Summary
我々は、in vitroでの調製物を用いて脳核に順行性または逆行性トレーサー注射を介して、神経細胞とそのプロセスを標識する技術が記載されています。我々 は 、nラベリング精度を高めるために、蛍光標識されたマウスの変異体および基本光学機器を利用して、トレーサーエレクトロ体 外 I既存の方法を変更しました。
Abstract
私たちは、処置中に対象となるレーザ照射と一致するフィルターゴーグルと脳の外植片にエレクトロポレーションを介して色素の取り込みを増加させるために、電気的および圧力一連のパルスを使用してin vitroでのトレーサー注入プロトコルを組み合わせた手法を提示します。それ自体でのin vitroエレクトロポレーションの記載された技術は、脳の特定の領域をターゲットするための比較的良好な視覚的なコントロールが得られます。レーザー蛍光遺伝子マーカーの励起とその読み出しバンド通過フィルタゴーグルを通して、遺伝的に標識された細胞/核と蛍光トレース色素の排出量を拾うことができ、研究者は、実質的に注射の精度を向上させることができるとそれを組み合わせることで関心領域を見つけ、はるかに効率的に注入領域における染料拡散/取り込みを制御することによって。また、レーザー照射技術はPROVによって与えneurocircuitの機能を研究することを可能にしますGFP発現は、神経細胞の亜集団によって発現される送信機の種類にリンクされている場合に、特定の領域に突出した神経細胞のタイプに関する情報をiding。
Introduction
特定の神経細胞（マイクロ）回路を定義するためには、言った回路、及びその接続パターンの多様な参加者を見つけることによって開始する必要があります。以来lesioning 1を介して神経解剖学的トレーシング技術の多種多様なトレースneurofiberについてウォーラーの出版物は、確立されています。これらの技術のいくつかは、1971 5-6の発見として、他は、生きたニューロン中の染料の能動輸送に依存して、固定された組織の死後2-4に適用することができます。後者はさらに、（与えられた投影の源 、 すなわちへの注入領域から。地域請求する突出しているニューロンの細胞体）アクティブな逆行性の利点を活かした方法とを区別する2つのグループに細分化することができ、アクティブな順行性（注入からの指定された投影の対象の領域、 すなわち軸索投射および標識された神経細胞の軸索端末）輸送。また、場合によっては、TRACER材料は、他の例では、外植脳が注入されている間、（ 生体内のトレーサー注射で ）数日または数週間の注射を生き残るためには、人工脳脊髄液中に注入した後、数時間インキュベート生きた動物に注入された（in vitroでのトレーサー注射を） 。
このプロトコルでは、我々 は 、in vitroエレクトロポレーション技術7-8に 、既存のトレース物質としてコレラトキシンサブユニット-Bおよびテトラメチルデキストランを使用して、順行と逆行追跡実験で、神経細胞体とプロセスにラベルを付けるように変更。このプロトコルの全体的な目標は、トレーサー注射の間に精度を標的に増加させるために使用可能なトランスジェニックマウス系統と基本光学機器を利用しながら、異なる脳核の間の神経接続のパターンを追跡するための効率的なツールを使用して神経科学を提供することです。順行と逆行トレースを使用する方法が、コレラ毒素およびデキストランアミンおよびそれらのそれぞれの蛍光標識複合体は、（ 例えば 、エレクトロポレーションの方法であるとして。ハースら 14）新しい9-13ではないが、脳組織のブロックを含むin vitroでの準備でエレクトロポレーションとトレーサー注射の組み合わせより最近の開発7です。生きた動物でのトレーサー染料の同じタイプを使用して、神経トレーシング技術上の主な利点があるため、染料がエレクトロニューロンによって取り込まされていると、より高い効率の増加標識強度です。実験者は、注入の対象領域上の視覚的制御を持っているので、追加の利点は、トレーサ注入中（染料の輸送に必要）を短く潜伏期間であり、その増加目標精度。後者はまた、高価な定位装置は、関心の核または脳の領域を見つけるために必要とされないことを意味します。
