Summary
Мы описываем технику, чтобы маркировать нейроны и их процессы с помощью Антероградный или ретроградная трассирующих инъекций в ядрах головного мозга с использованием препарата в пробирке. Мы изменили существующий метод из п я пробирке трассирующими электропорации, воспользовавшись флуоресцентно меченного мутантов мыши и основную оптического оборудования с целью повышения точности маркировки.
Abstract
Мы представляем технику, которая сочетает в себе пробирке протокол в трассирующими впрыска, которая использует серию электрических импульсов и давления, чтобы увеличить поглощение красителя через электропорации в мозг эксплантов с целевой лазерной подсветки и соответствующих фильтров очки во время процедуры. Описанная методика электропорации в пробирке по себе дает относительно хорошее визуальное управление для таргетинга определенные участки мозга. Объединив его с лазерным возбуждением люминесцентных генетических маркеров и их чтения через фильтр очки группы обход, который может забрать выбросов генетически меченых клеток / ядер и красителя трассировки флуоресцентного, исследователь может существенно повысить точность инъекций находя интересующую область и контроля за распространением красителя / поглощения в области инъекции гораздо более эффективно. Кроме того, этот метод лазерного излучения позволяет исследовать функциональные возможности данного neurocircuit по провiding информацию о типе нейронов, в определенной области в тех случаях, когда выражение GFP связана с типом передатчика, выраженного субпопуляции нейронов.
Introduction
Для того, чтобы определить определенный нейронов (микро) схема, надо начать с поиска различных участников указанной схеме, и их способа подключения. С тех пор, публикация Уоллера о neurofiber трассировки через lesioning 1 большое разнообразие методов нейроанатомической трассировки был создан. Некоторые из этих методов может быть применен в фиксированной ткани вскрытии 2-4, другие полагаются на активном переносе красителя в живых нейронов, а обнаружен в 1971 5-6. Последнее может быть далее подразделены на две группы различения методов воспользовавшись активного ретроградный (от введенного области к источнику заданной проекцией, т.е.. В somata нейронов, которые проецируют на указанный участок) и активным антероградную (от вводят площадь к цели в данной проекции, то есть. аксонов прогнозов и аксонов терминалов меченых нейронов) транспорта. Кроме того, в некоторых случаях TRACER материал вводят в живых животных, которые затем пережить инъекции несколько дней или недель (в естественных условиях трассирующих инъекций), в то время как в других случаях вводят эксплантированных мозги и инкубировать в течение нескольких часов после инъекции в области искусственного спинномозговой жидкости (в пробирке трассирующими инъекции) ,
В этом протоколе мы изменили существующий в пробирке техники электропорации 7-8 маркировать нейронов somata и процессы в Антероградный и ретроградной трассировки экспериментов с использованием choleratoxin субъединицы-б и тетраметилродамин декстран как след веществ. Общая цель этого протокола состоит в обеспечении нейрофизиологов с эффективным инструментом, чтобы проследить закономерности нервных подключения между различными ядрами головного мозга, в то время как воспользовавшись доступных трансгенных линий мышей и основной оптического оборудования с целью повышения точности ориентации во трассирующих инъекций. Хотя метод Антероградный и ретроградной трассировки с помощьюcholeratoxin и декстран амин и их соответствующие флуоресцентно меченных конъюгатов не нова 9-13 (как это метод электропорации, например. Хаас и др. 14), сочетание индикаторных инъекций с электропорации в подготовке в пробирке с участием блоков ткани головного мозга является более недавнее развитие 7. Основное преимущество над методами нейронных трассировку и тот же тип меченых красителей в живых животных является увеличение интенсивности маркировки, из-за более высокой эффективности, с которой электропорации краситель быть занимаемого нейронов. Дополнительным преимуществом является укороченный инкубационный период (необходимое для транспортировки красителя) и его повышенная точность целевого во время инъекции трассирующей, потому что экспериментатор визуальный контроль над целевой области инъекции. Последнее также означает, что нет дороже стереотаксической оборудование не требуется, чтобы найти ядро или мозга сферу интересов.
Для дополнинально повысить адресности, мы воспользовались трансгенной линии мышей, которая выражает GFP в глицинергических субпопуляции нейронов 15 и основной оптического оборудования, состоящих из ручного лазерного указателя 405 нм фильтрации длины волны и соответствующий полосовой очки (450 - 700 нм). Таким образом, мы достигли значительного дальнейшего увеличения ориентации точность путем идентификации области инъекции через флуоресцентного сигнала и обеспечивая более тонкую способ управления для распространения красителя в зоне впрыска путем наблюдения за взаимодействием между сигналом коренного GFP и индикатором флуоресценции. Наша методика позволяет также раскрыть функциональность схеме вместе с его подключения путем выявления GFP-положительных тормозящих нейронов (или возбуждающих в других линий мышей), которые были заполнены с индикатора.
