Summary
우리는 체외 준비를 사용하여 뇌의 핵에 선행 성 또는 역행 추적 주사를 통해 신경 세포와 그 프로세스 레이블을하는 기술에 대해 설명합니다. 우리는 내가 N 표시 정확도를 높이기 위해 유리의 형광 표지 된 마우스 돌연변이 및 기본 광학 기기를 복용하여 추적 전기를 체외의 기존 방법을 수정했습니다.
Abstract
우리는 과정 중에 타겟 레이저 조명 및 매칭 필터 고글 뇌 절편에서 전기 천공을 통하여 염료 흡수를 증가시키기 위해 전기적 및 압력 펄스의 시리즈를 사용하여 시험 관내 트레이서 주입 프로토콜을 결합하는 기술을 제시한다. 그 자체로 체외 전기의 기술 기술은 뇌의 특정 지역을 타겟팅에 대한 상대적으로 좋은 시각 제어를 얻을 수 있습니다. 레이저 형광 유전자 마커의 자극과 판독 대역 통과 필터 고글을 통해, 유전자 표지 세포 / 핵 및 형광 추적 염료의 배출을 선택할 수있는 연구자가 실질적으로 주사의 정확도를 높일 수 있습니다과 결합하여 관심 영역을 발견하고 더욱 효율적으로 주입 영역에서 염료 확산 / 흡수를 위해 제어함으로써. 또한, 레이저 조사에 의한 방법은 잠 neurocircuit 소정의 기능을 연구 할 수 있도록GFP 발현이 신경 세포의 개체군에 의해 표현 송신기의 유형에 연결된 경우에 소정 영역에 돌출 뉴런의 유형에 대한 정보를 iding.
Introduction
특정 신경 (마이크로) 회로를 정의하기 위해, 상기 하나의 회로는, 자신의 접속 패턴의 다양한 참여자를 발견함으로써 시작한다. 이제까지의 lesioning 1을 통해 신경 해부학 추적 기술의 큰 다양성을 추적 neurofiber에 대한 월러의 게시가 설립되었습니다입니다. 1,971 5-6 발견으로 이들 기술 중 일부는 고정 된 조직 사후 2-4에 적용 할 수있는, 다른 라이브 뉴런 염료의 활성 전송에 의존한다. 후자는 또한 (주어진 돌기의 근원, 즉에 주입 영역으로부터. 면적 상기 돌출되는 뉴런 인 somata) 활성 역행 활용 방법을 구별 두 그룹으로 분할 될 수 있고, 활성 선행 성 (주입로를 주어진 투사의 대상, 즉. 축삭 돌기 및 레이블 뉴런) 수송의 축삭 터미널 지역. 또한, 어떤 경우에는 TRACER 재료는 다음 다른 경우에는 외식 뇌가 주입하는 동안, (생체 내 추적 주사에) 몇 일 또는 몇 주에 의해 주입을 생존과 인공 뇌척수액에 주입 후 몇 시간 동안 품어 살아있는 동물에 주입 (체외 추적 주사) .
이 프로토콜에서 우리는 생체 전기 기술 7-8에서 기존의 추적 물질로 choleratoxin 서브 유닛-B 및 테트라 메틸 덱스 트란을 이용하여 선행 성 및 역행 추적 실험에서 신경 세포 인 somata과 프로세스 레이블을 수정했습니다. 이 프로토콜의 전반적인 목적은 탐침 주사 중에 타겟팅 정확성을 향상시키기 위해 사용할 트랜스 제닉 마우스 선 및 기본적인 광학 기기를 이용하면서, 다른 뇌 핵 사이의 연결의 연결 패턴을 추적하는 효율적인 도구 신경 과학자를 제공하는 것이다. 선행 성 및 역 행성 추적의 방법을 사용하여 비록choleratoxin 및 덱스 트란 아민과 각각의 형광 표지 된 접합체는 9-13 새로운 것이 아니다 (예. 하스 등 전기의 방법 때문이다. 14), 뇌 조직의 블록을 포함하는 체외 준비에 전기와 추적 주사의 조합 보다 최근의 개발 7이다. 살아있는 동물에 추적 염료의 동일 유형을 사용하여 신경 세포의 추적 기술을 통해 그 주요 장점 때문에 일렉트로 염료 뉴런에 의해 흡수되고있는 더 높은 효율, 증가 된 표지의 강도이다. 실험자 주입 대상 영역 위에 시각적 컨트롤을 가지고 있기 때문에 추가적인 장점은, 트레이서 주입시 (염료 전송 요구)을 단축 잠복기 및 증가 된 정확성을 대상이다. 후자는 또한 고가의 장비가 정위 관심 핵 또는 뇌 영역을 찾기 위해 필요하지 않다는 것을 의미한다.
