Summary
Nós descrevemos uma técnica para identificar neurônios e seus processos via anterógrada ou retrógrada tracer injeções em núcleos cerebrais usando uma preparação in vitro. Nós modificamos um método existente de i n vitro tracer eletroporação, aproveitando fluorescente etiquetado ratos mutantes e equipamentos ópticos de base, a fim de aumentar a precisão de rotulagem.
Abstract
Nós apresentamos uma técnica que combina um protocolo in vitro injecção traçador, que utiliza uma série de impulsos eléctricos e de pressão para aumentar a absorção do corante através de electroporação em explantes de cérebro com iluminação laser direcionados e correspondentes óculos com filtro durante o procedimento. A técnica descrita de electroporação in vitro, por si só produz relativamente bom controlo visual para o objectivo de certas áreas do cérebro. Combinando-a com excitação laser de marcadores genéticos fluorescentes e sua leitura através de óculos de proteção do filtro de passagem de banda, o que pode pegar as emissões das células geneticamente marcadas / núcleos e o corante de rastreamento fluorescente, um pesquisador pode aumentar substancialmente a precisão das injeções encontrando a área de interesse e para controlar a propagação de corante / absorção na área de injecção muito mais eficientemente. Além disso, a técnica de iluminação do laser permite estudar a funcionalidade de um determinado neurocircuit por provIding informações sobre o tipo de neurónios que se projectam para uma determinada área em casos em que a expressão da GFP está relacionada com o tipo de transmissor expressa por uma sub-população de neurónios.
Introduction
A fim de estabelecer um certo (micro) circuito neuronal, deve-se começar por encontrar os vários participantes do referido circuito, e seu padrão de conexão. Desde a publicação de Waller sobre rastreamento através de Lesão uma grande variedade de técnicas de rastreamento neuroanatomical neurofiber foi estabelecida. Algumas destas técnicas podem ser aplicadas no tecido fixa post mortem 2-4, outros contam com o transporte activo do corante em neurónios vivos, como descoberto em 1971 5-6. Os últimos podem ainda ser subdivididos em dois grupos que discriminam entre os métodos aproveitando retrógrada activo (a partir da zona injectada para a fonte de uma determinada projeção, ou seja. O somata de neurónios que se projectam para a referida área) e anterógrada activo (a partir do injectados área para o destino de uma determinada projeção, ie. as projeções axonal e os terminais axonais dos neurônios marcados) de transporte. Além disso, em alguns casos tramaterial de CER é injectada em animais vivos que, em seguida, sobrevivem a injecção por vários dias ou semanas (em injecções vivo tracer), enquanto que em outros casos cérebros explantados são injectados e incubar durante várias horas após a injecção no líquido cerebrospinal artificial (in vitro injecções tracer) .
Neste protocolo, modificou um já existente na técnica de eletroporação vitro 7-8 para rotular somata e processos neuronais em anterógradas e rastreamento retrógrado experimentos usando choleratoxin subunidade-b e tetramethylrhodamine dextrano como as substâncias de rastreamento. O objetivo geral deste protocolo é o de proporcionar neurocientistas com uma ferramenta eficiente para traçar padrões de conectividade neuronal entre diferentes núcleos cerebrais, enquanto aproveita as vantagens das linhas de camundongo transgênico disponíveis e equipamentos ópticos de base, a fim de aumentar a precisão do alvo durante injeções traçadores. Embora o método de anterógrada e retrógrada usando o rastreamentocholeratoxin e amina de dextrano e os seus respectivos conjugados marcados com fluorescência não é nova 9-13 (como é o método de electroporação, por exemplo. Haas et ai. 14), a combinação de marcador com injecções electroporação numa preparação in vitro envolvendo blocos de tecido cerebral é um desenvolvimento mais recente 7. A sua principal vantagem sobre as técnicas de rastreio neuronais utilizando o mesmo tipo de corantes marcador nos animais vivos é o aumento da intensidade de marcação, em virtude da maior eficiência com que o corante é a electroporação podem ser tomados por neurónios. Uma vantagem adicional é o período de incubação encurtado (necessário para o transporte de corante) e da sua maior precisão o alvo durante a injecção do traçador, porque o experimentador tem o controlo visual sobre a área alvo da injecção. Este último também significa que nenhum equipamento caro estereotáxica é necessário para encontrar núcleo ou o cérebro área de interesse.