В целом, мы усиливается мощный инструмент Нейрологическая изучать Коннектом позвоночных мозг и оценки тон разные нейроанатомические особенности данной neurocircuit. С помощью трансгенных мышей наряду с недорогой и широко доступный оптического оборудования мы смогли значительно увеличить точность ориентации наших инъекций. Кроме того, трансгенные мыши, позволили нам определить тип прослеженных соединений, которые помогли раскрыть функциональность тормозного микросхемы в слуховой мозга.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Оптический генотипирование
1. Оптический генотипирование мыши Щенки
- Проверка на экспрессию соответствующих флуоресцентным маркером, используя лазерный указатель соответствующего длине волны возбуждения (405 нм в экспериментах, описанных здесь), и соответствующий фильтр очки, блокирующие длины волны возбуждения, но прохождения волны излучения (450 - 700 нм в экспериментах, описанных здесь) , Направьте лазерный указатель на задней части головы или спинного мозга щенка мыши (рисунок 1). Избегайте светит лазер в глаза и длительного воздействия на кожу лазерного света.
2. Оптический генотипирование пожилых животных
- Глубоко обезболить мышь (в возрасте до P14 P138 в экспериментах, описанных здесь) с передозировкой пентобарбитала через внутрибрюшинного введения (120 мг / кг массы тела). Подтвердите правильное анестезии, проверяя рефлексы животного (кратко зажать кончик гое ухо или один из задних ног, чтобы вызвать рефлекс втягивания в уха или ноги).
- Примечание: Несмотря на использование передозировки пентобарбитала (120 мг / кг массы тела) мы ссылаемся на процедуры инъекции в "глубокой анестезии" вместо эвтаназии, потому что животное идеально жив (т.е. его сердце все еще бьется), когда хирургии и перфузии начать. Это обеспечивает более эффективное кровоснабжение внутренних органов, включая головной мозг.
- После того, как животное не показывает каких-либо рефлексы, осторожно снимите кожу, покрывающий череп (рис 2а), сделав надрез в коже, покрывающей заднюю часть головы и резки в средней части черепа. Защиту непокрытого череп к лазерным светом и наблюдать флуоресценцию через очки с фильтром, как описано выше. Если наблюдается положительный сигнал GFP, перейдите к шагу 2, если нет, пожертвовать животное через обезглавливание (второй / обеспечение формы эвтаназии после нашегоПравила IACUC).
Примечание: В даже старых мышей (> 1 месяца) флуоресценции можно наблюдать через глаза животного.
2. Transcardial перфузии и мозг Подготовка
- Заливать транскардиальную охлажденным на льду фосфатно-солевом буфере (PBS; NaCl: 137 мМ, KCl: 2,7 мМ, KH 2 PO 4: 1,76 мМ Na 2 HPO 4: 10 мМ) с помощью шприца иглу 30 G в значительной степени удалить кровь из животное.
- Во-первых, тщательно открыть грудную клетку с острыми ножницами и затем толкать иглу в левый желудочек сердца. Начало прокачки PBS в сердце и аорту и сразу после этого шага открыть правое предсердие сердца с ножницами, чтобы позволить крови, чтобы выйти из тела. Примечание: перфузии занимает 5 - 10 мин в зависимости от размера животного.
- После обескровливания через перфузии, обезглавить животное, обеспечить его голову контактный пeedles (или 30 г шприц иглы), прокалывая их через глазницы в подготовке блюдо и удалить мозг из черепа.
- Во-первых, используйте острые ножницы, чтобы отрезать кожу наложения череп: сделать небольшой разрез в задней части головы, а затем разрезать вдоль средней линии на спинной стороне головы, разрезанная по бокам просто каудально глаз животного и, наконец, снижение в каудальном направлении, чтобы полностью удалить закрылки кожи на задней части головы.
- Затем повторите то же самое резки шаблон для самого черепа, убедитесь, что обе улитки удалить в процессе, потому что это существенно упростит удаление ствола мозга в конце концов. После этой процедуры хвостовой половина мозга должна лежать полностью подвержены.
- На следующем этапе, использовать острым лезвием бритвы или скальпель, чтобы прорезать весь передний мозг под углом около 45 ° и примерно 2 мм ростральной из мозжечка. Выкопайте отделенной передней части мозга с АБЛОР шпатель.
- Используйте лопаточку, чтобы поднять хвостовой половину мозга на его ростральной конце, а затем разрезать черепных нервов, которые все еще подключен к ствола мозга на его вентральной стороне. В качестве конечного результата, хвостовой половина мозга, включая ствол мозга должны свободно падать остальной части головы животного подготовленной.
- Переверните удалены хвостовой половину мозга, чтобы разоблачить его брюшной стороне и разрезать вдоль фронтальной плоскости только ростральной (для Антероградный инъекций) или просто хвостовой (для ретроградных инъекций) из вентрально расположенных "луковиц", содержащих тело трапециевидную (см шаг 2.3).
- Всегда используйте острый нож или бритва скальпель для разрезания, чтобы минимизировать гибель клеток, вызванную чрезмерной механической нагрузки на ткани. Как конечный результат, должны были получен эксплантов мозга, охватывающих около 1 см в длину и содержит полный комплекс верхнем оливарном вдоль других областях мозга.