ADDI으로레이 터는 우리는 405 nm의 파장과 일치하는 대역 통과 필터링 고글 휴대용 레이저 포인터 (450 이루어진 뉴런 (15)와 기본적인 광학 기기의 그 글라이신 개체군에서 GFP를 발현하는 트랜스 제닉 마우스 라인 이용했고, 정확도를 목표로 증가 - 700 ㎚). 따라서, 우리는 형광 신호를 통해 주입 영역을 식별함으로써 정확도를 타겟팅 및 토착 GFP 신호와 탐침 사이의 상호 작용의 관찰을 통해 주입 지역 내의 염료 확산을위한 제어 미세한 방법을 제공하여 상당한 추가적인 증가를 달성 형광. 우리의 기술은 추적 가득 차 있었다 (다른 마우스 라인 또는 흥분성)의 GFP 양성 억제 신경 세포를 식별하여 연결과 함께 회로의 기능을 발견 할 수 있습니다.
요약하면, 우리는 또한 척추 동물의 뇌의 커 넥톰을 공부하고 T를 평가하기 위해 강력한 신경 과학적 도구를 강화그는 주어진 neurocircuit의 다른 신경 해부학 적 특징. 저렴하고 널리 사용되는 광학 장비와 함께 형질 전환 마우스를 사용하여 우리는 크게 우리의 주사의 대상으로 정확도를 높일 수 있었다. 또한, 트랜스 제닉 마우스는 청각 뇌간에서 억제 저항기의 기능을 밝혀 도움 추적 접속의 타입을 식별하라고시켰다.
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Protocol
1. 광학 유전자형
마우스 새끼 1. 광학 유전자형
- 적합한 여기 파장의 레이저 포인터를 이용하여 각각의 형광 마커의 발현을 검사 (여기 기재된 실험에서 405 ㎚) 및 여기 파장을 차단하는 필터 고글 대응하지만, 발광 파장을 전달 (450 - 여기에 설명 된 실험에서 700 ㎚) . 헤드 또는 마우스 새끼의 척수의 뒤에 레이저 포인터를 가리 키 (도 1 참조). 눈과 레이저 빛에 피부의 긴 노출에 레이저를 빛나는하지 마십시오.
이전 동물 2. 광학 유전자형
- 깊이 복강 내 주사 (120 ㎎ / ㎏ 체중)을 통해 펜 토바 비탈의 과다 복용으로 (여기에 설명 된 실험에서 P138에 세 P14) 마우스를 마취. 동물의 반사 신경을 확인하여 적절한 마취를 확인 (잠시 일의 끝을 꼬집어전자 귀 또는 뒷다리 중 하나는 귀 또는 다리)의 수축 반사를 유도합니다.
- 참고 : 동물이 여전히 이상적으로 (즉, 그 중심은 여전히 박동) 살아 있기 때문에 펜 토바 비탈 (120 ㎎ / ㎏ 체중)의 과다 복용의 사용에도 불구하고 우리는 대신 안락사의 "깊은 마취"로 주입 절차를 참조 할 때 수술 및 관류이 시작됩니다. 이것은 뇌를 포함한 내부 장기의보다 효율적인 관류을 보장한다.
- 동물 모든 반사 작용을 보여주지 않는다 일단 신중 머리 뒤쪽을 덮는 피부 절개를 만들고 두개골의 중앙부를 절단하여 두개골 (도 2a)를 덮는 피부를 제거한다. 레이저 광에 폭로 두개골을 노출시켜 전술 한 바와 같이 필터 고글 통해 형광을 관찰한다. GFP 양성 신호가 관찰되는 경우, 다음의 형태를 안락사 보장 / 잘린 통해 동물을 희생하지 않으면 초 (2 단계로 진행 우리IACUC 규정).
참고 : 형광이 동물의 눈을 통해 관찰 할 수있다 (> 1 개월)도 나이가 쥐에서.
2. Transcardial 관류 및 뇌 준비
- 빙냉 인산염 완충 식염수로 transcardially 관류; 크게로부터 혈액을 제거하는 30 G 주사기 바늘을 이용하여 (PBS의 NaCl : 10mM의 137 mm의 KCl을 2.7 mm의 KH 2 PO 4 : 1.76 mm의 나 2 HPO 4) 동물.
- 첫째, 신중하게 날카로운 가위로 흉곽을 열고 심장의 좌심실에 바늘을 밀어 넣습니다. 심장과 대동맥에 PBS를 펌핑 바로이 단계는 몸을 종료 혈액 수 있도록 가위로 심장의 우심방을 열고 다음 시작합니다. 주 : 관류 5 얻어 - 동물의 크기에 따라 10 분.