ADDIへtionally精度をターゲットに増加、我々は、ニューロン15と405 nmの波長と一致するバンドパスフィルタゴーグルのハンドヘルドレーザポインタ（450からなる基本的な光学機器のそのグリシン部分集団でGFPを発現するトランスジェニックマウス系統、利用しました- 700 nm）で。したがって、我々は、蛍光シグナルを介して注入領域を識別することによって精度を標的にし、土着のGFPシグナルとトレーサーとの間の相互作用の観察を通して注入領域内の色素の広がりを制御するための微細な方法を提供することによって、かなりの更なる増加を達成し蛍光。私たちの技術は、トレーサーを充填したもの（他のマウス系統または興奮）GFP陽性抑制性ニューロンを識別することにより、その接続性とともに、回路の機能性を明らかにすることができます。
要約すると、我々はさらに脊椎動物の脳のコネクトームを研究し、Tを評価するための強力な神経科学のツールを強化しました彼与えられたneurocircuitの異なる神経解剖学的特徴。安価で広く入手可能な光学機器と一緒にトランスジェニックマウスを使用することにより、我々は大幅に私たちの注射のターゲットと精度を高めることができました。さらに、トランスジェニックマウスは、聴覚脳幹における阻害マイクロ回路の機能を明らかに役立っている、私たちは、トレース接続の種類を識別することができました。
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Protocol
1.オプティカルジェノタイピング
マウス子犬の1光学ジェノタイピング
- 適切な励起波長のレーザポインタを使用してそれぞれの蛍光マーカーの発現を確認する（ここで説明した実験で405 nm）で励起波長を遮断するフィルタ眼鏡を対応するが、発光波長を通過させる（450 - ここで説明した実験で700 nm）の。ヘッドやマウスの仔の脊髄の背面にレーザーポインターを点（ 図1を参照）。目とレーザー光に対する皮膚の長い露出にレーザーを照射しないでください。
古い動物の2光ジェノタイピング
- 深く腹腔内注射（120ミリグラム/ kg体重）を介して、ペントバルビタールの過剰摂取と（ここで説明した実験ではP138歳P14）は、マウスを麻酔。動物の反射神経をチェックして、適切な麻酔を確認してください（簡単番目の先端をつまみます電子耳や耳や足の後退反射を誘発するための後ろ足の1つ）。
- 注意：動物はまだ理想的に生きているので、ペントバルビタールの過剰摂取の使用にもかかわらず（120ミリグラム/ kg体重）我々は、代わりに安楽死の「深麻酔」と注射手順を参照してください（ すなわち 、その心臓はまだ鼓動している）、時手術と灌流が開始されます。これは、脳を含む内臓のより効率的な灌流を保証します。
- 動物は任意の反射を示していないならば、慎重に頭の後ろをカバーする皮膚の切開を作り、頭蓋骨の中央部に切断することにより頭蓋骨（ 図2A）を覆う皮膚を削除します。レーザー光に覆われていない頭蓋骨を露出させ、上記のようにフィルターゴーグルを通して蛍光を観察します。 GFP陽性シグナルが観察された場合、（第2 /私たちの次の安楽死の形を確保断頭を通じて動物を犠牲にし、いない場合は、ステップ2に進んでくださいIACUC規制）。
注：さらに古いマウスでは（> 1ヶ月）の蛍光は、動物の目を通して観察することができます。
2. Transcardial灌流と脳の準備
- 大部分から血液を除去するために、30gの注射針を使用して、氷冷リン酸緩衝食塩水（10mMの137 mMの、塩化カリウム：2.7ミリモル、KH 2 PO 4：1.76ミリモル、のNa 2 HPO 4のNaCl PBS）で経潅流動物。
- まず、慎重に鋭いハサミで胸郭を開き、心臓の左心室に針を押し込みます。心臓や大動脈にPBSをポンプ起動し、すぐにこのステップが身体を終了し、血液を可能にするために、はさみで心臓の右心房を開き、次の。注：灌流5かかり - 動物のサイズに応じて10分。
- 灌流を介して放血した後、動物を刎ねる、ピンnにその頭を固定eedles（または30のG注射針）準備皿に目のソケットを介してそれらを貫通し、頭蓋骨から脳を削除することもできます。
- ちょうど尾側動物の眼の側面にカットし、頭部の背側の正中線に沿って切断し、頭の後ろに小さな切開を行います。まず、頭蓋骨を重ねる肌を遮断するために、鋭いハサミを使用最後に、完全に頭の後ろの皮膚のフラップを除去するために、尾方向に切断。
- 次に、頭蓋骨自体の同じカッティングパターンを繰り返し、これはかなり最終的に脳幹の除去を簡素化しますので、その過程で両方の蝸牛を取り外してください。この手順の後、脳の尾半分が完全に露出あるべきです。