Примечание: Этот протокол показывает процедуру индикаторного инъекции в организм трапеции, расположенной в слуховой мозга. Адаптация местоположение и ориентацию режущих плоскостей и местах инъекций по мере необходимости. Если флуоресцентных области мозга, представляющие интерес лежат достаточно близко к поверхности мозга, так что они могут быть идентифицированы и введенного без разрезания мозг (рис 2B), то корональной шаг резания может быть опущен.
- Определить тело трапециевидную как два брюшных видных "луковиц", содержащих брюшной ядро тела трапеции (VNTB).
Примечание: Для получения дополнительной анатомической ссылкой о приблизительной стереотаксической расположения этих режущих плоскостей, см Франклин & Paxinos, 2008. Панель 78 атласа, брегмы ~ -5.7 мм показывает медиального ядра тела трапеции (= MNTB) помечены как "Tz ". Панель 69 показывает брюшной ядро трапециевидного боду (VNTB) помечены как "MVPO" (medioventral periolivary ядра) 19.
3. Антероградный / Ретроградная Трассировка
Примечание: Выполните все следующие процедуры при комнатной температуре (25 ° C).
- После резки, поместите коротколатентных эксплантов в подготовке блюдо с кислородом (95% O 2, 5% 2 СО) рассекает решение (NaCl: 125 мМ, KCl: 2,5 мм, MgCl 2: 1 мм, CaCl 2: 0,1 мМ, глюкоза : 25 мм, NaH 2 PO 4: 1,25 мм, NaHCO 3: 25 мм, аскорбиновую кислоту: 0,4 мМ, миоинозитола: 3 мм, пировиноградная кислота: 2 мМ), закрепив его с 30 г иглы шприц. Убедитесь, что область нагнетания вверх.
- Извлеките инъекции пипетки из боросиликатного стекла и заполнить их с одним из следующих трех растворов: а) 1,0 мг / мл раствора choleratoxin субъединица B-конъюгированный с Alexa 555 флуорофора в PBS 12-13 (используется в основном для ретроградного транспорта), б ) 1% -dilution в 0,9% физиологического раствора декстрана тетраметилродамин 555 (3000 МВт, в основном используется для ретроградного транспорта) или в) 1% -dilution в 0,9% физиологического раствора в 10000 МВт декстран-TRITC 555 (в основном используется для транспортировки антероградной).
- Убедитесь, что диапазон инъекции пипеток сопротивлений от 2,5 до 3,5 МОм и что они производятся в 3 - 4 тянущих циклов. Для экспериментов, описанных здесь, достичь этого путем выбора предварительно запрограммированных потянув алгоритм на пипетки съемника.
- Осветите эксплантов мозга, используя статически установлен лазерный указатель с соответствующей длиной волны (№ 2 на рис 3А; 405 нм длина волны в экспериментах, описанных здесь). Используйте лазерный указатель в качестве руководства для инъекций, и цель лазерного луча в флуоресцентно-меченного ядра головного мозга или клеток, представляющих интерес, которые будут выводиться.
- Найти и наблюдать освещенную целевую область через бинокулярный микроскоп, а носить очки совместимые фильтр (450 - 700 нм полосовой фильтр в экспериментах, описанных здесь). Вставьте впрыска электрод через микроманипулятора в интересующей области.
- Внедрить трассирующими вещество. Инъекции состоят из 2 - 10 импульсов давления при 15 фунтов на квадратный дюйм в течение 50 мс каждый, используя давление впрыска устройство, направленное перпендикулярно в области процентной (ROI) в разделе мозга. Администрирование каждого импульса давления с интервалом в 10 - 15 сек, чтобы позволить краситель распространяться.
- В случае тетраметилродамин (TRITC) инъекций, дополнительно стимулировать электрически для повышения поглощения красителя через электропорации с электродом, расположенным в районе мозга интереса (MNTB и VNTB в экспериментах, описанных здесь).
- Используйте 8 TTL импульсы 8 вольт в течение 50 мс с 50 мс интервалами межимпульсных, с приводом от стимулятора и усиливается до 55 V с блоком изоляции стимуляция (пункты № 7 и 9 на рис 3B). Используйте 10 - 20 повторений этого протокола, Adminisубито в течение нескольких минут 7,8. Убедитесь, что на землю электрод должным образом - провод заземления должен быть подключен к решению ванны!
- Проверьте для успеха инъекции. Поскольку люминесцентные трассирующими с большей длиной волны излучения также испускать флуоресцентный сигнал при лазерном возбуждении коротких длин волн, визуально проверить на поглощение красителя / распространение в закачиваемой целевой области при освещении площади с лазером и наблюдая через очки фильтров.
4. Инкубация
- После инъекции, инкубировать brainstems в кислородом искусственной цереброспинальной жидкости (ACSF; NaCl: 125 мМ, KCl: 2,5 мМ, MgCl 2: 1 мМ, CaCl 2: 2 мМ, глюкоза: 25 мм, NaH 2 PO 4: 1,25 мм, раствором NaHCO 3: 25 мм, аскорбиновую кислоту: 0,4 мМ, мио-инозит: 3 мм, пировиноградная кислота: 2 мм, продувают 95% O 2 - 5% CO 2) при комнатной температуре (RT, 25 ° С) в течение 1 - 4 ч, в то время каккраситель транспортируется. Пузырь решение в течение всего инкубационного периода.