Para addicionalmente aumentar a precisão da focalização, que se aproveitou de uma linha de camundongo transgênico, que expressa GFP na sua subpopulação glicinérgica de neurônios 15 e equipamentos ópticos de base constituídos por um ponteiro laser de mão de 405 nm óculos de filtragem comprimento de onda e correspondência passa-banda (450 - 700 nm). Assim, conseguimos uma aumento significativo no direccionamento precisão, identificando a área de injecção através do seu sinal de fluorescência e ao proporcionar uma forma mais fina para controlar a difusão do corante dentro da área de injecção através da observação da interacção entre o sinal de GFP nativa e o traçador fluorescência. A nossa técnica também permite descobrir a funcionalidade de um circuito, juntamente com a sua conectividade por identificar neurónios inibitórios GFP positivas (ou excitatório em outras linhas de rato) que foram preenchidos com o traçador.
Em resumo, ainda mais reforçada uma poderosa ferramenta para estudar o neuroscientific conectoma do cérebro de vertebrados e avaliar tEle características diferentes neuroanatomical de um determinado neurocircuit. Ao usar camundongos transgênicos, juntamente com equipamentos ópticos barata e amplamente disponível, fomos capazes de aumentar significativamente a precisão da focalização dos nossos injeções. Além disso, os ratinhos transgénicos nos permitiu identificar o tipo das ligações rastreadas, que ajudaram a descobrir a funcionalidade de um microcircuito inibitório no tronco encefálico.
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Protocol
1. A genotipagem Optical
1. Optical Genotipagem do mouse filhotes de cachorro
- Entrada para a expressão do respectivo marcador fluorescente usando um ponteiro laser do comprimento de onda de excitação apropriado (405 nm, nas experiências descritas aqui) e correspondente óculos de filtro de bloqueio do comprimento de onda de excitação, mas passando o comprimento de onda de emissão (450 - 700 nm, nas experiências descritas aqui) . Apontar o ponteiro laser na parte posterior da cabeça ou espinal medula de rato a pup (ver Figura 1). Evitar que brilha o laser para os olhos e longa exposição da pele à luz laser.
2. Optical genotipagem de animais mais velhos
- Profundamente anestesiar o rato (p14 envelhecido ao p138 nas experiências descritas aqui) com uma overdose de pentobarbital através de uma injecção intraperitoneal (120 mg / kg de peso corporal). Confirme anestesia adequada, verificando os reflexos do animal (apertar brevemente a ponta do the orelha ou uma das patas traseiras para o reflexo de retração da orelha ou na perna).
- Nota: Apesar do uso de uma overdose de pentobarbital (120 mg / kg de peso corporal) nos referimos ao procedimento de injeção como "anestesia profunda" em vez de eutanásia, porque o animal é idealmente ainda vivo (ou seja, seu coração ainda está batendo), quando o cirurgia e começar a perfusão. Isto assegura uma perfusão mais eficiente dos órgãos internos incluindo o cérebro.
- Uma vez que o animal não mostram quaisquer reflexos, remover cuidadosamente a pele que cobre o crânio (Figura 2A), fazendo uma incisão na pele que cobre a parte traseira da cabeça de corte e para o meio do crânio. Expor o crânio expostos a luz laser e observar a fluorescência através dos óculos de filtro, conforme descrito acima. Se um sinal de GFP positiva é observada, vá para a etapa 2, se não, sacrificar o animal através de decapitação (segunda / garantindo forma de eutanásia seguindo a nossaRegulamentos IACUC).
Nota: Nos ratos mais velhos mesmo (> 1 mês) a fluorescência podem ser observados através dos olhos do animal.
2. transcardial perfusão e Preparação Cérebro
- Perfundir transcardialmente com gelada salina tamponada com fosfato (PBS; NaCl: 137 mM, KCl: 2,7 mM, KH 2 PO 4 1,76 mM, Na 2 HPO 4, 10 mM) utilizando uma agulha de seringa de 30 L para remover em grande parte do sangue a partir de o animal.
- Primeiro, abra cuidadosamente a caixa torácica com uma tesoura afiada e, em seguida, empurre a agulha para o ventrículo esquerdo do coração. Começar a bombear a PBS para o coração e a aorta e imediatamente após este passo abrir o átrio direito do coração com a tesoura para permitir que o sangue saia do corpo. Nota: Perfusão leva de 5 - 10 minutos, dependendo do tamanho do animal.
- Após sangria por meio de perfusão, decapitar o animal, garantir a sua cabeça com o pino needles (ou 30 g) por agulhas de seringa perfurar-los através dos soquetes de olho em um prato preparação e remover o cérebro do crânio.