- 次のステップでは、小脳から約45°〜約2mmの吻側の角度で全前脳を切断するために鋭利なカミソリの刃またはメスを使用しています。 ABと脳の分離前半をかき出しますENTへら。
- その吻側端に脳の尾半分を高め、その後、まだ腹側脳幹に接続されている脳神経を切断するために、スパチュラを使用します。最終結果として、脳幹を含む脳の尾の半分は、準備された動物の頭の残りの部分から自由落下する必要があります。
- （ステップを参照してくださいその腹側を露出するために、脳の除去された尾の半分を反転し、台形体を含む腹側に位置する「電球」の（逆行注射用）ちょうど吻側（順行注射用）またはちょうど尾側前頭面に沿って切断2.3）。
- 常に組織に過度の機械的ストレスによる細胞死を最小限にするために切断手順のために鋭利なカミソリの刃またはメスを使用しています。最終結果として、長さが約1cmにまたがるし、他の脳領域に沿って完全な上オリーブ複合体を含む脳の外植が得られているはずです。
注：このプロトコルは、聴性脳幹に位置台形本体内にトレーサーを注入するための手順を示しています。必要に応じて、切断面と注射部位の位置と向きを調整します。それらが同定され、脳を切断せずに注入することができるように、脳表面に十分に近い関心嘘の蛍光脳領域（ 図2Bを参照）場合、冠状切断工程を省略することができます。
- 台形体（VNTB）の腹側核を含む二腹目立つ「球根」と台形体を識別します。
注：これらの切断面のおおよその定位位置に関する更なる解剖学的参考のため、フランクリン＆Paxinos、2008年アトラスのパネル78、ブレグマ〜-5.7 mmは台形体（= MNTB）の内側核を示しているを参照してくださいTzを」と表示"。パネル69は、台形BOの腹側核を示しています「MVPO」（medioventral periolivary核）19としてラベルDY（VNTB）。
3.順行/逆行トレース
注：RT（25℃）で、次のすべての手順を実行します。
- 125 mMの、のKCl：2.5mMの、のMgCl 2を1mM、のCaCl 2：0.1mMのグルコース切断した後、酸素（95％O 2、5％CO 2）解剖溶液（NaClを含む製剤皿に脳幹の外植片を配置：25mMの、のNaH 2 PO 4：1.25ミリモル、のNaHCO 3、25mMのアスコルビン酸：0.4 mMの、ミオイノシトール：3mMの、ピルビン酸：2mm）を、30gの注射針とそれを固定します。注射の面積が上を向いていることを確認します。
- ホウケイ酸ガラスから注入ピペットを引き、次の三つの解決策の一つでそれらを埋める：コレラトキシンサブユニットB PBS 12-13でアレクサフルオロフォア555に共役（主に逆行性輸送に使用される）、BのA）1.0 mg / mlのソリューション）1％-d万MWのデキストランTRITC 555の0.9％生理食塩水でのデキストラン（主に逆行性輸送に使用される3000メガワット）テトラメチルローダミン555またはc）1％-dilutionの0.9％生理食塩水でilution（主に）順行輸送に使用されます。
- 4引っ張っサイクル - その注入ピペットの抵抗が2.5から3.5オームの範囲であり、それらが3で製造されていることを確認してください。ここに記載される実験のために、予めプログラムされたピペットプラー上でアルゴリズムを引っ張るを選択することによって、これを達成します。
- 適切な波長（;ここで説明した実験では、波長405nm、図3Aの項目番号2）の静的に取り付けられたレーザーポインタを使用して、脳の外植片を照らします。注射のためのガイドとしてのレーザーポインタを使用し、注入される蛍光標識された脳核または目的の細胞にレーザー光を目指しています。
- 70 - 互換性のあるフィルターゴーグル（450を装着したまま検索し、双眼顕微鏡を通して照射ターゲット領域を観察ここに記載した実験において0nmのバンドパスフィルタ）。関心領域にマイクロマニピュレーターを経由して注入電極を挿入します。
- トレーサー物質を注入します。脳切片内の関心領域（ROI）内に垂直に向け圧力噴射装置を用いて、50ミリ秒ごとに、15 psiで10圧力パルス - 注射は2から成ります。拡散する染料を可能にするために15秒 - 10の間隔で各圧力パルスを管理します。