- 관류를 통해 방혈 한 후, 동물의 목을 벨 핀 N으로 머리를 보호eedles (30 G 주사기 바늘) 준비 접시에 눈 소켓을 통해 피어싱과 두개골에서 뇌를 제거하여.
- 우선, 두개골을 오버레이 피부를 봉쇄하는 날카로운 가위를 사용 뒤통수에 작은 절개를 한 후 단지 미부 동물의 눈의 측면에 절단 헤드의 등쪽에 정중선을 따라 잘라 및 꼬리 방향 마지막 절단은 완전히 머리 뒤쪽에 피부의 플랩을 제거한다.
- 이 크게 결국 뇌간의 제거를 단순화하기 때문에 다음, 두개골 자체에 대한 동일한 절단 패턴을 반복, 그 과정에서 모두 cochleas을 제거해야합니다. 이 절차 후 뇌의 꼬리 절반이 완전히 노출 거짓말한다.
- 다음 단계에서, 소뇌에서 약 45 ° 내지 약 2mm의 입쪽의 각도 전체 전뇌를 통해 절단하는 날카로운 면도날 또는 메스를 사용한다. AB와 뇌의 분리 전면 절반을 특종ENT 주걱.
- 그 입쪽 끝에 뇌의 절반을 상승 꼬리이어서 여전히 복부쪽에 뇌간 접속되어 뇌신경 통해 잘라 주걱을 사용한다. 최종 결과로서, 뇌간을 포함한 뇌의 꼬리 절반 준비된 동물 머리의 나머지 떨어져 자유롭게 낙하한다.
- 그것의 복부 측면을 노출하는 뇌의 제거 꼬리 반 플립과 사다리꼴 본체를 포함하는 복부있는 "전구"의 (선행 성 주사에 대한) 단지 주동이의 관상면을 따라 절단 또는 (역행 주사에 대한) 바로 꼬리 (단계 참조 2.3).
- 언제나 조직에 과도한 기계적 스트레스에 의한 세포 사멸을 최소화하기 위해 절단 과정을위한 날카로운 면도날 또는 메스를 사용한다. 최종 결과로서, 길이가 약 1cm에 걸친 다른 뇌 영역을 따라 완전한 우수한 olivary 착체를 함유하는 뇌 이식편을 수득 한 것이다.
주 :이 프로토콜은 청각 뇌간 위치한 사다리꼴 체로 트레이서 주입하는 절차를 보여준다. 필요에 따라, 절삭면과 주사 부위의 위치 및 방향을 적응. 들이 식별되고 뇌를 절단하지 않고 분사 될 수 있도록 뇌의 표면에 충분히 가까이 관심 거짓말의 형광 뇌 영역 (도 2b 참조) 경우, 관상 절단 공정을 생략 할 수있다.
- 사다리꼴 본체 (VNTB)의 복부 핵을 포함하는 두 복부 눈에 띄는 "전구"로 사다리꼴의 몸을 확인합니다.
참고 :이 절삭면의 대략적인 정위 위치에 대한 자세한 해부학 참고로, MM은 Tz 일 "로 표시 사다리꼴 몸 (= MNTB)의 내측 핵을 보여줍니다, 브레 그마 ~ -5.7를 아틀라스의 프랭클린 & Paxinos, 2008 년 패널 (78)을 참조 ". 패널 (69)는 사다리꼴 보의 복부 핵을 보여줍니다"MVPO"(medioventral periolivary 핵) (19)로 표시 DY (VNTB).
3. 선행 성 / 역 행성 추적
참고 : RT (25 ℃)에서 모두 다음 절차를 수행합니다.
- 125 mm의의 KCl : 2.5 mm의의 MgCl 2 : 1 mm의 CaCl2를 0.1 mM의 포도당 절단 후 (95 % O 2, 5 % CO 2) 해부 용액 (NaCl을 산소 함유 제제 접시에 뇌간 이식편 배치 25 mm의의 NaH 2 PO 4 : 1.25 mm의 NaHCO3을 25 mm의 아스코르브 산 : 0.4 mm의 이노시톨 : 3 mm의 피루브산 2 mM)을 30 G 주사기 바늘을 고정. 분사의 영역이 위쪽으로 향하도록합니다.
- 붕규산 유리 주입 피펫을 당겨 다음과 같은 세 가지 솔루션 중 하나를 채우기 : choleratoxin 서브 유닛-B PBS 12 ~ 13에서 알렉사 형광 (555)에 결합 된 (주로 역행 전송에 사용), B의) 1.0 ㎎ / ㎖ 솔루션 ) 1 % -d10,000 MW 덱스 트란 TRITC-555의 0.9 % 식염수, 덱스 트란 (주로 역행 수송에 사용 MW 3,000) 555 테트라 메틸 또는 c) 1 % -dilution 0.9 % 식염수에 ilution (주로) 선행 성 전송을 위해 사용된다.