- Em primeiro lugar, utilizar uma tesoura afiada para cortar a pele que cobre o crânio: fazer uma pequena incisão na parte de trás da cabeça, em seguida, cortada ao longo da linha média do lado dorsal da cabeça, cortada aos lados apenas caudal de os olhos do animal e por último corte na direcção caudal, para remover completamente os retalhos de pele na parte de trás da cabeça.
- Em seguida, repetir o mesmo padrão de corte para o próprio crânio, certifique-se de remover ambas as cócleas no processo, porque isso irá simplificar significativamente a remoção do tronco cerebral no final. Após este procedimento, a metade caudal do cérebro deve situar-se completamente exposta.
- No passo seguinte, utilizar uma lâmina de barbear afiada ou um bisturi para cortar através de todo o cérebro anterior com um ângulo de cerca de 45 ° e cerca de 2 mm rostral do cerebelo. Retire a metade da frente separados do cérebro com abespátula ent.
- Usar uma espátula para elevar a metade caudal do cérebro na sua extremidade rostral e subsequentemente cortar os nervos cranianos que ainda estão ligados ao tronco cerebral no seu lado ventral. Como resultado final, a metade caudal do cérebro, incluindo o tronco cerebral devem cair livremente fora do resto da cabeça preparados para animais.
- Vire a metade caudal removido do cérebro para expor seu lado ventral e corte ao longo do plano coronal apenas rostral (para as injeções anterógradas) ou apenas caudal (para as injeções retrógradas) das "lâmpadas" ventrally localizados contendo o corpo trapézio (veja o passo 2.3).
- Utilize sempre uma lâmina afiada ou um bisturi para o procedimento de corte para minimizar a morte celular causada por estresse mecânico excessivo sobre o tecido. Como resultado final, um explante cérebro que mede cerca de 1 cm de comprimento e contendo o complexo olivar superior completa ao longo de outras regiões do cérebro deve ter sido obtida.
Nota: Este protocolo demonstra o processo de injecção de um traçador no corpo trapezoidal localizado no tronco cerebral auditivo. Adaptar a localização e a orientação dos planos de corte e dos locais de injecção, conforme necessário. Se as regiões do cérebro fluorescentes de interesse estão muito próximas o suficiente para a superfície do cérebro, de modo que eles podem ser identificados e injectados sem cortar o cérebro (ver Figura 2B), então o passo de corte coronal pode ser omitido.
- Identificar o corpo trapézio como dois ventrais proeminentes "lâmpadas" contendo o núcleo ventral do corpo trapézio (VNTB).
Nota: Para mais referência anatômica em relação à localização estereotáxica aproximada desses planos de corte, consulte Franklin & Paxinos de 2008. Panel 78 dos atlas, Bregma ~ -5,7 mm mostra o núcleo medial do corpo trapezóide (= MNTB) rotulados como "Tz ". Painel 69 mostra o núcleo ventral do bo trapezoidaldy (VNTB) rotulados como "MVPO" (núcleo periolivary medioventral) 19.
3. anterógrada / retrógrada Tracing
Nota: Execute todos os procedimentos a seguir em RT (25 ° C).
- Após o corte, colocar o explante do tronco cerebral em um prato de preparação contendo oxigenada (95% O 2, 2 5% de CO) dissecando solução (NaCl: 125 mM, KCl: 2,5 mM, MgCl 2: 1 mM, CaCl2: 0,1 mM, glicose : 25 mM, NaH 2 PO 4: 1.25 mM, NaHCO3 25 mM, ácido ascórbico: 0,4 mM, mio-inositol: 3 mM, ácido pirúvico: 2 mM), prendendo-o com 30 g de agulhas de seringa. Assegure-se que a área de injecção está virada para cima.
- Puxar pipetas de injecção de vidro de borosilicato e enchê-los com uma das três soluções seguintes: a) um / ml, solução 1,0 mg de subunidade choleratoxin-b conjugado com um fluoróforo Alexa 555 em PBS 12-13 (usado principalmente para transporte retrógrado), b ) um -d 1%ilution em 0,9% de solução salina de tetramethylrhodamine dextrano 555 (3.000 MW, usado principalmente para transporte retrógrado) ou c) um -dilution 1% em solução salina 0,9% de 10.000 MW dextrano-TRITC 555 (usado principalmente para o transporte anterógrado).