- Впоследствии передачи brainstems в 4% параформальдегида (PFA), растворенного в PBS (примерно 100 мл; Ph. 7 для смеси PFA / PBS) и инкубируют их при 4 ° С, чтобы позволить пост-фиксацию в течение ночи (O / N).
5. Ткань для нарезки и монтажа
- На следующий день, мыть ствола головного мозга в три раза PBS (5 мин на каждой стадии промывки), рассматривать его в 4% агара, а затем нарезать 50 - 80 мкм толстыми ломтиками на vibratome. Ломтики монтирования при помощи монтажного среду на предметное стекло, покровное и.
- При желании, маркировать участки с флуоресцентным Ниссля в течение 25 мин (например синий Нисслю в 1: 100 разведения в АБ СМИ).
- Для подготовки AB СМИ, смешать 250 мл 0,2 М фосфатного буфера (PB; 51 мм KH 2 PO 4, 150 мМ Na 2 HPO 4), 15 мл 5 М NaCl, 15 мл 10% Тритон-X, 220 мл DDH 2 O и 5 г бычьего сывороточного альбумина.
- Товар доступенде и добиться успеха в маркировке шаг Ниссля на 3 стадии промывки в PBS (10 мин каждый).
Примечание: В случаях, когда более толстые участки должны быть установлены и проанализированы (в описываемых экспериментах такие срезы 100 - 500 микрон, чтобы сохранить аксонального соединения через большие расстояния), метод можно сочетать с тканевой очистки. Мы нашли ClearT2 12, чтобы быть успешным 20. Когда шаг ткани очистка включена, выполните его перед установкой секций.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Цифры 1 и 2 показывают, как лазерная указка и лазерные очки можно использовать для быстрого и недорого генотипу GFP положительные животных из помета. В тех случаях, молодых детенышей мыши, методика может быть использована для неинвазивного определения GFP метку в головном мозге животного через череп и вышележащей кожи (фиг.1А - D). Излучение флуоресценции можно увидеть через кожу и череп щенков мыши по крайней мере до 3 день постнатального (рис 1c). Процедура показана на рисунке 1 для нашего зеленого флуоресцентного белка (GFP) помечены линии мыши, выражающее GFP в глицинергических субпопуляции нейронов (GlyT2-GFP). В старых животных с более толстыми черепа и пигментированной кожи, этикетка GFP менее показывает через кожу и кости, и, следовательно, кожа на голове и / или шеи должен быть удален перед оптическим генотипирования (фиг.2А).
После перфузииживотное мозг извлекают и снова освещена, чтобы найти флуоресцентно меченных ядра интерес. Светлые структуры, которые загораются рядом с вентральной поверхности ствола мозга на рисунке 2B являются два вентральных ядер тела трапеции, которую мы использовали и как гид и цели для наших трассирующих инъекций. 4 и 5 показывают репрезентативные результаты антероградной инъекции в брюшной ядра тела трапеции (VNTB) с помощью тетраметилродамин декстран (TRITC; рис. 4) и два ретроградных инъекции в медиальном ядре тела трапеции (MNTB), используя choleratoxin субъединицы B (CTB; Рисунки 5A и Б) и TRITC (фиг 5С и D). Яркий аксонов маркировка с указанием (в данном случае тормозных) проекций из VNTB в MNTB можно увидеть следуя антероградной инъекции в VNTB (рисунок 4). На рис 5А и 5С показывают обзор по участкувпрыска (MNTB) с ядром, содержащим ретроградно меченых клеток (VNTB) рядом с ним. рис 5B и 5D шоу увеличенных изображений ретроградно меченых somata из глицинергических VNTB клеток в тех же разделах, как показано на рисунке 5А и 5С. Обратите внимание, как ретроградная трассировка с CTB приводит к более точечной узором 12-13 (рис 5B), в то время как VNTB клетки ретроградно меченные TRITC отображения очень плотную Гольджи, как маркировка 21 (рис 5D).
Фигура 1:. Оптическое генотипирование GlyT2-GFP-положительных и GlyT2-GFP-отрицательных мышей GFP-положительных мышей были сфотографированы под (A) нормальных условиях освещения, (б) после лазерного излучения с лазерным указателем в 405 нм без зелено- фильтрующие очки и (C)при лазерном освещении лазерных и ультрафиолетовых защитных очков. Сильный сигнал GFP видна в выше мозжечка и ствола мозга области. (D), напротив, GlyT2-GFP-отрицательный щенки из той же линии мыши и возраста (p2) не показывают каких-либо признаков флуоресценции в тех же районах ( Задняя часть головы и спинного мозга). Синий свет лазера эффективно фильтруется очки.