- 4 당겨주기 - 2.5에서 3.5 옴과 그들이 3에서 제조되는 것을 주입 피펫 저항 범위를 확인합니다. 여기 기재된 실험을 위해, 피펫 풀러에 미리 프로그램 당기는 알고리즘을 선택함으로써 이것을 달성한다.
- 적절한 파장의 정적으로 탑재 레이저 포인터 사용 뇌 이식편 조명 (도 3a에 '2'번 항목을 여기서 설명한 실험에서 405 nm 파장). 주사를위한 가이드로 레이저 포인터를 사용하고, 형광 표지 된 뇌 핵 또는 주입 될 관심 셀에 레이저 빔을 목표로한다.
- (70) - 호환 필터 고글 (450를 입고있는 동안 찾아 쌍안 현미경을 통해 조사 대상 지역을 관찰여기에 설명 된 실험) 0 nm의 대역 통과 필터. 관심의 영역으로 미세 조작기를 통해 주입 전극을 삽입합니다.
- 추적 물질을 주입한다. 뇌 단면 내의 관심 영역 (ROI)의 영역과 수직으로 향하는 압력 분사 장치를 사용하여, 50 밀리 초마다 15 psi에서 10 압력 펄스 - 주사는 2로 구성된다. 염료가 확산 할 수 있도록 15 초 - (10)의 간격으로 각각의 압력 맥동을 관리.
- 테트라 메틸 (TRITC) 주사제의 경우에는, 추가로 (여기에서 설명 된 실험과 MNTB VNTB) 관심의 뇌 영역에 배치 된 전극을 통해 전기 염료 흡수를 강화하기 위해 전기 자극한다.
- 자극 분리 장치 (그림 3B의 항목 번호 7, 9)와 55 V로 자극에 의해 구동 증폭 간격 interpulse 50 밀리, 50 밀리 초 8 볼트의 8 TTL 펄스를 사용합니다. 이 프로토콜, adminis의 20 반복 - (10)를 사용하여몇 분 7,8에 걸쳐 tered. 제대로 전극을 접지하십시오 - 접지선은 목욕 솔루션에 연결해야합니다!
- 분사의 성공을 확인합니다. 긴 발광 파장과 형광 트레이서도 단파장 레이저 여기시 형광 신호를 방출하기 때문에, 시각적으로 레이저 영역을 조명하고 상기 필터 고글 통하여 관찰하면서 주입 대상 영역 확산 염료 흡수 / 확인.
4. 배양
- 주입 후, 산소 인공 뇌척수액에서 (ACSF을 brainstems을 품어, 염화나트륨 : 125 밀리미터,의 KCl : 2.5 mm의의 MgCl 2 : 1 밀리미터, 염화칼슘 2 : 2 밀리미터, 포도당 : 25 밀리미터,의 NaH 2 PO 4 : 1.25 밀리미터, NaHCO3을 25 mm의 아스코르브 산 : 0.4 mm의 이노시톨 : 3 mm의 피루브산 : 2 mm의 95 % O 2로 버블 - 실온에서 5 % CO 2) 1 (RT, 25 ° C) - 4 시간, 동안염료가 전송되고있다. 버블 전체 잠복기 동안 용액.
- 밤새 (O / N)을 포스트 - 고정 가능하도록 39 ° C에서 그들을 및 부화 (PFA / PBS 믹스 pH를 7. 약 100 ml)에이어서, PBS에 용해 된 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA)로 brainstems 옮긴다.
5. 조직 슬라이스 및 장착
- 다음날, PBS에 뇌간에게 (각 세척 단계 5 분) 세 번 씻어, 4 % 한천에서 그것을 커버하고 50로 절단 - vibratome에 80 μm의 두께 조각. 유리 슬라이드와 커버 슬립에 장착 매체를 이용하여 산 조각.
- 선택적으로, (: AB 미디어 100 희석 1 예를 들어 파란색 Nissl) 25 분 동안 형광 Nissl와 섹션 레이블을 붙입니다.
- , AB 미디어를 준비 0.2 M 인산 완충액 250㎖를 혼합하는 방법 (PB; 51 mM의 KH 2 PO 4, 150 밀리미터 나 2 HPO 4), 15 ml의 5 M의 NaCl, 15 ml의 10 % 트리톤-X, 220 ML의 DDH 2 O 5g과 소 혈청 알부민.
- Prece드를 PBS의 3 세척 단계로 Nissl 라벨 단계 (10 분마다)을 성공합니다.
주 : 두꺼운 부분이 장착되고 분석 될 필요 경우 (예 : 여기에 기술 된 실험 슬라이스 100이었다 - 큰 거리에서 축삭 연결을 유지하기 위해 두께 500 미크론) 기술은 조직 지우기와 결합 될 수있다. 우리는 ClearT2 (12)가 20 성공을 발견했다. 조직 청소 단계가 포함되는 경우, 섹션을 설치하기 전에 수행합니다.