- テトラメチルローダミン（TRITC）注射剤の場合には、付加的に（ここで記載した実験でMNTBとVNTB）関心のある脳領域に配置された電極をエレクトロポレーションを介して色素の取り込みを増強するために、電気的に刺激します。
- 50ミリ秒パルス間の間隔で50ミリ秒、刺激によって駆動され、刺激分離ユニット（項目7号及び図3Bの 9）で55 Vに増幅するために8ボルトの8 TTLパルスを使用してください。このプロトコルの20回繰り返し、adminis - 10を使用してください数分7,8を介して結。適切に電極を接地していることを確認します - アース線は、浴溶液に接続する必要があります！
- 注射の成功のために確認してください。以来長い発光波長を有する蛍光トレーサーはまた、レーザーで領域を照射し、フィルターゴーグルを通して見ながら視覚的に注入された目標領域に色素取り込み/スプレッドをチェックし、より短い波長のレーザー励起により蛍光シグナルを発しています。
4.インキュベーション
- 125 mMの、塩化カリウム：2.5 mMの、のMgCl 2：1 mMの、のCaCl 2：2 mMのグルコース：25mMの、のNaH 2 PO 4：1.25 mMの、塩化ナトリウム;注入後、酸素化人工脳脊髄液（ACSFでbrainstemsをインキュベートNaHCO 3、25mMのアスコルビン酸：0.4 mMの、ミオイノシトール：3mMの、ピルビン酸：2mMの、95％のO 2を通気-室温で5％のCO 2）1（RT、25℃） - 4時間、しばらく色素が輸送されています。バブル全体の潜伏期間中にソリューションを提供します。
- 一晩（O / N）の後固定を可能にするために4℃でそれをし、インキュベートする;（PFA / PBS混合物のためにpH7の約100ml）で、続いて、PBSに溶解した4％パラホルムアルデヒド（PFA）でbrainstemsを転送します。
5.組織スライスと取り付け
- 次の日、PBSで3回（各洗浄工程のために5分に）脳幹を洗って、4％の寒天でそれをカバーして、50にカット - ビブラトーム上の80μmの厚さにスライス。ガラススライド、及びカバーガラスの取り付けメディアを使用してマウントスライス。
- 必要に応じて、（：AB培地で100倍希釈で例えば青ニッスル）25分間蛍光ニッスルを持つセクションにラベルを付けます。
- 、AB培地を調製0.2 Mリン酸緩衝液250mlを混合する（PB; 51 mMのKH 2 PO 4、150mMののNa 2 HPO 4）、15 mlの5 M NaClを、15 mlの10％のTriton-X、220ミリリットルのddH 2 Oそして5gのウシ血清アルブミン。
- PrecePBS中で3回の洗浄工程（10分毎）によるニッスル標識工程をデ、成功。
注意：厚いセクションをマウントして分析する必要がある場合には（そのようなスライスここで説明した実験で100だった - より大きな距離での軸索の接続を維持するために、厚さ500ミクロン）、技術が組織のクリアと組み合わせることができます。我々はClearT2 12が成功した20であることが判明します。組織のクリアステップが含まれている場合には、セクションをマウントする前にそれを行います。
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Representative Results
レーザーポインターとレーザーゴーグルは、迅速かつ安価にリターからのGFP陽性動物の遺伝子型を決定するために使用することができるか1および図2は図 。若いマウスの仔の例では、技術は、非侵襲的に頭蓋骨とその上の皮膚（ - D図1A）を介して動物の脳におけるGFPのラベルを識別するために使用することができます。放射された蛍光は、少なくともアップ生後3日目（ 図1C）に皮膚と仔マウスの頭蓋骨を通して見ることができます。手順は、私たちの緑色蛍光タンパク質（GFP） については、図1に示されているニューロン（GLYT2-GFP）のそのグリシン部分集団でGFPを発現するマウス系統をラベル。厚い頭蓋骨と色素沈着した皮膚の高齢動物では、GFPラベルは皮膚や骨を通してあまりよく示しているため、頭部および/ または首の皮膚は、光学ジェノタイピング（ 図2A）の前に除去する必要があります。