Рисунок 2: Оптический генотипирование и Подготовлено мозга эксплантов. Череп (A) P4 GlyT2-GFP мышки щенка не подвергается лазерной подсветки и смотреть через полосовая фильтрация очки. Флуоресцирующих GFP может наблюдаться через череп. (Б) эксплантов мозга из одного щенка в препарате блюдо при лазерном освещении, как видно через фильтрующие очки. Глицинергических аксонов и ядер головного мозга, такие как брюшной ядра тела трапеции (VNTB) можно рассматривать как вертиу ярко структуры, близкие к поверхности мозга.
Рисунок 3: Обзор Над In Vitro давление впрыска и электропорации установки. (А) 1: Стереоскоп, 2: установлен лазерный указатель (405 длин волн нм), 3: headstage с впрыском пипетки монтируется на микроманипулятора, 4: подготовка посуды, содержащая эксплантов мозга, 5: ПК с установленным программным обеспечением MC стимул, 6: Устройство давление впрыска, подключен к инъекционной пипетки через трубку (В). 7: блок стимулом изоляция, 8: высокой интенсивности подсветки, 9: стимулятор. Стимулятор подключен к электроду в пипетку через изолятор стимуляции и приводится в ПК.
Рисунок 4: Антероградный Отслеживание тормозных связей от VNTB до медиального ядра трапеции органа (МНТБ). Показана максимальная проекция конфокальной стек, принятым в горизонтальном сечении, охватывающей около 200 микрон в глубину на свободном мозгу p14 GlyT2-GFP мыши. После тетраметилродамин декстран (TRITC) инъекции в caudo-медиальной части VNTB, ярко помечены аксонального соединения (а в некоторых случаях их терминальные окончаний) из VNTB до MNTB можно наблюдать. Масштаб бар: 200 мкм.
Рисунок 5:. Ретроградные Tracer Инъекции в MNTB Reveal Заполненные глицинергических Клетки в VNTB показаны максимальные выступы софокусных стеки, принятых в корональных ломтиками P88 (A, B) и Р80 (С, D (охватывающий более примерно 50 мкм.) ) GlyT2-GFP мыши. (А) показан общий вид choleratoxin субъединицы B (CTB) инъекции в медиальной части MNTB. (Б) глицинергических клетки в VNTB заполнены КТВ (красный Puncta внутри клеток somata) в результате введения, показанного на фиг.5А. Некоторые из Puncta появляются за пределами клетки, которые могли бы свидетельствовать о других GFP-отрицательные (не глицинергических) типов клеток в VNTB заполнения, а также (из-за поврежденных волокон проход в области инъекции, например) . (С) Другой обзор ретроградной инъекцией TRITC таргетирования MNTB. Обратите внимание, как число клеток заполнена TRITC в MNTB следующие электропорации (в отличие от чисто давления впрыска CTB на фиг.5А). (D) ретроградный маркировка глицинергических VNTB клеток после инъекции TRITC в MNTB (же инъекции как показано на рисунке 5С). Большинство клеток отображения плотный желтый или оранжевый маркировки, из смеси двух флуоресцентных сигналов (выражение коренного GFP и заполнение с красным TRITC). Сравнить с GFP-положительных клеток, которые по некоторым причинамне взять краску (синяя стрелка) и трассирующими меченных GFP-отрицательные клетки, появляющиеся глубоко красный и, возможно, заполнены, из-за травмы аксонов в области инъекции (красная стрелка). Обратите внимание на различное окрашивание образец клеток somata в ретроградных инъекций трассирующих использованием CTB (рис 5B) и TRITC (рис 5D). Масштабной линейки: Фигуры 5A и 5C: 200 мкм, рис 5B и 5D: 20 мкм.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Общая численность в пробирке индикаторного электропорации, в отличие от исследований в естественных условиях отслеживания, является то, что дает исследователям лучше доступ к области мозга интерес и, следовательно, не предполагает дорогостоящего стереотаксической (и часто электрофизиологическое) оборудования. Кроме того, период выживания требуется для эксплантов мозга охватывает только несколько часов (1 - 4), а не дней или даже недель в случае в естественных условиях трассирующих инъекций (см подробный обзор по использованию декстрана аминов и других индикаторов в в естественных условиях вливаний Lanciego и Wouterlood 2011 22, но также Родригес-Контрерас, др., 2008 23), так что неудачные инъекции могут быть обнаружены уже в ходе процедуры инъекции или позднее, на следующий день, так что что параметры впрыска могут быть соответствующим образом скорректированы. Короткий период выживания для эксплантов мозга также означает, что, как правило, меньше разница между <EM> эффективным (площадь, где краситель был рассмотрен нейронов в Антероградный или аксонов терминалов в ретроградных инъекций) и очевидной (область, где краситель вытечет, без принимаются до) места введения, хотя эта разница не может быть исключено, полностью и могут быть количественно / контролировали ретроспективном, которые в некоторых случаях могут быть совершенно невозможно только (см Альбрехт и др., 2014 для более подробного обсуждения 24).