- Assegure-se que as resistências das pipetas de injecção gama 2,5-3,5 MOhm e que eles são fabricados em 3 - 4 ciclos de tracção. Para as experiências aqui descritas, conseguir isto seleccionando um algoritmo pré-programado puxando o puxador na pipeta.
- Iluminar o explante cérebro usando um ponteiro laser montado estaticamente do comprimento de onda apropriado (produto n ° 2 na Figura 3A; comprimento de onda de 405 nm, nas experiências descritas aqui). Use o ponteiro laser como um guia para as preparações injectáveis, e tem como objectivo o feixe de laser no núcleo cérebro marcado fluorescentemente ou células de interesse que será injectada.
- Encontrar e observar a área alvo iluminado através de um microscópio binocular enquanto usava os óculos de filtragem compatíveis (450 - 700 nm, filtro passa-banda, nas experiências descritas aqui). Inserir o eléctrodo de injecção através do micromanipulador para a área de interesse.
- Injectar a substância marcadora. As injecções de composto de 2 - 10 impulsos de pressão a 15 psi durante 50 ms cada, utilizando um dispositivo de injecção à pressão, dirigido perpendicularmente para a região de interesse (ROI) no interior da secção de cérebro. Administrar cada impulso de pressão em intervalos de 10 - 15 segundos para permitir que o corante se espalhar.
- No caso das injecções de tetrametilrodamina (TRITC), adicionalmente estimular electricamente para melhorar a absorção do corante através de electroporação com o eléctrodo colocado na área do cérebro de interesse (MNTB e VNTB nas experiências descritas aqui).
- Use 8 pulsos TTL de 8 Volts por 50 ms com 50 ms de intervalo entre intervalos, impulsionado por um estimulador e amplificados a 55 V com uma unidade de isolamento, a estimulação (itens No. 7 e 9 na Figura 3B). Use 10 - 20 repetições deste protocolo, administered durante vários minutos 7,8. Certifique-se para aterrar o eletrodo corretamente - o fio terra deve ser conectado à solução do banho!
- Entrada para o sucesso da injecção. Uma vez que um marcador fluorescente com um comprimento de onda de emissão também já está a emitir um sinal de fluorescência após excitação laser com comprimentos de onda mais curtos, para verificar visualmente a absorção do corante / espalhar na área alvo injectado enquanto iluminando a área com o laser e observando através dos filtros de óculos.
4. Incubação
- Após a injecção, incubar o tronco cerebral em oxigenado fluido cerebrospinal artificial (ACSF; NaCl: 125 mM, KCl: 2,5 mM, MgCl 2: 1 mM, CaCl 2: 2 mM, glucose 25 mM, NaH 2 PO 4: 1,25 mM, NaHCO3: 25 mM, ácido ascórbico: 0,4 mM, mio-inositol: 3 mM, ácido pirúvico: 2 mM, fez-se borbulhar 95% de O2 - 5% de CO2) à temperatura ambiente (TA, 25 ° C) durante 1 - 4 horas, enquantoo corante está a ser transportado. Bolha da solução durante todo o período de incubação.
- Subsequentemente, transferir os tronco cerebral em 4% de paraformaldeído (PFA) dissolvido em PBS (aproximadamente 100 mL;. PH 7 para a mistura de PFA / PBS) e incuba-se-lhes a 4 ° C para permitir a pós-fixação durante a noite (O / N).
5. Tissue corte e montagem
- No dia seguinte, o tronco cerebral lavar três vezes em PBS (5 min para cada passo de lavagem), cobri-lo em 4% de agar e, em seguida, cortada em 50 - 80 pm de espessura fatias em um vibratome. Fatias de montagem utilizando um meio de montagem sobre uma lâmina de vidro, e lamela.
- Opcionalmente, rotular as secções com Nissl fluorescente durante 25 min (por exemplo, azul de Nissl em uma diluição de 1: 100 em meio AB).
- Para preparar meios AB, misturar 250 ml de tampão fosfato 0,2 M (PB; KH 51 mM 2 PO 4, 150 mM de Na 2 HPO 4), 15 ml de NaCl 5 M, 15 ml de 10% de Triton-X, de 220 ml ddH2O e 5 g de albumina de soro bovino.
- Precede e sucede à rotulagem passo Nissl por 3 etapas de lavagem em PBS (10 min cada).
Nota: Nos casos em secções mais espessas necessitam de ser montadas e analisadas (em experiências aqui descritas tais fatias foram 100 - 500 mícrons de espessura para preservar ligações axonais ao longo de distâncias maiores), a técnica pode ser combinada com a limpeza dos tecidos. Nós encontramos o ClearT2 12 para ser bem sucedido 20. Quando um passo de compensação tecido está incluído, realizá-la antes da montagem das seções.
