry | |
| Triton-X-100 | X100 | optional, for additional (immuno)histochemistry | |
| Poly(ethylene glycol), 8000 MW | P2139 | optional, for brain clearing | |
| Formamide | Fisher Scientific | F84 | optional, for brain clearing |
| Choleratoxin subunit-b | Molecular Probes | C-34776 (Alexa 555) | |
| Dextrane tetramethyl-rhodamine | Molecular Probes | D-7162 (Alexa 555) | |
| Fluorescent Nissl | Invitrogen | N-21479 (blue) | optional |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | SF93 | |
| Agarose | Invitrogen | 16520 | |
| Fluoromount-G | Southern Biotech | 0100-01 | |
| Pentobarbi-tal | Vortech Pharmaceuticals | Fatal-Plus | |
| Borosilicate glass filaments | Harvard Apparatus | G150F-10 | |
| Pipette puller | Zeitz Instruments, Germany | DMZ Universal Puller | |
| Perfusion setup | Custom-made | ||
| Laser pointer | laserpointerpro.com, Hong Kong | HK-88007294 (405 nm) | |
| Filter/safety goggles | Dragon Lasers, China | LSG09 (band-pass 450-700 nm) | |
| Bionocular microscope | Wild Heerbrugg, Switzerland | Wild M3 | Equipped with high-intensity illuminator (MI-150; Dolan-Jenner Inc.) |
| Picospritzer | Parker Instruments | Picospritzer III | |
| PC with installed MC Stimulus software | Multi Channel Sys-tems, Germany (software) | ||
| 2-channel stimulator | Multi Channel Sys-tems, Germany | STG-1002 | |
| Stimulation isolation unit | A.M.P.I., Israel | Iso-Flex | |
| Micromanipulator | Narishige, Japan | YOU-1 | |
| Vibratome | Leica, Germany | VT1000S |
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