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Representative Results
레이저 포인터 레이저 고글은 신속하고 저렴 쓰레기에서 GFP 양성 동물 유전자형 할 수있는 방법 1 및도 2를 도시한다. 어린 마우스 새끼의 경우, 기술은 비 침습적 두개골 상부 피부 (- D도 1a)를 통해 동물의 뇌에서 GFP 라벨을 식별하는 데 사용될 수있다. 방출 된 형광은 적어도 최대 3 일 산후 (도 1C)에 피부와 새끼 마우스의 두개골을 통해 알 수있다. 절차는 우리의 녹색 형광 단백질 (GFP) 그림 1에 표시되어 신경 세포의 글라이신 하위 집단 (GlyT2-GFP)에 GFP를 발현하는 마우스 라인을 표시. 두꺼운 두개골과 피부 착색 이전 동물, GFP 라벨은 피부 및 뼈를 통해 덜 나타내며, 따라서 헤드 및 / 또는 목 피부는 광 유전자형 (도 2A) 전에 제거 될 필요가있다.
를 관류 한 후동물의 뇌는 꺼내어 관심의 형광 표지 된 핵을 찾기 위해 다시 켜집니다. 가까운 그림 2B에서 뇌간의 복부 표면에 빛 밝은 구조는 우리가 우리의 추적 주입을위한 가이드와 대상 모두로 사용되는 사다리꼴 몸의 두 복부 핵이다. 4와 5의 대표적인 결과를 보여준다 및 choleratoxin 소단위-B를 사용하여 사다리꼴 본체의 내측 핵 (MNTB)로 두 역행 주사 (CTB, 사다리꼴 본체 (VNTB)하여 테트라 메틸 된 덱스 트란 (.도 4 TRITC)의 복부 핵으로 선행 성 주입도 5a 및 B) 및 TRITC (도 5C와 D). MNTB에 VNTB에서 돌기 (이 경우 억제에) 나타내는 밝은 축삭 라벨이 VNTB (그림 4)에 선행 성 주입 다음을 알 수있다. 5A 및도 5c는 사이트를 통해 개요를 보여옆에 역행 표지 세포 (VNTB)를 포함하는 핵에 주입 (MNTB)의. 그림 5A 및 5C에 표시 같은 섹션에서 글라이신 VNTB 세포 인 somata을 표시 역행의 5B와 5D 쇼 확대 된 이미지를 도시한다. CTB와 역행 추적이 더 반점 패턴 12 ~ 13 (그림 5B) 결과 방법 역행 TRITC로 표지 VNTB 세포가 매우 조밀 한 골지 같은 라벨 (21) (그림 5D)를 표시하는 반면, 주.
그림 1. GlyT2-GFP 양성 광학 유전자형과 GlyT2가-GFP-네가티브 마우스를 GFP 양성 마우스 녹색 않고 405 nm의 레이저 포인터 레이저 조사시에 (A) 일반 조명 조건 (B) 하에서 촬영 하였다 필터링 고글 및 (C)레이저와 자외선 보호 안경과 레이저 조명에 따라. 강한 GFP 신호가 소뇌와 뇌간 위의 지역에서 볼 수있다. (D) 반면, 같은 마우스 라인과 나이 (P2)에서 GlyT2-GFP - 부정적인 새끼는 (같은 지역에서 형광의 흔적을 표시하지 않습니다 다시 머리와 척수)의. 청색 레이저 광을 효과적으로 고글에 의해 필터링된다.
그림 2 : 광학 유전자형과 준비 뇌 절편. (A) GlyT2 P4-GFP 마우스 새끼의 두개골은 레이저 조사에 노출 밴드 패스 필터링을 통해 볼 고글. GFP 형광이 두개골을 통해 관찰 될 수있다. (B)의 뇌 절편을 동일한 강아지에서 레이저 조사시 제제 접시에서 필터링을 통해 본 고글. 이러한 사다리꼴 본체 (VNTB)의 복부 핵으로서 글라이신 축삭 뇌 핵, 버전으로 볼 수있다뇌 표면에 가까운 Y 밝은 구조.
그림 3 : 체외 압력 주입 및 Electroporation에 설치 이상 개요. (A) 1 : 입체경, 2 : 마운트 레이저 포인터 (405 nm 파장), 3 : 주입 피펫 headstage를 미세 조작기에 장착, 4 : 설치된 MC 자극 소프트웨어, 6 PC : 뇌 이식편 5를 함유하는 제제 접시 : 튜브를 통해 주입 피펫에 연결된 압력 분사 장치, (B) 7 :. 자극 분리 부 8 : 고강도 일루미네이터, 9 : 자극기. 자극은 자극 분리 유닛을 통해 피펫의 전극에 접속되고, PC에 의하여 구동된다.