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Representative Results
As Figuras 1 e 2 mostram como o ponteiro laser e óculos de laser podem ser usados de forma rápida e barata genótipo animais positivos para GFP de uma ninhada. Em casos de jovens filhotes de rato, a técnica pode ser utilizada para identificar de forma não invasiva etiqueta GFP em cérebros do animal através do crânio e a pele sobrejacente (Figura 1A - D). A fluorescência emitida pode ser visto através da pele e o crânio de filhotes de rato, pelo menos até ao dia pós-natal 3 (Figura 1C). O procedimento é mostrado na Figura 1 para a proteína verde fluorescente (GFP) marcado linha rato expressando GFP na sua glicinérgica subpopulação dos neurónios (GLYT2-GFP). Nos animais mais velhos com crânios mais espessas e pigmentação da pele, o rótulo GFP mostra menos bem através da pele e dos ossos, e por conseguinte, a pele da cabeça e / ou pescoço deve ser removido antes da genotipagem óptico (Figura 2A).
Após a perfusãoanimal, o cérebro é retirado e iluminada novamente para encontrar os núcleos marcados com fluorescência de interesse. As estruturas brilhantes que iluminam perto da superfície ventral do tronco cerebral na figura 2B são os dois núcleos ventrais do corpo trapezoidal, que foi usado como um guia e um alvo para os nossos injeções traçadores. As figuras 4 e 5 mostram os resultados representativos da uma injecção anterógrada no núcleo ventral do corpo trapezoidal (VNTB), utilizando dextrano de tetrametilrodamina (TRITC;. A figura 4) e duas injecções retrógrado do núcleo medial do corpo trapezoidal (MNTB) usando choleratoxin subunidade-b (CTB; As Figuras 5A e B) e TRITC (Figuras 5C e D). Rotulagem axonal brilhante indicando (neste caso inibidora) a partir de projecções VNTB para MNTB pode ser visto na sequência de uma injecção em anterógrada VNTB (Figura 4). As Figuras 5A e 5C mostram uma vista geral sobre o localde injecção (MNTB) com o núcleo contendo as células retrogradamente marcados (VNTB) próximo a ele. Figuras 5B e 5D mostram ampliada imagens de retrogradamente marcados somata de células VNTB glicinérgicas nas mesmas seções como apresentado na Figura 5A e 5C. Note como o rastreamento retrógrado com CTB resulta em um padrão mais pontuada 12-13 (Figura 5B), enquanto que as células VNTB retrogradamente marcadas com TRITC exibir uma rotulagem Golgi-like muito denso 21 (Figura 5D).
Figura 1:. Óptica Genotipagem de GLYT2-GFP-positiva e GLYT2-GFP-negativo Ratinhos Os ratinhos GFP-positivas foram fotografadas sob (A) condições de iluminação normal, (B) mediante iluminação laser com um ponteiro laser 405 nm sem o verde- óculos de filtragem e (C)em cima de iluminação a laser com o laser UV e óculos de segurança. Um sinal de GFP forte é visível na área acima do cerebelo e tronco encefálico. (D) Por outro lado, filhotes de cachorro-GLYT2-GFP negativo da mesma linha do mouse e idade (p2) não mostram quaisquer sinais de fluorescência nas mesmas áreas ( de trás da cabeça e da espinal medula). A luz laser azul é efetivamente filtrado pelos óculos de proteção.
Figura 2: Optical Genotipagem e um explante Cérebro Preparado. Crânio (A) A P4 GLYT2-GFP do rato do filhote de cachorro é exposta a iluminação a laser e visualizada através de passa-banda óculos de filtragem. A GFP fluorescente pode ser observado através do crânio. (B) A explante cérebro da mesma filhote de cachorro em um prato preparação sobre iluminação laser, como visto através dos óculos de filtragem. Axónios glicinérgica e núcleos do cérebro, tais como o núcleo ventral do corpo trapezoidal (VNTB) pode ser visto como verestruturas brilhantes y perto da superfície do cérebro.