Следует отметить,, что соединения практически любой длины могут быть изучены с помощью этого метода, при условии, что экспериментатор может сохранить и области инъекции и целевую или исходный площадь аксонов проекций в виде единой детали из ткани головного мозга. Визуализация таких соединений может быть достигнуто путем либо реконструкции конфокальных стеками изображения, полученных после разрезания и монтажа мозг (как описано здесь) или цельного мозга / методов визуализации головного мозга плиты после выполнения ткани четкоеING протоколы (смотрите раздел 5 в этом протоколе в качестве примера).
Основным преимуществом нашей методики с лазерным наведением в пробирке электропорации является значительное увеличение адресности во трассирующих инъекций. Оригинальный метод экстракорпорального электропорации в опирается лишь на визуальный контроль, направляя определенные топографические маркеры или используя их в качестве приближенных направляющие для области инъекции. То же самое справедливо для распространения красителя в целевой области: можно наблюдать краситель распространения, но это не так легко контролировать распространение красителя в более тонкой образом. С лазерной модификации этого метода, исследователь может легко найти ядра и клетки интерес и наблюдать распространение красителя в ядро / клеточной популяции интереса путем взаимодействия коренного генетически приводом флуоресценции и флуоресценции красителя. Таким образом, исследователь получает через больший контроль над его / ее опыте розыска по минимизации ложных срабатываний в передне или ретрограднаяпломбы, потому что клетки / аксонов терминалов за пределами ядра / области интересов были заполнены во время инъекции, а также. Очевидно, что это не означает полный контроль над эффективного месте инъекции, который, как уже упоминалось ранее, может отличаться от видимого участка. Предостережение этой техники, очевидно, наличие генетически модифицированных организмов. Мыши широко используется генетическая модель организм в исследованиях млекопитающих, который также относится к слуховой области, но некоторые модели млекопитающих можно считать лучше, потому что они более точно напоминают человеческую аудиограммы. Таким образом, другие методы могут быть использованы для обозначения популяции нейронов в дикого типа животных других видов, лучше подходят для определенного типа научно-исследовательской области (например, песчанки или шиншилл в исследованиях слуховой системы 25-28): это может включать вирусные инъекции, принимая преимущество некоторые промоутеры, направленные только определенные отсеки мозга и выражающей fluorescЛОР маркеры только подмножество клеток головного мозга. Естественно, дополнительная забота должна быть взята, чтобы гарантировать справедливость высказанных генетических конструкций в правой субпопуляции нейронов, независимо от того, выражены такие конструкции вирусно в дикого типа животных или исконно в плей-в мышей линий.
Как указывалось ранее, преимущество мутантных мышей, экспрессирующих флуоресцентные белки в некоторых субпопуляций нейронов также позволяет функциональные характеристики схемы мозга (в нашем случае мы смогли охарактеризовать тормозящее прогнозов на один слуховой ствола головного мозга ядра к другому 24 по чистой визуализации результаты наших экспериментов розыска). Опять же, срок действия выраженных генетических конструкций должна быть подтверждена до того, интерпретация результатов экспериментов трассировки может иметь место.
Еще один общий сила электропорации в пробирке является его совместимость с дрэр методы анатомические, такие как (иммуно) гистохимии и очистки мозга. Как показано ранее 24, это не влияет на применение дополнительных методов окрашивания, таких как Ниссля, или способ очистки мозга под названием ClearT2 12 20,24. Основным недостатком, что нужно иметь в виду, что глубина проникновения Ниссля и антител пятен будет уменьшаться с увеличением толщины ткани, поэтому нужно взвесить варианты аксонов сохранения процесса в толстых ломтиков против силы сигнала дополнительного (иммуно) гистохимической окрашивание в экспериментах, где оба анатомические методы маркировки не требуется. Конечно, еще одним фактором, чтобы рассмотреть, является возбуждение / излучение разделение полосы пропускания различных флуоресцентных меток, так как минимальное количество этикеток начинается в трех маркеров в этой точке (выражение коренных флуоресцентный белок, копира и Нисслю / маркировки антитела).
Очевидно, что наша описанный способ может быть расширен доинъекции любого вида флуоресцентных маркеров (в том числе квантовых бисером) в эксплантов мозга или даже головного мозга ломтиками трансгенных мышей. Так как точность впрыска зависит от обоих, четкое определение целевой (наблюдение флуоресцентно меченых ядер и клеток) и контрольный тоньше по разлива флуоресцентным красителем, только один из этих двух факторов должно быть достаточно для повышения точности впрыска, даже если Другое отсутствует. Это означает, что различные без флуоресцентных маркеров (например, вирусных или других конструкций / РНК ДНК-векторов) может быть введен с большей точностью в мозг ядер интерес, при условии, что ядра мишени отчетливо видны экспериментатору. Этот последний приложение особенно интересно, поскольку электропорации действительно позволяет для эффективного поглощения материала ДНК, а также 29-30, что делает наш метод почти идеальным для этого типа инъекций. Единственный недостаток, который должен быть рассмотрен, что ДНК-конструкции потребуется время, чтобы выразить и проблемы живого тиСГУП сохранение возникает. Это может быть преодолена путем установления органотипической мозга срез культуры 31-32 на основе введенных срезах мозга (или повторно нарезанный ткани мозга блоков), которые позволяют для сохранения живой ткани на заказ недель.