그림 4 : 사다리꼴 몸의 내측 핵에 VNTB에서 억제 연결의 선행 성 추적 (MNTB). P14의 GlyT2-GFP 마우스의 삭제 뇌에 깊이 약 200 미크론에 걸쳐 수평 슬라이스에서 촬영 공 초점 스택의 최대 투사은 표시. VNTB의 caudo - 중간 부분에 테트라 메틸의 덱스 트란 (TRITC) 주입 후, 밝게 축삭 연결 레이블 (일부의 경우 자신의 단말기 엔딩에) MNTB에 VNTB에서 관찰 할 수있다. 스케일 바 : 200 μm의.
그림 5 :. VNTB에 MNTB에 역행 추적기 주사가 작성 공개 글라이신 세포 표시됨 최대 전망이다 촛점 P88의 관상 조각에서 촬영 스택 (A, B)와 P80의 (C, D (이상 약에 걸쳐 50 μm의.) MNTB의 중간 부분에) GlyT2-GFP 마우스입니다. (A) choleratoxin 서브 유닛-B의 개요 (CTB) 주사. (B) VNTB에서 글라이신 세포는 CT로 가득도 5a에 도시 된 주입의 결과로서 B (셀 인 somata 빨갛게 puncta에). puncta의 일부 (예를 들어, 인해 분사 영역에서 통로의 부상 섬유)뿐만 아니라, 충전 된 VNTB 다른 GFP - 음성 (비 - 글라이신) 세포 유형을 나타낼 수 있었다 세포 밖에 나타나지 . (C) MNTB 타겟팅 역행 TRITC 주입의 다른 개요. 주 셀의 개수는 (도 5a에 순수 압력 주입 CTB는 대조적으로) 일렉트로 다음 MNTB에 TRITC 충전 방법. (D) MNTB에 TRITC 주입 후 글라이신 VNTB 셀 레토 라벨링 (동일한 주입 )도 5c에 도시 된 바와 같이. 대부분의 셀은 두 때문에 형광 시그널 (토착 GFP 발현 및 적색 TRITC와 충전)의 혼합물로, 조밀 한 황색 또는 오렌지색 표지를 표시. GFP 양성 세포와 비교하는 몇 가지 이유염료 (파란색 화살표)과 깊이 빨간색과 가능성이 있기 때문에 주입 (빨간색 화살표)의 영역에서 축삭 부상, 충전 나타나는 추적 표지 GFP - 부정적인 셀을 차지하지 않았다. CTB (그림 5B) 및 TRITC (그림 5D)를 사용하여 역행 추적 주사의 세포 인 somata의 다른 염색 패턴을합니다. 스케일 바 :도 5a 및도 5C : 20 μm의 200 μm의는, 5B와 5D 피규어.
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Discussion
, 생체 내 추적 연구에 반대 체외 추적 전기의 일반적인 강도는 고가의 정위 (종종 전기 생리학) 장비를 포함하지 않는, 그것은 연구자에게 따라서 관심과의 뇌 영역에 더 접근 할 수 있다는 것입니다. 덱스 트란 아민 및 다른 트레이서의 사용에 대한 상세한 검토를 참조 (생체 트레이서 주사의 경우가 아닌 일 또는 주 - 또한, 뇌 이식편 필요한 생존 기간은 몇 시간 (4 일)에 걸쳐 Lanciego 및 Wouterlood 2011 년 22뿐만 아니라,로드 리 게스 - 콘트레라스, 등. 2008 년 23)에 의해 생체 내 주사에 그래서, 실패 주사가 빠르면 주입 절차를 수행하는 동안 등을 검출 할 수 있도록 또는 다음 날에, 늦어도 주입 파라미터를 적절히 조정할 수있다. 뇌 이식편 대 짧은 생존 기간도 <간의 작은 차이는 일반적으로 존재한다는 것을 의미EM> 효과 (염료가 선행 성 뉴런 또는 역행 주사의 축삭 터미널에 의해 흡수 된 지역) 및 사출의 사이트를 명백한 (염료가 흡수되지 않고, 유출 지역),이 차이는 배제되지 않을 수 있지만 완전히 만 사후 일부 경우 완전히 불가능할 수있는 제어 / 정량화 할 수있다 (참조 : 브레 등., (2014)에 대한 자세한 설명 24).