灌流後動物の脳を取り出して、目的の蛍光標識された核を見つけるために再び照射されます。 図2Bに近い脳幹の腹面に点灯明るい構造は私たちが私たちのガイドとトレーサー注射用ターゲットの両方として使用される台形体の2腹側核である。 図4、図5は、の代表的な結果を示していますテトラメチルデキストラン使って台形体（VNTB）の腹側核への順行性注入（TRITC;図4）と2つの逆行注射台形体（MNTB）の内側核へのコレラトキシンのサブユニットB（CTBを使用して、 図5AおよびB）とTRITC（ 図5CおよびD）。 （この場合の抑制）に示す明るい軸索ラベリングVNTBからMNTBの突起がVNTBへの順行性注入（ 図4）は、次のを見ることができる。 図5Aおよび5Cサイト以上の概要を示しますその隣に逆行性標識細胞（VNTB）を含む核を有する（MNTB）注射の。 図5（b）と同じセクションのグリシンVNTB細胞の逆行性標識された細胞体の5Dショー拡大像図5Aおよび5Cに表示されます。逆行TRITCで標識VNTB細胞は非常に高密度のゴルジのようなラベル21（ 図5D）を表示に対し、より多くの点状パターン12-13（ 図5B）でCTBの結果とどのように逆行トレースを注意してください。
図1：GLYT2-GFP陽性とGLYT2-GFP陰性マウスの光学ジェノタイピング GFP陽性マウスは緑なしで405 nmのレーザーポインターとレーザー照射時に（A）通常の照明条件、（B）の下で写真撮影しました。フィルタリングゴーグルおよび（C）レーザーとUV安全ゴーグルとレーザー照射時に。強いGFPシグナルは、小脳や脳幹の上の領域に表示されています。（D）対照的に、同じマウスのラインと年齢（P2）からGLYT2-GFP陰性の仔は、（同じ地域に蛍光の兆候を示さありません後頭部および脊髄の）。青色レーザ光を効果的にゴーグルによってフィルタリングされます。
図2：光学ジェノタイピングと準備脳外植片。 （A）A P4 GLYT2-GFPマウスの仔の頭蓋骨は、レーザー照射に曝され、バンドパスフィルタゴーグルを通して見られます。 GFP蛍光は、頭蓋骨を通して観察することができる。（B）は、脳の外植片を、同じ仔からのレーザ照射時の準備皿に、フィルタリングゴーグルを通して見ました。このような台形体（VNTB）の腹側核としてグリシン軸索及び脳核は、版として見ることができます脳表面に近いY明るい構造。
図3： インビトロ圧力注入とエレクトロポレーションの設定以上の概要。 （A）1：ステレオスコープ、2：取り付けられたレーザーポインター（波長405nm）、3：インジェクションピペットでヘッドステージは、マイクロマニピュレータに搭載され、4：脳の外植片を含有する製剤皿、5：インストールMC刺激ソフトウェアを搭載したPC、6：チューブを介して注入ピペットに接続された圧力噴射装置、（B）7：刺激単離ユニット、8：高輝度照明装置、9：刺激。刺激は、刺激分離部を介してピペットで電極に接続され、PCによって駆動されます。
図4：台形体の内側核にVNTBから抑制接続の順行トレース（MNTB）。P14のGLYT2-GFPマウスのクリア脳に深さ約200ミクロンに及ぶ水平スライスで撮影共焦点スタックの最大投影が示されています。 VNTBのcaudo、中間部分にテトラメチルデキストラン（TRITC）注入後、明るく軸索接続をラベル（および場合によってはそのターミナル語尾に）MNTBにVNTBから観察することができます。スケールバー：200μmです。
図5：逆行性トレーサー注射MNTBにVNTB内に充填されたグリシンの細胞を明らかに示される最大突起部（約50ミクロンを超える及ぶ。）されているP88（A、B）とP80（C、Dの冠状切片で撮影した共焦点スタックの。 ）GLYT2-GFPマウス。（A）MNTBの中間部分にコレラトキシンサブユニットB（CTB）注射の概要。（B）VNTBにおけるグリシンの細胞は、CTで満たされています図5（a）に示す注入の結果、B（細胞細胞体の中の赤い斑点）。涙点のいくつかは、（例えば、注射のための領域内の通路の損傷した繊維）、ならびに、充填さVNTBの他のGFP陰性（非グリシン）細胞型の指標とすることができる細胞の外側に現れます（C）MNTBを標的逆行TRITC注入の別の概要。注、細胞の数は、（ 図5Aに純粋に圧力注入CTBとは対照的に）、エレクトロポレーション、次 のMNTBにTRITCで満たされているか。（D）MNTBでTRITC注入後グリシンVNTB細胞の逆行性ラベリング（同じ注射）、図5（c）に示すように 。細胞のほとんどがあるため二つの蛍光シグナル（先住民GFP発現と赤TRITCの充填）の混合物で、緻密な黄色やオレンジ色のラベルを表示します。 GFP陽性細胞と比較して、そのいくつかの理由のために色素（青矢印）と深く赤とおそらく注射（赤矢印）の領域に軸索損傷の充填登場トレーサー標識GFP陰性細胞を取りませんでした。 CTB（ 図5B）およびTRITC（ 図5D）を使用して、逆行性トレーサー注射で細胞細胞体の異なる染色パターンに注意してください。スケールバー： 図5Aおよび5C：200μmのは、5B及び5Dを図 ：20ミクロン。