И, конечно, другие трансгенные мыши-мутанты могут быть использованы для исследования связности других типов нейронов, как холинергических нейронов (например, в чат-GFP мышей 33), что делает этот метод универсальным инструментом для изучения возможности подключения и функциональность мозга (микро) схемах.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Мы не имеем ничего раскрывать.
Acknowledgments
Поддерживается NIH / NIDCD R01 DC эксперименты 011582. визуализации были проведены в университете Колорадо Anschutz Medical Campus Расширенный световой микроскопии Ядра при частичной поддержке NIH / NCRR Колорадо аст номер гранта UL1 RR025780 и расстройств Скалистые горы Neurlogical Core Center Грант NIH P30NS048154. Д-р Саша дю Лак из Института Солка предоставил нам мышей GlyT2-GFP.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | All chemicals are from Sigma-Aldrich, unless noted otherwise. |
| Potassium chloride | P9333 | ||
| Potassium phosphate monobasic | P5655 | ||
| Sodium phosphate di-basic | S907 | ||
| Magnesium chloride | M2670 | ||
| Calcium chloride | C5080 | ||
| Glucose | G7528 | ||
| Sodium bicarbonate | S6297 | ||
| Ascorbic acid | A4544 | ||
| Myo-inositol | I5125 | ||
| Sodium pyruvate | P2256 | ||
| Bovine serum albumine | A2153 | optional, for additional (immuno)histochemistry | |
| Triton-X-100 | X100 | optional, for additional (immuno)histochemistry | |
| Poly(ethylene glycol), 8000 MW | P2139 | optional, for brain clearing | |
| Formamide | Fisher Scientific | F84 | optional, for brain clearing |
| Choleratoxin subunit-b | Molecular Probes | C-34776 (Alexa 555) | |
| Dextrane tetramethyl-rhodamine | Molecular Probes | D-7162 (Alexa 555) | |
| Fluorescent Nissl | Invitrogen | N-21479 (blue) | optional |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | SF93 | |
| Agarose | Invitrogen | 16520 | |
| Fluoromount-G | Southern Biotech | 0100-01 | |
| Pentobarbi-tal | Vortech Pharmaceuticals | Fatal-Plus | |
| Borosilicate glass filaments | Harvard Apparatus | G150F-10 | |
| Pipette puller | Zeitz Instruments, Germany | DMZ Universal Puller | |
| Perfusion setup | Custom-made | ||
| Laser pointer | laserpointerpro.com, Hong Kong | HK-88007294 (405 nm) | |
| Filter/safety goggles | Dragon Lasers, China | LSG09 (band-pass 450-700 nm) | |
| Bionocular microscope | Wild Heerbrugg, Switzerland | Wild M3 | Equipped with high-intensity illuminator (MI-150; Dolan-Jenner Inc.) |
| Picospritzer | Parker Instruments | Picospritzer III | |
| PC with installed MC Stimulus software | Multi Channel Sys-tems, Germany (software) | ||
| 2-channel stimulator | Multi Channel Sys-tems, Germany | STG-1002 | |
| Stimulation isolation unit | A.M.P.I., Israel | Iso-Flex | |
| Micromanipulator | Narishige, Japan | YOU-1 | |
| Vibratome | Leica, Germany | VT1000S |
References
- Waller, A. Experiments on the sections of glossopharyngeal and hypoglossal nerves of the frog and observations of the alterations produced thereby in the structure of their primitive fibers. Philos. Trans. R. Soc. Lond. 140, 423-429 (1850).
- Fink, R. P., Heimer, L. Two methods for selective silver impregnation of degenerating axons and their synaptic endings in the central nervous system. Brain Res. 4, 369-374 (1967).
- Nauta, W. J. Selective silver impregnation of degenerating axons in the central nervous system. Stain Technol. 27, 175-179 (1952).
- Ramón y Cajal, S. Histologie du système nerveux de l'Homme et des vertébrés. , Maloine, Paris. (1911).
- Kristensson, K., Olsson, Y. Uptake and retrograde transport of peroxidase in hypoglossal neurons. Electron microscopical localization in the neuronal perikaryon. Acta Neuropathol. 19, 1-9 (1971).
- Kristensson, K., Olsson, Y. Retrograde axonal transport of protein. Brain Res. 29, 363-365 (1971).
- Burger, R. M., Cramer, K. S., Pfeiffer, J. D., Rubel, E. W. Avian superior olivary nucleus provides divergent inhibitory input to parallel auditory pathways. J. Comp. Neurol. 481, 6-18 (2005).
- Ford, M. C., Grothe, B., Klug, A. Fenestration of the calyx of Held occurs sequentially along the tonotopic axis, is influenced by afferent activity, and facilitates glutamate clearance. J. Comp. Neurol. 514, 92-106 (2009).
- Glover, J. C., Petursdottir, G., Jansen, J. K. S. Fluorescent dextran amines used as axonal tracers in the nervous system of chicken embryo. J. Neurosci. Methods. 18, 243-254 (1986).