Figura 3: Visão geral Mais de uma em injeção Pressão Vitro e Configuração Eletroporação. (A) 1: estereoscópio, 2: ponteiro laser montada (405 nm de comprimento de onda), 3: headstage com pipeta de injecção montado sobre um micromanipulador, 4: prato preparação contendo o explante cérebro, 5: um computador com o software instalado MC estímulo, 6: dispositivo de pressão de injecção, ligada à pipeta de injecção através de tubos (B) 7:. estímulo unidade de isolamento, 8: iluminador de alta intensidade, 9: estimulador. O estimulador é ligado ao eléctrodo na pipeta através da unidade de isolamento de estímulo e é accionado pelo PC.
Figura 4: Rastreamento anterógrada de conexões inibidoras de VNTB à Medial Núcleo do Corpo Trapézio (MNTB). É mostrada uma projecção máxima de uma pilha confocal recolhida uma fatia horizontal abrangendo cerca de 200 microns de profundidade em um cérebro de um rato foi afastada p14 GLYT2-GFP. Após uma injecção de dextrano de tetrametilrodamina (TRITC) na porção caudo-medial do VNTB, brilhantemente marcado ligações axonais (e em alguns casos a sua terminação) a partir de terminais VNTB para MNTB pode ser observada. Barra de escala: 200? M.
Figura 5:. Retrógrados Tracer injecções no MNTB Revelar Cheio Células glicinérgica no VNTB mostrados são projeções máximas (abrangendo mais de cerca de 50 m.) De pilhas confocal tomadas em cortes coronais de um p88 (A, B) e uma p80 (C, D ) do mouse GLYT2-GFP. (A) Uma visão geral de uma choleratoxin subunidade-b (CTB) injecção na porção medial do MNTB. (B) células glicinérgica no VNTB são preenchidos com CTB (pontos lacrimais vermelho dentro da célula somata) como um resultado da injecção mostrada na Figura 5A. Alguns dos pontos lacrimais aparecer fora das células, o que pode ser indicativo de outros GFP-negativo (não-glicinérgica) tipos de células no VNTB ser preenchido, bem (por causa de fibras lesadas de passagem na área de injecção, por exemplo) . (C) Outra visão geral de uma injeção TRITC retrógrada visando a MNTB. Note-se, como um número de células é preenchido com TRITC no MNTB Após a electroporação (em oposição à CTB puramente injectada à pressão na Figura 5A). (D) marcação retrógrada de células VNTB glicinérgicas após uma injecção TRITC no MNTB (mesmo injecção como mostrado na Figura 5C). A maioria das células apresentam uma rotulagem amarelo ou laranja densa, por causa da mistura de dois sinais fluorescentes (a expressão da GFP nativa e o enchimento com o TRITC vermelho). Comparar com uma célula de GFP-positivas que, por algum motivoNão demorou até que o corante (seta azul) e uma célula de GFP-negativo marcado com traçador aparecendo profundamente vermelho e possivelmente cheio, por causa de uma lesão axonal na área de injeção (seta vermelha). Note-se a diferente padrão de coloração da célula somata em injecções de traçador retrógrado usando CTB (Figura 5B) e TRITC (Figura 5D). Barras de escala: As Figuras 5A e 5C: 200 uM, Figuras 5B e 5D: 20 um.
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Discussion
A força geral de in vitro tracer eletroporação, ao contrário de estudos in vivo de rastreamento, é que ele dá aos pesquisadores um melhor acesso à área do cérebro de juros e, portanto, não envolve estereotáxica caro (e muitas vezes eletrofisiológico) equipamentos. Além disso, o período de sobrevivência requerido para os explantes cerebrais abrange apenas algumas horas (1 - 4) em vez de dias ou mesmo semanas, no caso de in vivo injecções marcador (ver uma revisão detalhada sobre a utilização de aminas de dextrano e outros marcadores em em injecções vivo por Lanciego e Wouterlood, 22, 2011, mas também Rodriguez-Contreras et al., 2008 23), de modo que as injecções sem sucesso pode ser detectada tão cedo como durante o procedimento de injecção ou, o mais tardar, no dia seguinte, assim que os parâmetros da injecção pode ser ajustada em conformidade. O curto período de sobrevivência de explantes cerebrais também significa que há geralmente uma menor diferença entre o <em> eficaz (área, onde o corante foi recolhido por neurónios em anterógrada ou terminais axonais em injecções retrógradas) e a aparente (área onde o corante derramado, sem ser retomado) local da injecção, embora esta diferença pode não ser excluída completamente e só pode ser quantificado / controlado por post-hoc, que em alguns casos pode ser completamente impossível (ver Albrecht et al., 2014 para uma discussão mais detalhada 24).