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Discussion
、in vivoでのトレースの研究とは対照的に、in vitroでのトレーサーエレクトロポレーションの一般的な強さは、高価な定位（多くの場合、電気生理学）装置を必要としない、それは研究者に、したがって関心との脳領域へのより良いアクセスを与えることです。デキストランアミンとの他のトレーサーの使用に関する詳細なレビューを参照してください（in vivoでのトレーサー注射剤の場合には代わりの数日あるいは数週間-また、脳の外植片に必要な生存期間はわずか数時間（4 1）をまたがりますLanciegoとWouterlood、2011年22だけでなく、ロドリゲス・コントレラス、 ら 、2008 23） による生体注射で非常に 、失敗した注射は、早ければ注入処置中などを検出することができるように、または次の日に、遅くとも注入パラメータは、それに応じて調整することができます。脳の外植片のための短い生存期間はまた、間に小さい差が通常存在することを意味します<em>の実効（染料が順行のニューロンまたは逆行注射における軸索の端末によって取り込まれたエリア）と注射部位を見かけ （色素が取り込まれずに、こぼれたエリア）、この差は除外することはできませんが、完全にのみ（より詳細な説明24アルブレヒトら 、2014を参照のこと）事後、いくつかの場合には完全に不可能であることができるため、制御/定量することができます。
これは事実上の接続が任意の長さがあれば、実験者は、脳組織の単一片における軸索突起の注入領域とそのターゲットまたはソース領域の両方を維持することが可能であるように、この方法を用いて研究することができること、を指摘しておくべきです。このような接続の視覚化は、明確な組織を実行した後（ここで説明したように）スライス、脳を実装した後、取得した共焦点画像スタックまたは全脳/スラブ脳画像化技術のいずれかの再構成によって達成することができるプロトコル（例えば、このプロトコルでは第5節参照）。
レーザー誘導体外エレクトロポレーションでの私たちの技術の主な利点は、トレーサー注射の際に精度をターゲットの大幅な増加です。 in vitroでのエレクトロポレーションの元のメソッドは、特定の地形マーカーをターゲットまたは注射の領域のおおよそのガイドとしてそれらを使用することにより、単に視覚的な制御に依存しています。同じことが、目標領域における染料拡散についても同様である：一つは、拡散性色素を観察することができ、それは、より微細な方法で染料の広がりを制御することは容易ではありません。この方法のレーザー修正では、研究者が簡単に関心の核と細胞を見つけることができますし、先住民族の遺伝的に駆動し、蛍光色素の蛍光の相互作用を介して、目的の核/細胞集団中の色素の広がりを観察します。このように、前部のか逆行で偽陽性を最小化することによって、彼/彼女の追跡実験を超える研究者の利益より多くの制御フィリング、関心の核/領域の外側の細胞/軸索の端末だけでなく、注射、中に充填したため。明らかに、これは前述したように、注射の効果的なサイト、以上の絶対的な制御を意 味するものではありません、 明らかサイトと異なる場合があります。この手法の注意点は明らかに遺伝的に改変された生物が利用可能です。マウスは、聴覚分野についても同様であるが、彼らはより正確に人間の聴力図に似ているため、いくつかの哺乳動物モデルは、より良いと考えられる哺乳類の研究で広く使用されている遺伝的モデル生物です。このように、他の技術は、研究分野（聴覚系25-28の研究における例えばスナネズミまたはチンチラ）特定のタイプに適し、他の種の野生動物におけるニューロン集団を標識するために使用することができる：これはを利用してウイルス注射を含めることができます特定のプロモーター脳の唯一の特定の区画を標的としfluorescを表現脳細胞のサブセットのみにおいてENTマーカー。当然のことながら、特別な注意は、ニューロンの右側の部分集団で表現遺伝子構築物の有効性、そのような構築物は、野生型動物でウイルス発現または国産でノックインマウス系統されているかどうかに関係なく確実にするために注意が必要です。