그것은 거의 모든 길이의 연결이 한 실험이 주입 된 영역과 뇌 조직의 하나의 조각 축삭 돌기의 목표 또는 소스 영역 모두를 보존 할 수있는 한,이 방법으로 공부를 할 수 있다는 것을 지적한다. 이러한 연결의 명확한 시각화가 조직을 실행 한 후 (여기에서 설명 된 바와 같이) 슬라이싱 및 뇌를 장착 한 후에 취득한 공 초점 화상 스택 또는 전체 뇌 / 뇌 슬래브 영상 재구성 기술 중 하나를 통해 달성 될 수있다보내고 프로토콜 (예를 들어,이 프로토콜 섹션 5 참조).
레이저 유도 생체 전기에 대한 우리의 기술의 주요 장점은 추적 주사시 정확도를 대상으로 크게 증가이다. 체외 전기의 원래 방법은 특정 지형 마커를 대상으로 또는 주사의 영역에 대해 그들에게로 대략적인 가이드를 사용하여 단지 시각적 컨트롤을 사용합니다. 동일한 표적 영역에 염료 확산 사실이다 : 하나는 확산 염색을 관찰 할 수 있지만, 미세한 방식 염료 확산을 제어하는 것은 용이하지 않다. 이 방법의 레이저 수정을 통해, 연구원 쉽게 핵 및 관심의 세포를 찾을 수 있고, 고유의 유전자 중심의 형광의 상호 작용과 염료의 형광을 통해 관심의 핵 / 셀 인구의 염료 확산을 관찰합니다. 따라서, antero- 또는 역 행성에서 오 탐지를 최소화하여 그 / 그녀의 추적 실험을 통해 연구자의 이익보다 제어충전, 관심의 핵 / 지역 외부 세포 / 축삭 터미널뿐만 아니라 주입 동안 가득 차 있었다 때문이다. 분명히, 이것은 앞에서 언급 한 바와 같이, 명백한 사이트와 다를 수 있습니다 주입의 효과 사이트를 통해 절대 통제를 의미하지 않는다. 이 기술의주의해야 할 점은 분명히 유전자 변형 생물체의 가용성이다. 마우스는 청각 필드에 해당하는 포유 동물 연구에 널리 사용되는 유전자 모델 생물이다, 그러나보다 정밀 인간 청력도 유사하므로 일부 포유 동물 모델은 더 고려 될 수있다. 따라서, 다른 기술들이 연구 분야의 특정 유형에 더 적합한 다른 종류의 야생형 동물에서 뉴런 집단 (청각 시스템 25-28의 연구 예 모래 쥐 또는 친칠라)를 레이블링하기 위해 이용 될 수있다 :이 활용 바이러스 주사를 포함 할 수있다 뇌와 표현 fluoresc의 특정 구획을 대상으로 특정 발기인뇌 세포의 서브 세트 만에 ENT 마커. 물론, 별도의 관리는 구조가 노크 마우스 라인에서 고유로 야생형 동물에 급속도로 표현 또는 여부에 상관없이 신경 세포의 오른쪽 하위 집단에서 발현 된 유전자 구조의 유효성을 확인하지 않습니다주의해야 할 필요가있다.
앞서 지적한 바와 같이, 신경 세포의 특정 부분 집단의 형광 단백질을 발현하는 마우스 돌연변이 이점도 (우리의 경우에 우리의 순수한 시각화하여 다른 (24)에 하나의 청각 뇌간 핵으로부터 억제 돌기를 특성화 할 수 있었다 뇌 회로의 기능적인 특성을 허용 우리의 추적 실험 결과). 추적 실험 결과 중 어느 해석이 수행 전에 다시, 유전자 발현 작 제물의 유효성이 확인 될 필요가있다.
체외 전기의 또 다른 일반적인 강도는 OTH와의 호환성이다예 (면역) 조직 화학 및 뇌 청산 등의 어의 해부학 적 방법. 이전에 24 알 수 있듯이, 이러한 Nissl 같은 추가 염색 기술의 응용 프로그램 또는 ClearT2 12 20, 24라는 뇌 청소 방법에 의해 영향을받지 않습니다. 하나 염두에 두어야하는 큰 단점이 하나 추가 (면역)의 신호 강도 조직 화학적 대 두꺼운 조각에 축삭 프로세스 보존의 옵션을 무게를 갖도록 Nissl 및 항체 얼룩의 침투 깊이가 증가하고 조직의 두께가 감소한다는 것입니다 모두 해부학 라벨링 방법이 필요한 실험 염색. 라벨의 최소한이 시점 (고유 형광 단백질 발현, 추적 및 Nissl / 항체 라벨)에서 세 마커에서 시작하기 때문에 물론, 고려해야 할 또 다른 요소는 서로 다른 형광 라벨의 여기 / 방출 대역폭 분리이다.