Deve ser salientado, que as ligações de praticamente qualquer comprimento possa ser estudada com este método, desde que o experimentador é capaz de conservar tanto a injectada e a sua área alvo ou fonte área de projecções axonais em uma única peça de tecido cerebral. A visualização de tais ligações pode ser conseguido, quer através de reconstrução de pilhas confocal imagem adquiridas após o corte ea montagem do cérebro (como descrito aqui) ou todo o cérebro / cérebro técnicas de imagem laje após a execução de tecido claroprotocolos ING (ver secção 5 deste protocolo para um exemplo).
A principal vantagem da nossa técnica de eletroporação em vitro guiado por laser é o aumento significativo na precisão da focalização durante injeções traçadores. O método original de eletroporação in vitro baseia-se apenas o controle visual, visando determinados marcadores topográficos ou usá-los como guias aproximados para a área de injeção. O mesmo é verdade para a difusão do corante na área alvo: pode-se observar o corante de difusão, mas que não é fácil de controlar a propagação do corante de uma maneira mais fina. Com a modificação de laser deste método, um investigador pode facilmente encontrar núcleos e células de interesse e observar a difusão do corante na população núcleo / célula de interesse através da interacção da fluorescência geneticamente conduzido indígena e a fluorescência do corante. Assim, um pesquisador ganha mais controle sobre seu / sua experiência de rastreamento, minimizando falsos positivos em ântero ou retrógradaenchimentos, porque células / terminais axonais fora do núcleo / área de interesse foram preenchidos durante a injecção, bem. Obviamente, isto não significa que um controlo absoluto sobre o local eficaz de injecção, o que, como mencionado anteriormente, pode diferir do local aparente. Uma advertência desta técnica é, obviamente, a disponibilidade de organismos geneticamente modificados. Os ratos são um modelo genético organismo amplamente utilizado em estudos de mamíferos, o que também é válido para o campo acústico, mas alguns modelos de mamíferos pode ser considerada melhor, porque se assemelham a audiograma humana mais precisamente. Assim, podem ser empregues outras técnicas de etiquetar populações neuronais em animais de tipo selvagem de outras espécies mais adequada para um determinado tipo de campo de investigação (por exemplo, gerbos ou chinchilas em estudos do sistema auditivo 25-28): este pode incluir injecções virais aproveitando certos promotores visam somente certos compartimentos do cérebro e expressando fluoresmarcadores ent em apenas um subconjunto de células cerebrais. Naturalmente, um cuidado especial deve ser tomado para assegurar a validade das construções genéticas expressas na subpopulação direito de neurônios, não importa se tais construções são expressos de forma viral em animais de tipo selvagem ou autóctone em knock-in linhas de mouse.
Como apontado anteriormente, a vantagem de ratos mutantes que expressam proteínas fluorescentes em determinadas subpopulações de neurônios também permite a caracterização funcional de circuitos do cérebro (no nosso caso, fomos capazes de caracterizar projeções inibitórias de um núcleo auditivo de tronco cerebral para outro 24 por pura visualização de os resultados de nossas experiências de rastreamento). Mais uma vez, a validade das construções genéticas expressas deve ser confirmado antes de qualquer interpretação dos resultados das experiências de rastreio pode ter lugar.
Outra força geral de eletroporação in vitro é a sua compatibilidade com othmétodos anatômicos de er, tais como (imuno) histoquímica e compensação cérebro. Como demonstrado previamente 24, não é afectada pela aplicação de técnicas de coloração de Nissl adicionais, tais como, ou um método de compensação do cérebro chamada ClearT2 12 20,24. A principal desvantagem que se tem que ter em mente é que a profundidade de penetração de Nissl e manchas de anticorpos diminui com o aumento da espessura do tecido, de modo que a pessoa tem que pesar as opções de preservação processo axonal em fatias mais grossas contra a força do sinal de adicional (imuno) histoquímica coloração em experimentos onde são necessários ambos os métodos de rotulagem anatômicas. Claro, outro fator a considerar é a separação de banda excitação / emissão dos diferentes marcadores fluorescentes, uma vez que o número mínimo de rótulos começa às três marcadores neste momento (a expressão da proteína fluorescente indígena, tracer e Nissl / rotulagem de anticorpos).