先に指摘したように、神経細胞の特定の亜集団内の蛍光タンパク質を発現するマウス変異体の利点は、脳回路の機能解析を可能にします（私たちのケースでは、純粋な視覚化によって別の24に1聴性脳幹核からの抑制の突起を特徴付けることができました我々の追跡実験の結果）。追跡実験の結果のいずれかの解釈が行われることができる前に再度、発現遺伝子構築物の妥当性を確認する必要があります。
in vitroでのエレクトロポレーションの別の一般的な強さはOTHとの互換性ありそのような（免疫）組織化学および脳のクリアなどER解剖学的方法、。先に24実証されるように、そのようなニッスルなどの追加の染色技術の適用、またはClearT2 12 20,24と呼ばれる脳の決済方法によって影響されません。一つは心に留めておく必要があることを主な欠点は1つが追加（免疫）の信号強度対厚いスライスに軸索プロセス保存の選択肢を比較検討する必要があるので、ニッスルおよび抗体汚れの侵入深さは、増加組織の厚さを減少させるということです組織化学両方の解剖学的標識方法が必要とされる実験で染色します。ラベルの最小数は、この時点（土着の蛍光タンパク質の発現、トレーサー及びニッスル/抗体標識）での3つのマーカーで開始するので、もちろん、考慮すべき別の要因は、異なる蛍光標識の励起/発光帯域幅の分離です。
明らかに、私たちの記載方法がに拡張することができます脳の外植片またはトランスジェニックマウスの脳であってもスライスに（量子ビーズを含む）蛍光マーカーの任意の種類の注射。注入精度は両方に依存するので、明確な標的の検出（蛍光標識された核及び細胞の観察）及び蛍光染料の流出をより細かく制御は、これらの二つの要因の一つは、増加した注入精度が十分でなければならない場合であっても他は存在しません。これは、（ウイルス構築物または他のDNA / RNAベクターのような）別の非蛍光マーカーがあれば、ターゲット核実験者にはっきりと見えるように、関心対象の脳核に高い精度で注入することができることを意味します。エレクトロポレーションは、注射のこのタイプの私たちの方法は、ほぼ理想的、効果的なDNA物質の取り込みだけでなく29-30を可能にしているため、この後者の適用は、特に興味深いものです。考慮される必要がある唯一の欠点は、DNA構築物が、ライブTIの問題を表現するために時間がかかるということですssue保存が生じます。これは、数週間のオーダーの生きている組織の保存を可能にする注入脳スライス（または再スライス脳組織ブロック）に基づいて、器官型脳切片培養物31-32を確立することによって克服することができます。
そしてもちろん、他のトランスジェニックマウスの変異体は、この方法を脳（マイクロ）の回路の接続性と機能性を研究するための多彩なツールを作る、（チャット-GFPマウス33で例えば ）コリン作動性ニューロンのような他の神経細胞の種類の接続性を調査するために使用することができます。
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Disclosures
我々は、開示することは何もありません。
Acknowledgments
NIH / NIDCD R01 DCでサポートされている011582.イメージング実験は大学で行ったのコロラドアンシュッツメディカルキャンパス高度な光学顕微鏡コアはNIH / NCRRコロラドCTSIグラント番号UL1 RR025780とロッキーマウンテンNeurlogical障害コアセンター助成NIH P30NS048154によって部分的にサポートされています。ソーク研究所から博士サシャ・デュ・ラックはGLYT2-GFPマウスを提供してくれました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | All chemicals are from Sigma-Aldrich, unless noted otherwise. |
| Potassium chloride | P9333 | ||