명백히, 우리는 상술 한 방법으로 확장 될 수있다뇌 외식 또는 형질 전환 마우스의 경우에도 뇌 조각으로 (양자 구슬 포함) 형광 마커의 어떤 종류의 주사. 사출 정확성 모두에 의존하기 때문에, 명확한 타겟 검출 (형광 표지 된 핵 및 세포의 관찰) 및 형광 염료의 유출 위에 미세한 제어는 이러한 두 가지 요인 중 하나만 증가 주입 정확도 충분하다하더라도을 다른 하나는 존재하지 않는다. 이것은 (바이러스 구조 또는 다른 DNA / RNA 벡터와 같은) 다른 비 형광 마커가 긴 대상 핵 명확 실험자에게 표시되는 바와 같이, 관심있는 뇌 핵으로 정밀도가 더 주입 될 수 있다는 것을 의미한다. 전기 천공은 주사 이러한 유형의 방법은, 우리의 거의 이상적뿐만 29-30, DNA 재료의 효과적인 흡수를 허용하기 때문에이 후자의 애플리케이션은 특히 흥미 롭다. 고려 될 필요가있는 유일한 단점은 DNA 작 제물은 라이브 TI의 문제를 표현하는 시간이 걸릴 수 있다는ssue 보존이 발생한다. 이것은 뇌의 Organotypic 슬라이스 문화를 구축하여 극복 할 수있는 31 ~ 32 주 정도의 라이브 조직 보존을 허용 주입 뇌 조각 (또는 재 슬라이스 뇌 조직 블록)을 기반으로.
그리고 물론 다른 형질 전환 마우스 돌연변이 콜린성 신경 세포와 같은 다른 신경 세포 유형의 연결을 조사하는 데 사용할 수 있습니다 (예를 들어 간담 GFP 마우스 33),이 방법에게 연결 및 뇌 (마이크로) 회로의 기능을 연구하는 다양한 도구를 제작.
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Disclosures
우리는 공개 할게 없다.
Acknowledgments
NIH 지원 / NIDCD R01 DC 011582. 이미징 실험은 콜로라도 앤 슈츠 의료 캠퍼스 고급 광학 현미경 코어의 대학에서 수행 하였다는 NIH / NCRR 콜로라도 CTSI 허가 번호 UL1 RR025780과 록키 마운틴 Neurlogical 장애 코어 센터 보조금 NIH P30NS048154에 의해 부분적으로 지원. 솔크 연구소에서 박사 샤샤 뒤 락은 GlyT2-GFP 마우스를 우리에게 제공했다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | All chemicals are from Sigma-Aldrich, unless noted otherwise. |
| Potassium chloride | P9333 | ||
| Potassium phosphate monobasic | P5655 | ||
| Sodium phosphate di-basic | S907 | ||
| Magnesium chloride | M2670 | ||
| Calcium chloride | C5080 | ||
| Glucose | G7528 | ||
| Sodium bicarbonate | S6297 | ||
| Ascorbic acid | A4544 | ||
| Myo-inositol | I5125 | ||
| Sodium pyruvate | P2256 | ||
| Bovine serum albumine | A2153 | optional, for additional (immuno)histochemistry | |
| Triton-X-100 | X100 | optional, for additional (immuno)histochemistry | |
| Poly(ethylene glycol), 8000 MW | P2139 | optional, for brain clearing | |
| Formamide | Fisher Scientific | F84 | optional, for brain clearing |
| Choleratoxin subunit-b | Molecular Probes | C-34776 (Alexa 555) | |
| Dextrane tetramethyl-rhodamine | Molecular Probes | D-7162 (Alexa 555) | |
| Fluorescent Nissl | Invitrogen | N-21479 (blue) | optional |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | SF93 | |
| Agarose | Invitrogen | 16520 | |
| Fluoromount-G | Southern Biotech | 0100-01 | |
| Pentobarbi-tal | Vortech Pharmaceuticals | Fatal-Plus | |
| Borosilicate glass filaments | Harvard Apparatus | G150F-10 | |
| Pipette puller | Zeitz Instruments, Germany | DMZ Universal Puller | |
| Perfusion setup | Custom-made | ||
| Laser pointer | laserpointerpro.com, Hong Kong | HK-88007294 (405 nm) | |
| Filter/safety goggles | Dragon Lasers, China | LSG09 (band-pass 450-700 nm) | |
| Bionocular microscope | Wild Heerbrugg, Switzerland | Wild M3 | Equipped with high-intensity illuminator (MI-150; Dolan-Jenner Inc.) |
| Picospritzer | Parker Instruments | Picospritzer III | |
| PC with installed MC Stimulus software | Multi Channel Sys-tems, Germany (software) | ||
| 2-channel stimulator | Multi Channel Sys-tems, Germany | STG-1002 | |
| Stimulation isolation unit | A.M.P.I., Israel | Iso-Flex | |
| Micromanipulator | Narishige, Japan | YOU-1 | |
| Vibratome | Leica, Germany | VT1000S |
References
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