- Trojanowski, J. Q., Gonatas, J. O., Gonatas, N. K. Conjugates of horseradish peroxidase (HRP) with cholera toxin and wheat germ agglutinin are superior to free HRP as orthograde transported markers. Brain Res. 223, 381-385 (1981).
- Trojanowski, J. Q., Gonatas, J. O., Steiber, A., Gonatas, N. K. Horseradish peroxsidase (HRP) conjugates of cholera toxin and lectins are more sensitive retrograde transported markers than free HRP. Brain Res. 231, 33-50 (1982).
- Conte, W. L., Kamishina, H., Corvin, J. V., Reep, R. L. Topography in the projections of lateral posterior thalamus with cingulate and medial agranular cortex in relation to circuitry for directed attention and neglect. Brain Res. 1240, 87-95 (2008).
- Conte, W. L., Kamishina, H., Reep, R. L. Multiple neuroanatomical tract-tracing using fluorescent Alexa Fluor conjugates of cholera toxin subunit B in rats. Nat. Protoc. 4, 1157-1166 (2009).
- Haas, K., Jensen, K., Sin, W. C., Foa, L., Cline, H. T. Targeted electroporation in Xenopus tadpoles in vivo- from single cells to the entire brain. Differentiation. 70, 148-154 (2002).
- Zeilhofer, H. U., et al. Glycinergic neurons expressing enhanced green fluorescent protein in bacterial artificial chromosome transgenic mice. J. Comp. Neurol. 482, 123-141 (2005).
- Poyatos, I., Ponce, J., Aragön, C., Giménez, C., Zafra, F. The glycine transporter GLYT2 is a reliable marker for glycine-immunoreactive neurons. Brain. Res. Mol. Brain Res. 49, 63-67 (1997).
- Gong, S., et al. A gene expression atlas of the central nervous system based on bacterial artificial chromosomes. Nature. 425, 917-925 (2003).
- Heintz, N. Bac to the future: the use of BAC transgenic mice for neuroscience research. Nat. Rev. Neurosci. 2, 861-870 (2001).
- Franklin, K. B. J., Paxinos, G. The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , 3rd ed, Elsevier/Academic Press. New York. (2008).
- Kuwajima, T., Sitko, A. A., Bhansali, P., Jurgens, C., Guido, W., Mason, C. ClearT: a detergent- and solvent-free clearing method for neuronal and non-neuronal tissue. Development. 140, 1364-1368 (2013).
- Wouterlood, F. G., Jorritsma-Byham, B. The anterograde neuroanatomical tracer biotinylated dextran amine: comparison with the tracer PHA-L in preparations for electron microscopy. J. Neurosci. Methods. 48, 75-87 (1993).
- Lanciego, J. L., Wouterlood, F. G. A half century of experimental neuroanatomical tracing. J. Chem. Neuroanat. 42, 157-183 (2011).
- Rodriguez-Contreras, A., Silvio, J., van Hoeve, S., Habets, L. P., Locher, H., Borst, J. G. G. Dynamic development of the calyx of Held synapse. PNAS. 105 (14), 5603-5608 (2008).
- Albrecht, O., Dondzillo, A., Mayer, F., Thompson, J. A., Klug, A. Inhibitory projections from the ventral nucleus of the trapezoid body to the medial nucleus of the trapezoid body in the mouse. Front. Neural Circuits. 8, 83 (2014).
- Benson, D. A., Teas, D. C. Single unit of binaural interaction in the auditory cortex of the chinchilla. Brain Res. 103, 313-338 (1976).
- Koka, K., Jones, H. G., Thornton, J. L., Lupo, J. E., Tollin, D. J. Sound pressure transformations by the head and pinnae of the adult Chinchilla (Chinchilla lanigera). Hear Res. 272 (1-2), 135-147 (2011).
- Ryan, A. Hearing sensitivity of the mongolian gerbil, Meriones unguiculatus. J. Acoust. Soc. Am. 59 (5), 1222-1226 (1976).
- Zwicker, E., Fastl, H. Psychoacoustics Facts and Models. , Springer. (1990).
- Chu, G., Hayakawa, H., Berg, P. Electroporation for the efficient transfection of mammalian cells with DNA. Nucleic Acids Res. 15 (3), 1311-1326 (1987).
- Klenchin, V. A., Sukharev, S. I., Serov, S. M., Chernomordik, L. V., Chizmadzhev, Y. A. Electrically induced DNA uptake by cells is a fast process involving DNA electrophoresis. Biophys J. 60 (4), 804-811 (1991).
- Elias, L., Kriegstein, A. Organotypic Slice Culture of E18 Rat Brains. J. Vis. Exp. (6), e235 (2007).
- Gähwiler, B. H. Organotypic monolayer cultures of nervous tissue. J. Neurosci. Methods. 4 (4), 329-342 (1981).
- Tallini, Y. N., et al. BAC transgenic mice express enhanced green fluorescent protein in central and peripheral cholinergic neurons. Physiol Genomics. 27 (3), 391-397 (2006).