| Potassium phosphate monobasic | P5655 | ||
| Sodium phosphate di-basic | S907 | ||
| Magnesium chloride | M2670 | ||
| Calcium chloride | C5080 | ||
| Glucose | G7528 | ||
| Sodium bicarbonate | S6297 | ||
| Ascorbic acid | A4544 | ||
| Myo-inositol | I5125 | ||
| Sodium pyruvate | P2256 | ||
| Bovine serum albumine | A2153 | optional, for additional (immuno)histochemistry | |
| Triton-X-100 | X100 | optional, for additional (immuno)histochemistry | |
| Poly(ethylene glycol), 8000 MW | P2139 | optional, for brain clearing | |
| Formamide | Fisher Scientific | F84 | optional, for brain clearing |
| Choleratoxin subunit-b | Molecular Probes | C-34776 (Alexa 555) | |
| Dextrane tetramethyl-rhodamine | Molecular Probes | D-7162 (Alexa 555) | |
| Fluorescent Nissl | Invitrogen | N-21479 (blue) | optional |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | SF93 | |
| Agarose | Invitrogen | 16520 | |
| Fluoromount-G | Southern Biotech | 0100-01 | |
| Pentobarbi-tal | Vortech Pharmaceuticals | Fatal-Plus | |
| Borosilicate glass filaments | Harvard Apparatus | G150F-10 | |
| Pipette puller | Zeitz Instruments, Germany | DMZ Universal Puller | |
| Perfusion setup | Custom-made | ||
| Laser pointer | laserpointerpro.com, Hong Kong | HK-88007294 (405 nm) | |
| Filter/safety goggles | Dragon Lasers, China | LSG09 (band-pass 450-700 nm) | |
| Bionocular microscope | Wild Heerbrugg, Switzerland | Wild M3 | Equipped with high-intensity illuminator (MI-150; Dolan-Jenner Inc.) |
| Picospritzer | Parker Instruments | Picospritzer III | |
| PC with installed MC Stimulus software | Multi Channel Sys-tems, Germany (software) | ||
| 2-channel stimulator | Multi Channel Sys-tems, Germany | STG-1002 | |
| Stimulation isolation unit | A.M.P.I., Israel | Iso-Flex | |
| Micromanipulator | Narishige, Japan | YOU-1 | |
| Vibratome | Leica, Germany | VT1000S |
References
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