Obviamente, o nosso método descrito pode ser expandido parainjecções de qualquer tipo de marcadores fluorescentes (incluindo grânulos quânticos) em explantes cerebral ou mesmo fatias de cérebro de ratinhos transgénicos. Desde a precisão injeção depende tanto, uma clara detecção alvo (a observação de fluorescente etiquetado núcleos e células) e um controle mais preciso sobre o vazamento do corante fluorescente, apenas um desses dois fatores devem ser suficientes para aumentar a precisão da injeção, mesmo quando o outra está ausente. Isto significa que os diferentes marcadores não fluorescentes (tais como construções virais ou outros vectores DNA / RNA) pode ser injectado com uma maior precisão em núcleos do cérebro de interesse, desde que os núcleos de alvo são claramente visíveis para o experimentador. Esta última aplicação é particularmente interessante, porque a electroporação não permitir a absorção eficaz de material de ADN, bem como 29-30, tornando o nosso método de quase ideal para este tipo de preparações injectáveis. A única desvantagem de que necessita de ser considerada é que as construções de ADN ter tempo para expressar e o problema de ti vivopreservação ssue surge. Isso pode ser superado através do estabelecimento de culturas fatia organotípicas cerebrais 31-32 baseado em fatias cerebrais injetados (ou blocos de tecido cerebral re-cortado), que permitem a preservação de tecido vivo no fim de semana.
E, claro, outros mutantes de ratinhos transgénicos podem ser utilizados para investigar a ligação de outros tipos neuronais como neurónios colinérgicos (por exemplo, em ratinhos de ChAT-GFP 33), tornando este método de uma ferramenta versátil para estudar a conectividade e a funcionalidade do cérebro (micro circuitos).
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Disclosures
Não temos nada a divulgar.
Acknowledgments
Financiado pelo NIH / NIDCD R01 DC 011582. experimentos de imagem foram realizados na Universidade do Colorado Anschutz Medical Campus Avançado Microscopia de Luz Núcleo apoiado em parte pelo NIH / NCRR Colorado CTSI Grant Número UL1 RR025780 e os Transtornos Rocky Mountain Neurlogical Núcleo Centro Grant NIH P30NS048154. Dr. Sascha du Lac, do Instituto Salk nos forneceu os ratos GLYT2-GFP.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | All chemicals are from Sigma-Aldrich, unless noted otherwise. |
| Potassium chloride | P9333 | ||
| Potassium phosphate monobasic | P5655 | ||
| Sodium phosphate di-basic | S907 | ||
| Magnesium chloride | M2670 | ||
| Calcium chloride | C5080 | ||
| Glucose | G7528 | ||
| Sodium bicarbonate | S6297 | ||
| Ascorbic acid | A4544 | ||
| Myo-inositol | I5125 | ||
| Sodium pyruvate | P2256 | ||
| Bovine serum albumine | A2153 | optional, for additional (immuno)histochemistry | |
| Triton-X-100 | X100 | optional, for additional (immuno)histochemistry | |
| Poly(ethylene glycol), 8000 MW | P2139 | optional, for brain clearing | |
| Formamide | Fisher Scientific | F84 | optional, for brain clearing |
| Choleratoxin subunit-b | Molecular Probes | C-34776 (Alexa 555) | |
| Dextrane tetramethyl-rhodamine | Molecular Probes | D-7162 (Alexa 555) | |
| Fluorescent Nissl | Invitrogen | N-21479 (blue) | optional |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | SF93 | |
| Agarose | Invitrogen | 16520 | |
| Fluoromount-G | Southern Biotech | 0100-01 | |
| Pentobarbi-tal | Vortech Pharmaceuticals | Fatal-Plus | |
| Borosilicate glass filaments | Harvard Apparatus | G150F-10 | |
| Pipette puller | Zeitz Instruments, Germany | DMZ Universal Puller | |
| Perfusion setup | Custom-made | ||
| Laser pointer | laserpointerpro.com, Hong Kong | HK-88007294 (405 nm) | |
| Filter/safety goggles | Dragon Lasers, China | LSG09 (band-pass 450-700 nm) | |
| Bionocular microscope | Wild Heerbrugg, Switzerland | Wild M3 | Equipped with high-intensity illuminator (MI-150; Dolan-Jenner Inc.) |
| Picospritzer | Parker Instruments | Picospritzer III | |
| PC with installed MC Stimulus software | Multi Channel Sys-tems, Germany (software) | ||
| 2-channel stimulator | Multi Channel Sys-tems, Germany | STG-1002 | |
| Stimulation isolation unit | A.M.P.I., Israel | Iso-Flex | |
| Micromanipulator | Narishige, Japan | YOU-1 | |
| Vibratome | Leica, Germany | VT1000S |
References
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